.01m〇l/L ρΗ7·4)溶液得到。
[0019] 所述的巯基西地那非酶标抗体制备方法如下： (1) 所用的免疫原为采用活泼酯法将巯基西地那非半抗原与载体蛋白共价偶联合成得 到，以免疫原免疫动物，制备西地那非多克隆抗体，最后收集抗血清，用辛酸硫酸铵沉淀纯 化及过亲和层析柱进行纯化得到西地那非多克隆抗体； (2) 采用过碘酸钠法将标记酶与巯基西地那非抗体进行偶联；所用标记酶为辣根过氧 化物酶，原浓度为lmg/mL，辣根过氧化物酶优选使用浓度为0. 01 mol/L (用磷酸盐吐温缓 冲液稀释5000倍)。
[0020] 所述西地那非标准品溶液的浓度为lmg/mL，使用时用0. 01 mol/L PBS缓冲液将标 准品溶液稀释成浓度为〇、〇. 0002、0. 002、0. 02、0. 2、2、20、200 ng/mL的一系列西地那非标 准品溶液。
[0021] 所述化学发光液由A液和B液组成；A液的配制方法为：将对碘苯酚、鲁米诺、Tris 溶于去离子水，用盐酸调pH至8. 2~8. 6得到；优选为调pH至8. 4 ;B液的配制方法为：将 体积分数〇. 40%的H202Tris溶于去离子水，用盐酸调pH至6. 8~7. 2得到；优选为调pH 至7. 0 ;使用时将A液和B液按体积比1 :1的比例混合。
[0022] 所述浓缩洗涤液为含有体积浓度0. 5% TWeen20的pH7. 4,0. 4mol/L的磷酸盐缓冲 液；所述浓缩洗涤液为20倍浓缩洗涤液，使用时用去离子水稀释成1倍洗涤液。
[0023] 优选地，上述免疫检测方法中，式（II)和式(III)所示分子结构的巯基西地那非人 工抗原是由式（I )所示分子结构的巯基西地那非半抗原和载体蛋白偶联得到。
[0024] ( I ) 更优选地，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血蓝蛋白。
[0025] 本发明还提供了上述方法在检测样品中西地那非及其结构类似物中的应用；所述 样品为保健食品或保健药品。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种西地那非及其结构类似物的免疫检测方法，即以巯基西地那非半抗 原制备人工抗原，并制备得到抗体，用于检测西地那非及其结构类似物，该方法克服了现有 检测西地那非技术的缺陷和步骤，对西地那非的最大检测范围为0. 024~1. 21 ng/mL，灵 敏度为〇. 17 ng/mL，检出限为0.008 ng/mL，回收率为86.0~90. 8%，该方法检测快速、大大 缩短了检测时间，不考虑检测人员操作熟练程度的影响，整个检测过程仅仅需要80min左 右即可完成，且检出限更低、灵敏度更高。
【附图说明】
[0027] 图1为巯基西地那非人工抗原紫外全波长扫描图。
[0028] 图2为西地那非标准曲线。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[0030]
【具体实施方式】中所使用试剂的制备方法如下： 包被液：将1. 69g碳酸钠和2. 95g碳酸氢钠溶于1L双蒸水中得到。
[0031] 20倍浓缩洗涤液：包含有体积分数0. 5% Tween20的pH7. 4 0. 4mol/L的磷酸盐缓 冲液，使用时用去离子水稀释成1倍。
[0032] PBS :取5. 8g氯化钠，2. 9g十二水合磷酸氢二钠，0· 2g磷酸二氢钾和0· 2g氯化钾 溶于1L双蒸馏水中得到。
[0033] 封闭液：取0. lg BSA (牛血清白蛋白）、5g甘氨酸、5g蔗糖溶于100mL PBS溶液 (0· 01mol/L ρΗ7· 4)得到。
[0034] 西地那非标准品溶液：用Ν，Ν-二甲基甲酰胺将西地那非标准品稀释成lmg/mL备 用；再用0. 01 mol/L PBS缓冲液将西地那非标准品稀释成浓度分别为0、0. 0002、0. 002、 0. 02、0. 2、2、20、200 ng/mL的西地那非标准品溶液，4°C保存。
