min，柱温 设置为38、40和42°C。只有一个因素改变而其他参数保持恒定，使样品在各种条件下进行分 析。所有关键分离均实现了与指定的最低基线分离。此外，样品在任何上述条件下分离度均 符合要求，这表明该方法在测定范围内具有良好的耐用性。
[0073] 3.3.样品分析
[0074] 用上述已验证的RRLC法对4个忍冬物种和6批商业金银花药材和1批忍冬叶的生物 活性化合物进行定性分析。通过比较相同条件下洗脱的对照品和加入对照品的样品各色谱 峰的保留时间，进一步证实了所有研究的化合物的色谱峰。相应的RRLC色谱图如图3~13所 示（0~5.5min UV检测；5.5~8min ELSD检测）。
[0075] RRLC色谱图结果表明，可以通过6分钟出峰的皂苷部分将具有显著差异的金银花 和山银花区分开来。忍冬叶中的木犀草苷含量明显高于金银花。结果还表明，通过ELSD检测 这些金银花样品中的皂苷类化合物，可知这些来自湖北、贵州、山西、湖南等不同的省份的 商业金银花药材，并不像供应商所说的已鉴定为正品金银花。具体而言，这6个商业样品中， 来自湖南的两个样本实际上是灰毡毛忍冬，它是山银花的主要品种之一。
[0076] 4.结论
[0077 ]金银花和山银花具有不同的外观和化学成分，但其药材特性和适应症类似。其中， 金银花被广泛添加到复方药物、食品、饮料等相关产品中。并且它具有显著的抗菌、抗炎、抗 病毒等生物活性。由于二者价格差距较大，在目前的市场上山银花作为金银花的主要代替 品，广泛用于金银花产品的掺假。在本研究中，我们已经成功地建立了一个RRLC方法来控制 金银花产品及金银花原料的质量。这种RRLC方法能够在8分钟内同时分析4种生物化合物， 如绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙。此外，这种方法得到了充分验证， 具有良好的精密度、可重复性和准确性。
【附图说明】
[0078]图1:绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙等活性成分的化学结 构；
[0079] 图2:为"2.3 .实验仪器和色谱条件"项下色谱条件进样分析的混合对照品溶液的 RRLC色谱图（绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙）；
[0080] 图3:金银花RRLC色谱图（湖南）；
[0081 ] 图4:忍冬叶RRLC色谱图（湖南）；
[0082] 图5:华南忍冬RRLC色谱图（湖南）；
[0083]图6:黄褐毛忍冬RRLC色谱图（湖南）；
[0084] 图7:灰毡毛忍冬RRLC色谱图（重庆）；
[0085] 图8:金银花RRLC色谱图（河南）；
[0086]图9:金银花RRLC色谱图（湖北）；
[0087]图10:金银花RRLC色谱图（贵州）；
[0088] 图11:金银花RRLC色谱图（山西）；
[0089] 图12:灰毡毛忍冬RRLC色谱图（湖南）；
[0090] 图13:灰毡毛忍冬RRLC色谱图（湖南）；
[0091]图14:为金银花与山银花标准品溶液RRLC色谱图，色谱图中1为绿原酸，2为木犀草 苷，3为灰毡毛忍冬皂苷乙，4为川续断皂苷乙；
[0092] 图15:图15色谱图与图14标准品色谱图比较可知6.021min和6.341min处有两个色 谱峰3、4,可判断样品为山银花；
[0093]图16:图16色谱图与图14标准品色谱图比较可知2.295min处色谱峰1为主成分， 6min处无特征色谱峰，可判断样品为金银花。
【具体实施方式】
[0094] 实施例1金银花与山银花的鉴定检测
[0095] 1.制备待测样品溶液:取待测样品5g，用研钵磨成细粉(过2号筛），取细粉0.10g， 精密称定，然后加70%甲醇水溶液10ml，并在37°C超声处理15min。超声处理后，放冷至室 温，用70%的甲醇水溶液调整至10ml。在进样之前，待测样品溶液用0.20μπι的滤膜过滤，取 lul进样，记录色谱。
[0096] 2.色谱条件:色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Luna C18-HST(2)柱(2.5 μπι，100mmX 3 · 0mm));以0 · 1 %甲酸水溶液为流动相A，以含0 · 1 %甲酸的乙腈溶液为流动相 B，柱温为40°C ;流速为1.0ml/min;进样量为ΙμL;采用梯度洗脱，见表1;检测波长为327nm(0 ~3min)、350nm(3~5min)，阜苷类化合物(5~8min)用蒸发光散射检测器检测。将所得色谱 图与金银花及山银花指纹图谱比较，主峰即为绿原酸，其余成分一一对应，可对药材进行鉴 另IJ，见图14、图15、图16。
[0097]表1梯度洗脱
