PBS缓冲液将西地那非标准品稀释成浓度分别为0、0.0002、 0· 002、0· 02、0· 2、2、20、200 ng/mL的西地那非标准品溶液。
[0046] (3)取步骤（1)包被好的微孔板，在标准孔加入50 μ L不同浓度的西地那非标准 品溶液，样品孔加入50 μ L待测样品，然后每孔加入50 μ L稀释好的巯基西地那非酶标抗 体，盖上盖板膜在微量振荡器上振摇10 min后，置于37°C孵育40 min。
[0047] (4)吸除板孔中的反应液，各孔加入洗涤液约300 μ L，静置20秒左右，除去其中液 体，如此共洗5次，最后一次将板拍干；也可用自动洗板机洗板5次，洗完后将微孔架倒置在 吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。
[0048] (5)每孔加入100 μ L Α液与Β液等体积混合后的化学发光液，轻拍混匀，盖上盖板 膜，1~2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU，保存数据； 2、 检测结果计算与分析 抑制率（％)=B/BQX100 (%)，式中：B为不同浓度标准品溶液孔(或待测样品孔）的发光 值；B。为0浓度标准品溶液发光值。
[0049] 以抑制率为纵坐标，西地那非标准品溶液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，以 西地那非的发光值代入上述标准曲线中求出待测样品中西地那非的含量。不考虑检测人员 操作熟练程度的影响，整个检测过程仅仅需要80min左右即可完成。检测结果的分析还可 以利用计算机专业软件进行计算与分析。
[0050] 3、标准曲线 通过对标准品溶液的检测结果分析得到西地那非标准曲线图（如图2所示)，表明了 本发明上述方法对西地那非的线性检测范围线性范围为〇. 024~1. 21 ng/mL ;检测限为 0.008 ng/mL，灵敏度为 0.17 ng/mL。
[0051] 实施例3实施例2所述免疫检测方法的应用及精密度、准确度试验 检测方法同实施例2。
[0052] 1、待测样品前处理 对于基质相对简单的口服溶液类样品，前处理方法采用二氯甲烷提取法：准确吸取液 体样品1 mL于50 mL离心管中，添加10 mL二氯甲烧，漩祸震荡5 min，超声10 min，4000 rpm离心5 min后取上清，经无水硫酸钠脱水后，于25 mL梨形瓶中，40°C真空旋转蒸发蒸 干，用lmL甲醇溶液复溶后后稀释10倍，备用。
[0053] 对于基质复杂的胶囊、片剂类样品，胶囊类样品先去除胶囊壳，片剂、丸剂样品去 除糖衣，研细，备用。前处理方法采用液-液分配提取法：准确称取研细的样品1.0 g于50 mL离心管中，添加5 mL pH 5~6盐酸水溶液，漩涡震荡5 min，超声10 min，4000 rpm离 心5 min后取上清，调节pH至9,添加二氯甲烧10 mL萃取，漩祸震荡5 min，超声10 min， 4000 rpm离心5 min，反复萃取三次，合并有机层，经无水硫酸钠脱水后，于50 mL梨形瓶中， 40 °C真空旋转蒸发蒸干，用1 mL甲醇溶液复溶后后稀释20倍，备用。
[0054] 2、添加回收实验 本发明以西地那非为例进行样品添加回收实验。选择口服溶液、片剂、胶囊三种比较经 常被违法添加西地那非等的保健食品样品，添加量如表2所示，添加高、中、低三个水平，添 加量在dcCLEIA线性范围内。口服溶液用甲醇提取法处理，片剂、胶囊样品经液-液分配提 取法处理后，直接用dcCLEIA每个样品测定三次，取平均值，结果如表1所示。
由表1可知，本发明对保健食品中西地那非的最低回收率为82%，最高回收率为114%， 平均回收率在88. 7~105%之间；最低变异系数为7. 9%，最高变异系数为11. 5%，平均变异 系数在8. 9~10. 7%之间。以上结果说明本发明所提供的检测方法具有良好的重复性和准 确性。
[0056] 实施例4交叉反应 通过对西地那非的结构类似物瓦地那非、蒙莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那 非、伪瓦地那非、去甲西地那非、异丙氧基硫代艾地那非、羟基豪莫西地那非、羟基巯基蒙莫 西地那非、羟基硫代瓦地那非、去乙基瓦地那非、乌地那非、巯基蒙莫西地那非、乌地那非、 巯基西地那非、巯基蒙莫西地那非等进行交叉反应率的测定，具体操作同标准曲线的绘制。 交叉反应率计算公式为： 交叉反应率（％) =IC5。半抗原/IC 5。竞争物*100% 交叉反应结果表2所示：
