对样本成像的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对样本成像的方法。
【背景技术】
[0002] 根据跟踪样本中的单个分子的运动的已知方法，利用光来激发分子以发射光子， 并且利用对样本成像的二维检测器来检测由分子发射的光子。继而根据由检测器检测的光 子的空间分布来确定分子的当前位置。在检测器的像素密度适当的情况下，可以根据处于 超过衍射极限的空间分辨率或精度的光子的空间分布来确定分子的当前位置。然而，跟踪 处于超过衍射极限的空间精度的微粒的前提是，对于分子的每个位置(即，在分子改变其位 置之前)都检测到大量的光子。这是由于较大数量的光子提高了在确定分子的位置中所实 现的空间精度的事实，只要在分子发射较大数量的光子的整个时间段内这个位置保持不 变。
[0003] 由以分子的位置为中心的圆的半径Ar给出空间精度，该位置是根据二维检测器 检测到的由分子发射的光子所在的位置的分布的强度的中心来确定的。分子的真实位置位 于这个圆内。半径A r由下式给出：
[0004] Ar=FWHM/N1/2 (1)
[0005] 并且半径△ r取决于检测到的光子的数量N以及衍射图样的半最大值全宽度FWHM。
[0006] 由于跟踪单个分子的运动的已知方法针对样本中的分子的每个位置都需要庞大 数量N的光子，所以分子严重受压(stressed)，这会导致使分子漂白的风险增加。在漂白的 过程中，分子发生化学变化从而在漂白之后分子不再提供光子。除光化学漂白之外，还有可 能的是已经被强烈地和/或大量地激发以发射光子的分子转换至亚稳的暗状态中。在一段 时间之后，分子可以从亚稳的暗状态返回。然而，在亚稳的暗状态下，分子不会发射用于连 续跟踪分子所需的任何光子。
[0007] 因此，仅存在一些分子（即，仅一些所谓的荧光染料或荧光团）适于在已知的方法 中使用。许多荧光团漂白得太快，因而不能在延长的时间段或样本内所覆盖的较长距离内 跟踪荧光团的运动或者用荧光团标记的分子的运动。
[0008] 在上述方法中，根据二维检测器检测到的由分子发射的光子的所在位置的分布来 确定分子的位置。这个方法称为定位。用于在确定光子发射型分子的空间位置方面实现高 分辨率或精度的另一种方法是所谓的STED或RES0LFT荧光显微法。此处，有效地激发样本中 的分子以发射光子的空间区域被减小到小于衍射极限的尺寸。因此，从样本发射的光子可 以归因于尺寸减小的这一特定空间区域，而与检测到光子的位置无关并且与检测到的光子 的数量无关。在实践中，有效地激发分子以发射光子的空间区域的减小是通过应用经聚焦 的激发光束来实现的，该经聚焦的激发光束与荧光抑制光的一个或多个相干光束的干涉图 样叠加。这个干涉图样包括位于激发光束的聚焦区中的基本上零强度的点。对于高绝对强 度的荧光抑制光的光束，荧光抑制光的强度在除基本上零强度的点以外的任何地方都超过 了饱和强度Is，从而借助于样本中的分子的光子的发射在除基本上零强度的点以外的基本 上任何地方都得到抑制。所实现的空间分辨率或精度由下式给出：
[0009] ΔΓ = λ/(η sina(l+I/Is)1/2) (2)
[0010]其中，I是样本中干涉图样的最大强度。
[0011] 在STED荧光显微法中，对荧光的抑制通过受激发射来实现。在RES0LFT荧光显微法 的情况下，对荧光的抑制通过将分子暂时地转换到分子不能够发荧光的构象或其它类型的 状态中来实现。由于在STED荧光显微法中需要荧光抑制光的高绝对强度，所以漂白荧光团 的风险是相对高的。对于RES0LFT荧光显微法，相对低强度的荧光抑制光是足够的。然而，这 个方法仅可以适用于特殊的荧光团，该特殊的荧光团可以切换到荧光团不能够发荧光的构 象或其它类型的状态中。
[0012] 一般而言，像STED或RES0LFT荧光显微法这样的方法适用于跟踪样本中微粒的运 动，因为微粒是以空间上尺寸减小的区域来进行跟踪的，其中，在该区域中有效地激发微粒 以发射荧光。在这种情况下，微粒位于空间上尺寸减小的区域中的标准将会是，由所跟踪的 微粒发射的光子的最大速率(rate)。尽管与微粒的连续定位相比根据这个方法进行跟踪需 要较少的光子，但微粒和适用于在较长距离内对运动进行跟踪的标记物的数量不会显著增 加。此外，在STED和RES0LFT荧光显微法中，必须施加不同的光束，以提供激发光和用于抑制 荧光的光。通常，这需要额外的工作，因为不同的光束具有不同的波长并且不同的光束必须 在空间上仔细地对齐。
