白上的铜(非-CP铜）的值。
[0029] 图10.描述了依据现有技术的参考测试(计算铜)或依据根据本发明的方法(C4D) 测定的在健康受试者、轻度认知功能障碍(MCI)受试者和阿尔茨海默氏病(AD)受试者中的 非-CP铜的置信区间(95%)。
[0030]图11.描述了通过使用根据现有技术的参考测试(计算铜)或依据根据本发明的方 法(C4D)测定的非-CP铜浓度的值得到的R0C曲线。
【具体实施方式】
[0031] 如前所述，本发明涉及一种用于在体外测定血清样品中游离铜的浓度的方法。在 本说明书中，术语"游离铜"指的是一般循环中的铜，该铜在结构上未结合到铜蓝蛋白上。 "游离铜"最近也被命名为"不稳定的"铜，指的是其不稳定地结合到白蛋白、小分子肽、氨基 酸和其他微营养素上的性质，且在它们之间容易交换。游离铜是一种小分子量的铜，能够穿 过血脑屏障，很容易地到达大脑组织。
[0032] 为了从血清样品的血蛋白中分离游离铜，该方法包括固相萃取(SPE)色谱法的第 一步骤(a)。血清样品可以根据本领域技术人员已知的方法(例如离心法)从全血中获得。血 清在进行分离之前可以被适当的稀释，优选根据1和10之间的稀释因子进行稀释。血清可 以，例如在生理溶液(0.9%NaCl)中被稀释，该生理溶液也可以用作色谱法的流动相。
[0033] 血清样品被装载（接种）在固定相（可以结合血蛋白的树脂）上，通常在小色谱柱 (例如200mg、300mg、400mg、500mg、600mg色谱柱）中。存在于血清样品中的血蛋白，包括铜蓝 蛋白在内被固相吸收，然而从固相中洗脱出的包括铜的级分被收集并经过该方法的第二步 骤b)。因此，在本说明书中，"洗脱级分"是指没有被用于固相萃取色谱法（固相上的色谱萃 取)中的树脂所吸收的级分。
[0034] 样品可以通过懦动栗被装载在固相上，该懦动栗具有例如在100μΙ/min和lml/ml 之间的流速，比如200yl/min、300yl/min、400yl/min、500yl/min。
[0035] 在步骤a)中，聚烯烃，优选选自例如聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚甲基戊烯(PMP)、 聚丁烯-UPB-19)的热塑性聚烯烃可以被用作固相。所述固相可以具有例如在35%和75% 之间的结晶度。
[0036] 根据本发明的一个实施方式，超尚分子量聚乙稀（即原子量在3MDa和6MDa之间）的 树脂，比如Sigma-Aldrich市售的批号#434264_1KG(超高分子量聚乙烯(UHMPE)和任何其他 等效的商业树脂），将被使用作为固相。因此，整个步骤a)非常快且容易实现自动化;而且该 固相一旦用合适的溶剂(例如像甲醇)再生，可以再用于其他分离，具有经济优势。
[0037]该方法包括用香豆素荧光探针测定在步骤a)中洗脱出的级分中的铜的第二步骤 b)。香豆素荧光探针是螯合荧光探针，当其结合[Cu++]时，荧光发射的衰减可以被记录。香豆 素荧光探针可以选自例如具有以下结构通式的化合物：
[0039] 其中
[0040] R1 为N [ (CH2) nCH3 ] 2，其中 η为0 到 5;
[0041] R2 为!1、卩、(：1、8广勵2、0〇13、环己基。
[0042] 根据本发明的另一个实施方式，所述香豆素荧光探针选自上述组，其中R1为η=1 的N[(CH2)nCH 3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的!1^、(：1、8^勵2、0〇1 3、环己基。
[0043] 根据本发明的另一个实施方式，所述香豆素荧光探针选自上述组，其中R1为n = 2 的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的!1^、(：1、8^勵 2、0〇13、环己基。
[0044] 根据本发明的另一个实施方式，所述香豆素荧光探针选自上述组，其中R1为n = 3 的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的!1^、(：1、8^勵 2、0〇13、环己基。