由表2可知，本发明对西地那非及其类似物均有一定的交叉，所以本发明适合于保健 食品中西地那非及其类似物的广谱性检测。
[0057] 对比例1 1、半抗原、人工抗原及抗体的制备 实验方法同实施例1，唯一不同的是，所用的原料为西地那非，制备得到的半抗原为式 4所示，人工抗原如式5和式6所示。
[0058] 再利用式5所示人工抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体(方法同实施例1); 再利用制备得到的多克隆抗体与HRP结合制备得到酶标抗体。
[0059] 2、免疫检测方法 将式6所示结构作为包被原，免疫检测方法同实施例2,酶标抗体为本对比例制备得到 的酶标抗体，结果表明：利用本对比例的免疫检测方法对西地那非的线性检测范围线性范 围为0. 6~8. 2ng/mL ;检测限为0. 054ng/mL，灵敏度为1. 56ng/mL。
【主权项】
1. 式（I )所示结构的物质在检测西地那非及其结构类似物中的应用；所述西地那非的 结构类似物为瓦地那非、巯基西地那非、蒙莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、去甲 西地那非、异丙氧基硫代艾地那非、羟基豪莫西地那非、羟基巯基蒙莫西地那非、羟基硫代 瓦地那非、去乙基瓦地那非、乌地那非、巯基蒙莫西地那非；所述式（I )结构如下：2. 式（I )所示结构的物质在制备检测西地那非及其结构类似物的制剂中的应用；所述 西地那非的结构类似物为瓦地那非、巯基西地那非、蒙莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾 地那非、去甲西地那非、异丙氧基硫代艾地那非、羟基豪莫西地那非、羟基巯基蒙莫西地那 非、羟基硫代瓦地那非、去乙基瓦地那非、乌地那非、巯基蒙莫西地那非；所述式（I )结构如 下： (I )。3. 权利要求1或2所述式（I )结构的物质的制备方法，其特征在于，是按质量比1 : 0. 8~1. 2将巯基西地那非及无水碳酸钾置于反应器中，用无水DMF溶解，然后加入与巯基 西地那非摩尔比1 :1~1. 4的溴乙酸甲酯反应30~40min后，终止反应，旋转蒸干DMF，用 乙醚和蒸馏水（1: 1，v/V)溶解残渣，萃取后即得。4. 一种检测检测西地那非及其结构类似物的免疫检测方法，其特征在于，包括以下步 骤：51. 将具有式（II)所示分子结构的巯基西地那非人工抗原作为免疫原免疫动物制备 巯基西地那非抗体，并与标记酶结合制备得到酶标抗体；52. 将具有式(III)所示分子结构的巯基西地那非人工抗原作为包被原包被在微孔板 上；采用直接竞争化学发光酶联免疫法测定样品中西地那非及其结构类似物的含量；5. 根据权利要求4所述的免疫检测方法，其特征在于，式（II)和式(III)所示分子结构 的巯基西地那非人工抗原是由式（I )所示分子结构的巯基西地那非半抗原和载体蛋白偶 联得到；式（I )结构为6. 根据权利要求5所述的免疫检测方法，其特征在于，所述载体蛋白选自牛血清白蛋 白、鸡卵清白蛋白或人血蓝蛋白。7. 权利要求4至6任一项所述方法在检测样品中西地那非及其结构类似物中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述样品为保健食品或保健药品。
【专利摘要】本发明属于免疫检测技术领域，公开了一种西地那非及其结构类似物的免疫检测方法，即以巯基西地那非半抗原制备人工抗原，再制备得到抗体，并用于检测西地那非及其结构类似物，该方法克服了现有检测西地那非技术的缺陷和步骤，对西地那非的最大检测范围为0.024～1.21ng/mL，灵敏度为0.17ng/mL，检出限为0.008ng/mL，回收率为86.0～90.8%，该方法检测快速、大大缩短了检测时间，不考虑检测人员操作熟练程度的影响，整个检测过程仅仅需要80min左右即可完成，且检出限更低、灵敏度更高。
【IPC分类】G01N33/53, G01N33/02
【公开号】CN105353095
【申请号】CN201510782599
【发明人】沈玉栋, 邓丽华, 朱彬, 杨金易, 李瑞婷, 徐振林, 王弘, 雷红涛, 孙远明
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月16日