[0013] 根据DE 25 46 952 Al，已知基于所谓的衰减全反射的光学系统可以应用于跟踪 样本中的微粒的运动。根据DE 25 46 952 Al，样本受到驱使微粒发射光子的光的照射。由 于照射样本的光的强度分布并不均匀而且经空间调制，所以微粒的运动导致所发射的光子 的数量的相应波动。因此，考虑到对强度分布的调制，可以根据检测到的所发射的光子的波 动（即，对检测器信号的调制)来总结出微粒的运动。然而，无法跟踪沿光强度恒定的路径运 动的微粒的运动。此外，完全无法跟踪在其运动期间从未受到或者很少受到光的照射的微 粒。因此，对于利用从DE 25 46 952 Al获知的光学系统来跟踪样本中微粒的运动而言，使 微粒频繁地受到光的照射是必要的。所以，漂白微粒或标记微粒的标记物的风险不能被有 效地消除而必须被接受。
[0014] 根据WO 2013/072273 Al已知一种包括有独立权利要求1的前序部分的特征的跟 踪样本中单个分子的运动的方法。
[0015] 需要一种基于在样本中运动的微粒对样本成像的方法。
【发明内容】
[0016] 当前发明涉及一种对样本成像的方法。所述方法包括以下步骤：（i)提供第一组分 的光；（? )从由在受到第一组分的光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组中选择微 粒；（m)形成第一组分的光以提供包括空间受限最小值的光强度分布；（iv)将光强度分布 施加到样本上，以使得微粒位于光强度分布的空间受限最小值中；（V )检测由微粒发射的 光子;利用光强度分布的最小值来跟踪微粒的运动，通过：（Vi)相对于样本移动光强度分布 以使得由微粒发射的光子的速率保持最小，以及(Vii)将样本中光强度分布的最小值的实际 位置作为样本中微粒的实际位置；（Vi)针对样本的多个部分中的每个部分，确定微粒的驻 留时间；以及（k)对样本上的驻留时间的分布进行绘图。
[0017] 本公开内容的有利的进一步发展归因于权利要求书、说明书以及附图。在本说明 书中提及的特征和多个特征的组合的优点仅用作示例，并且可以在不需要根据本公开内容 的实施例必须实现这些优点的情况下替代地或累积地使用。在不改变由所附权利要求书限 定的保护范围的情况下，就原申请的公开内容和本专利而言以下适用：从附图尤其是从所 例示的设计和多个部件相对于彼此的尺寸以及从它们的相对布置和它们的作用连接，可以 得知其它特征。本公开内容的不同实施例的特征或者不同权利要求的特征的组合在偏离权 利要求的所选择的引用关系的情况下也是可行的，在此被建议。这也涉及在单独附图中所 例示的特征或在描述它们时所提及的特征。这些特征也可以与不同权利要求的特征结合。 此外，本公开内容的其它实施例可能不具有在权利要求中所提及的所有特征。它们甚至可 以不具有在独立权利要求中所提及的所有特征。
【附图说明】
[0018] 在下文中，参考附图中所例示的优选示例性实施例对本公开内容进行了进一步的 解释和描述。
[0019] 图1例示了用于执行根据本公开内容的方法的实施例的根据本公开内容的装置的 示例性实施例，所述装置包括一个光源、点检测器以及照相机。
[0020]图2示出了用于执行根据本公开内容的方法的另一个实施例的根据本公开内容的 装置的另一个示例性实施例，所述装置包括一个光源和照相机。
[0021] 图3示出了在用于驱使微粒发射光子的强度分布的最小值的区域中的微粒。
[0022] 图4示出了沿着线轮廓的取决于位置的根据图3的强度分布的强度;还示出了由根 据图3的微粒发射的光子的产生速率。
[0023] 图5示出了在微粒运动到其根据图3的位置之外后的情形。
[0024] 图6示出了在强度分布跟随微粒的运动之后的情形。
[0025] 图7示出了用于执行根据本公开内容的方法的另一个实施例的根据本公开内容的 装置的另一个示例性实施例，所述装置包括一个光源和三个邻近的点检测器，所述光源包 括白光的光源和选择器。
[0026] 图8示出了用于执行根据本公开内容的方法的又一个实施例的根据本公开内容的 装置的又一个示例性实施例，所述装置包括两个光源和四个邻近的点检测器。
[0027] 图9示出了在穿过焦平面的X截面中的光强度分布以及包含光强度分布的关断信 号强度分布，以及
[0028] 图10示出了由根据图9的强度分布而产生的有效点扩散函数hrff。
【具体实施方式】
[0029] 根据本发明跟踪其在样本中的运动的微粒，可以是单个分子、一起运动的一组分 子、复合体、量子点、反射金微粒等等。
[0030]在受到光的照射时引起微粒对光子的发射的过程可以是荧光发射。然而，许多其 它过程也可以用作发射光子的基本原理，例如光的散射。
[0031]引起光子的发射的相应过程可以与被跟踪的微粒本身的性质有关，或与使得微粒 被跟踪的标记物(尤其是染料)有关。
[0032]在根据本发明的方法中，被施加到样本的光强度分布的特征为空间受限最小值。 如同在STED或RES0LFT荧光显微法中使用荧光抑制光的情况下，这个强度分布可以由一束 或多束相干光束的干涉图样形成，其中，空间受限最小值是干涉图样的基本上零强度的点。 因此，最小值可以具有小空间尺