[0035] 化学发光液：化学发光液由A液和B液组成，A液为将20mg对碘苯酚、8mg鲁米诺、 1. 21gTris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至8. 2~8. 6得到；B液为将体积分数0. 40% 的H202、1. 21g的Tris溶于100mL去离子水，用盐酸调pH至6. 8~7. 2得到；使用时将A液 和B液按体积比1 :1的比例混合。
[0036] 实施例1半抗原、人工抗原及抗体的制备 1、半抗原的合成 称取巯基西地那非0. 49 g，加入无水碳酸钾0. 5 g，加入3~5ml除水后的DMF，加入 少量碘化钾做催化剂，然后加入0. 18g的溴乙酸甲酯先溶于5~lOmLDMF中，反应半小时 后，用浓盐酸调pH至1，终止反应，旋转蒸干DMF，出现黄色浓稠油状物质，用乙醚和蒸馏水 各l〇mL溶解黄色油状物，用乙醚萃取至少3次取水层，将水层边摇动边滴加强的氢氧化钠 溶液，用浓NaOH滴加至白色沉淀不再增加为止，pH大概在11左右，用二氯甲烷将沉淀溶解 并萃取，萃取至少3次后取二氯甲烷层蒸干，得到具有黏性白色结晶物，取0. lg该白色结晶 物，用THF/H20(3 :2)溶解，加LiOH 0. lg，45°C下水浴搅拌回流反应过夜，50°C旋转蒸干THF 后用盐酸缓慢调节pH至4. 5,用乙酸乙酯反复萃取后将有机层蒸干，用硅胶柱洗脱纯化，蒸 干，得到终产物，呈粉红色结晶颗粒。
[0037] 式I半抗原结构式 2、 人工抗原的合成 称取步骤1制备得到的半抗原0.02 mmol溶于0.4 mL DMF中，边搅拌边加入5.0 mg DCC和3.0 mg NHS，4°C下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液。称取OVA 9 mg或BSA 11.6 mg溶于10 ml 0· lmol/L PBS (ρΗ8·0)中，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐滴 滴入B液中，4°C下反应12h。4°C下用PBS透析3d，每天更换3次透析液，得到全抗原以浓 度为lmg/mL分装于0. 5mL离心管中，冻存于-20°C冰箱中，紫外扫描证实偶联成功，偶联后 的紫外全波长扫描图如图1所示，制备得到两种抗原，结构如式II和式III。
3、 巯基西地那非兔多克隆抗体的制备 采用新西兰大白兔作为免疫动物，以巯基西地那非半抗原与载体蛋白BSA的偶联物为 免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价，心脏采血，经辛酸-硫酸 铵分级沉淀及蛋白A层析柱得到纯化的多克隆抗体。
[0039] 4、酶标巯基西地那非多克隆抗体的制备 将巯基西地那非多克隆抗体与辣根过氧化物酶（HRP)采用过碘酸钠法进行偶联。具体 方法为： (1)溶解5mg的HRP于lmL超纯水中，加入新配置的0. lmol/L过碘酸钠75 μ L，置室温 或4°C冰箱反应20min或30min。
[0040] (2)反应完后装入透析袋，加入0· 001m〇l/L ρΗ4· 0醋酸缓冲溶液，4°C透析过夜，期 间需更换几次透析液(透析液为PBS溶液：称取8.5g NaCl，2.9g Na2HP04*12H20,0.2g KC1， 0. 2g ΚΗ2Ρ04，用去离子水定容至1L)。
[0041] (3)将抗体用0· lmol/L碳酸缓冲液稀释至10mg/mL，另外用0· lmol/L碳酸缓冲液 将活化好的HRP的溶液pH调至9. 5。将0. 5mL抗体加入HRP溶液中，置室温或4°C冰箱反 应2h。
[0042] (4)加入100 μ L的4mg/mL硼氢化钠，4°C冰箱反应2h。
[0043] (5)用0· 01m〇l/L磷酸盐缓冲液（PBS)透析过夜，加入保存液(甘油）_20°C保藏备 用。
[0044] 实施例2直接竞争化学发光酶联免疫检测方法 1、 检测方法包括以下步骤： (1)将式III所示分子结构的巯基西地那非抗原包被在微孔板上，包被抗原用包被液稀 释至41. 67 ng/mL，每孔内加入100 μ L包被液，37°C孵育过夜，倾去孔内液体，洗涤液洗涤2 次，拍干。然后每孔中加入120yL封闭液，37°C孵育3h，倾去孔内液体，置于37°C烘箱中烘 干后。
[0045] (2)用0.01 mol/L