[0098]
[0099] 3.结果
[0100] 本RRLC方法用于鉴定待测样品是金银花还是山银花：
[0101] 见图 14、图 15、图 16。
[0102]图14色谱图为金银花与山银花标准品溶液RRLC色谱图，色谱图14中1为绿原酸，2 为木犀草苷，3为灰毡毛忍冬皂苷乙，4为川续断皂苷乙；图15色谱图与图14标准品色谱图比 较可知6.021min和6.341min处有两个色谱峰3、4,可判断样品为山银花。图16色谱图与图14 标准品色谱图比较可知2.295min处色谱峰1为主成分，6min处无特征色谱峰，可判断样品为 金银花。
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【主权项】
1. 一种快速高分离度液相色谱检测金银花和山银花药材的方法，其特征在于，色谱柱 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1 %甲酸水溶液为流动相A，以含0.1 %甲酸的乙腈 溶液为流动相B对待检药材样品检测。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱条件为：柱温为40°C，流速为1.0ml/ min，进样量为ΙμL，按下表进行梯度洗脱：检测波长为327nm(0~3min)、350nm(3~5min)，用蒸发光散射检测器检测阜苷类化合 物(5~8min)〇3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括制备待测样品溶液、色谱 检测、结果判断三个步骤，各步骤的具体方法是： 步骤一、制备待测样品溶液:取待测样品，用研钵磨成细粉，取细粉0.10g，精密称定，然 后加70 %甲醇水溶液10ml，并在37 °C超声处理15min，超声处理后，放冷至室温，用70 %的甲 醇水溶液调整至l〇ml，制得待测样品溶液； 步骤二、色谱检测：取待测样品溶液用0.20μπι的滤膜过滤，取ΙμL进样，记录色谱，色谱 条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Luna Cl8-HST(2)柱（2.5μπι，100mm X 3.0mm));以0.1 %甲酸水溶液为流动相A，以含0.1 %甲酸的乙腈溶液为流动相B，柱温为40 °C ;流速为1 .Oml/min;进样量为ΙμL;按下表进行梯度洗脱：检测波长为327nm(0~3min)、350nm(3~5min)，用蒸发光散射检测器检测阜苷类化合 物(5~8min); 步骤三、结果判断：将所得色谱图与金银花及山银花指纹图谱比较，主峰即为绿原酸， 金银花及山银花都有此主峰，6min处出现两个色谱峰即判断样品为山银花;6min处无特征 色谱峰即判断样品为金银花。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤三中所述的6min处出现两个色谱 峰即判断样品为山银花的具体判断方法是:6.021min和6.341min处有两个色谱峰即判断样 品为山银花。5. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤三中所述的主峰为2.295min处的 色谱峰。6. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤三中所述的6min处出现两个色谱 峰分别为灰毡毛忍冬皂苷乙峰和川续断皂苷乙峰。7. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，6.021min和6.341min处的两个色谱峰 分别为灰毡毛忍冬皂苷乙峰和川续断皂苷乙峰。
【专利摘要】本发明提供了一种利用快速高分离度液相色谱(RRLC)检测金银花和山银花药材的方法。金银花具有显著的抗菌、抗炎、抗病毒等生物活性，被广泛添加到复方药物、食品、饮料等相关产品中。由于金银花和山银花的价格差距较大，市场上存在将山银花作为金银花的主要代替品用于金银花产品的掺假。本发明方法能够在8分钟内同时分析出金银花和山银花所含的绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙等4种化合物，可用于鉴定金银花和山银花药材，以监控金银花原料及产品的质量，具有良好的精密度、可重复性和准确性。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105606734
【申请号】CN201610046279
【发明人】尹春萍, 马元春
【申请人】华中科技大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月22日