[0045] 根据本发明的另一个实施方式，所述香豆素荧光探针选自上述组，其中R1为n = 4 的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的!1^、(：1、8^勵 2、0〇13、环己基。
[0046] 根据本发明的另一个实施方式，所述香豆素荧光探针选自上述组，其中R1为n = 5 的N[(CH2)nCH3]2,且R2为位于邻位、对位或间位的!1^、(：1、8^勵 2、0〇13、环己基。
[0047]根据本发明的另一个实施方式，所述香豆素荧光探针为具有以下结构式的7_(二 乙氨基)-2-氧代-N-((吡啶-2-基）甲基)-2H-色烯-3-甲酰胺：
[0049]该香豆素荧光探针可用于例如有机溶剂(如乙醇、甲醇、DMS0)中，有机溶剂与缓冲 溶液(如磷酸盐缓冲液(PBS)或羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes))混合。在一个实施方式中，该香 豆素荧光探针被用于HEPES: DMS0的溶液中。
[0050] 该香豆素荧光探针将被用于与样品的反应中，优选浓度范围在0. ΙμΜ和ΙΟμΜ之间， 例如ΙμΜ、2.5μΜ、5 . ΟμΜ、9μΜ。本发明人发现，在这个范围内，游离铜的浓度和荧光发射之间 存在直接相关性，激发波长(Aex)为例如430nm和吸收波长(A em)为490nm。
[0051] 为了测定游离铜的浓度，步骤b)可包括制备校正曲线的进一步的步骤。为了制备 校正曲线，可以使用已知浓度的铜的多个等分部分。优选地，这个曲线将在0. ΙμΜ和ΙΟμΜ之 间的范围内（见图1)。
[0052]正如先前在受阿尔茨海默氏症影响的患者中所报道的，未结合到铜蓝蛋白上的血 清铜（"游离"铜）出现升高，这种增加虽然轻微，但通常足以将阿尔茨海默氏病受试者与健 康老年受试者(也在疾病的早期阶段)区分开。
[0053]因此，本发明的一个目的是一种用于在体外在疑似患有阿尔茨海默氏病的患者中 诊断阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括将在步骤b)中测定的值与阈值(截止值)进行比较 的进一步的步骤c)，其中较高浓度的游离铜确认阿尔茨海默氏病的临床诊断。
[0054] "用于在体外诊断阿尔茨海默氏病的方法"的表达是指一种用于在疑似患有阿尔 茨海默氏病的患者中确认阿尔茨海默氏病的临床诊断的方法。
[0055]显然，如果血清被装载在色谱上之前已经在与阈值进行比较的步骤c)中根据某一 稀释因子被稀释，那么在步骤b)中测定的游离铜浓度将必须乘以稀释因子。
[0056]铜的阈值(截止值)可以通过例如R0C(受试者工作特征）曲线来测定，该曲线通过 处理健康个体和患有阿尔茨海默氏病的个体的一组样品（统计上显著的）的浓度获得。通过 这样的处理得到的阈值在〇 . 5μπ?和50μπ?之间，优选地在0.5μπ?和3μπ?之间，例如ΙμL?、1.5μL?、2μ m、2 · 5μπι、3μπι〇
[0057]优选地所述诊断方法将被用作在疑似患有阿尔茨海默氏病的患者中进行阿尔茨 海默氏病的临床诊断的确认测试，阿尔茨海默氏病伴随"铜表型功能障碍"。
[0058] 如Squitti等人，Neurology (2009)所示，为了监测患者的阿尔茨海默氏病的预后 以及预测从轻度认知功能障碍向阿尔茨海默氏病的转化，测定所述患者的血清中游离铜的 浓度是重要的（图5)。
[0059]轻度认知功能障碍的临床症状的特征在于记忆障碍、通过客观措施可验证、尚未 准予痴呆的界定。准确诊断的重要性在于，尽管症状温和，但轻度认知功能障碍通常被认为 是阿尔茨海默氏病的前兆。这是由于从轻度认知功能障碍进展为阿尔茨海默氏病的高统计 率。
[0060]通常，从健康状态到阿尔茨海默氏病的年转化率在从0.17 %到3.86 %的范围内。 从轻度认知功能障碍到阿尔茨海默氏病的转化率非常高，在从6 %到40 %的范围内。在一些 情况下，轻度认知功能障碍可能是