寸。具体而言，最小值的空间尺寸可以小于衍射极限。
[0033] 然而，与STED和RES0LFT荧光显微法相比，呈现这种特定强度分布的光并非用于抑 制荧光。相反，其用于驱使所跟踪的微粒发射作为测量信号被检测到的光子。此外，不利用 强度分布的最小值对样本进行扫描，但是强度分布仅相对于样本连续地移动，以使得由微 粒发射并接下来被检测到的光子的速率最小化。光子的最小化速率或最小速率表示微粒还 位于光强度分布的最小值的位置处。反之亦然，光子的增大的速率表示微粒趋向于离开光 强度分布的最小值;并且必须对最小值的位置进行重新调整以跟踪微粒的运动。
[0034] 在本发明的方法中，光子或光子的检测的位置并非用于确定样本中微粒的实际位 置。因此，不需要针对样本中微粒的每个位置都获得大量的光子，来以高精度确定相应的位 置。而是将样本中光强度分布的最小值的实际位置作为样本中微粒的实际位置。
[0035] 在适当的条件下，可以以比衍射极限低得多的空间精度对微粒的运动进行跟踪。 除最小值的小尺寸和在移动光强度分布方面的高精度以外，这些适当的条件包括最小值以 外的光的强度足够急剧的增大，以及响应于增大的光子速率的对最小值的位置的足够快的 重新调整。
[0036] 由于在根据本发明的方法中不需要微粒发射很多光子，所以使微粒漂白的风险大 大降低。所以，甚至可以在较长的时间段内或者在样本中由微粒所覆盖的较长距离内跟踪 易于漂白的微粒。此外，与基于STED或RES0LFT荧光显微法的方法相比，样本仅受到了包括 有最小值的强度分布的照射。因此，光不需要与另一束光对齐，无论是空间上还是针对其波 长。因为如此，用于应用根据本发明的方法的光学设备比STED或RES0LFT荧光显微镜的光学 设备简单得多。
[0037]还存在与STED和RES0LFT荧光显微法的另一个不同之处:在根据本发明的方法中， 具有最小值的光强度分布仅需要具有小的绝对强度，如果光已经以低强度引起光子的发 射。特别地，不需要在零点以外实现激发光子的发射的饱和，以便于实现低于衍射极限的空 间精度。相反，在许多情况下，优选的是随着到零点的距离的增大该激发连续地增加。最后 但同样重要的是，本发明的一个特征是使由所跟踪的微粒发射的光子的数量最小化并且因 此使其漂白的风险最小化。
[0038]相对于（即，相对)样本移动或偏转强度分布以使由检测器检测的光子的速率连续 地最小化可以基于试错方法，即采用小步长试验性地移动强度分布。如果移动导致检测到 的光子的速率(与所发射的光子的速率类似)降低，那么将沿着相同的方向进一步移动强度 分布。在相反的情况下，即如果移动导致检测到的光子的速率增加，那么沿着另一方向（例 如，相反的方向）移动移动强度分布。各种适当的算法和实施例(例如，由关键词"跟踪算法" 以及"模糊逻辑"指示的这些)对于本领域技术人员而言是已知的。
[0039] 根据STED或RES0LFT荧光显微法，已知用于形成包括有最小值的荧光抑制光的光 强度分布的各种技术，例如参见Klar等人的PNAS 97(2000)、Westphal等人的 Phys .Rev.Lett .94(2005)以及Donnert等人的PNAS 103(2003)，这些参考文献的公开内容 以全文引用的方式并入本文中。这些技术中的任何技术也可以用在根据本发明的方法中， 该方法用于形成驱使所跟踪的微粒来发射光子的光的光强度分布。仅给出一些示例，可以 采用相位滤波器、空间光调制器、使用对置透镜的4pi布置等，以形成包括有最小值的光强 度分布。
[0040] 为了相对于样本移动或偏转具有最小值的光强度分布，同样根据STED和RES0LFT 焚光显微法获知可以应用扫描仪。例如，这种扫描仪包括声光或电光偏转器、旋转镜、通过 其相对于光束对样本进行调整的压电致动器，或者致动物镜并且通过其相对于样本对光束 进行调整的压电致动器。
[0041] 对于使光强度分布偏转，替代地或另外地，相对于样本移动具有最小值的光强度 分布也可以通过相对于具有最小值的特征的光强度分布移动样本来完成。相对于样本移动 具有最小值的光强度分布仅需要在具有最小值的光强度分布与样本之间的相对移动。具体 而言，相对于样本沿X方向和y方向移动具有最小值的光强度分布可以通过使光强度分布偏 转来实现，并且相对于样本沿z方向移动具有最小值的光强度分布可以通过移动样本来实 现。z方向可以是正交于样本的表面的主延伸平面的方向，光强度分布经由所述平面被施加 到样本上，并且X方向和y方向可以沿着这个主延伸平面或者平行于这个主延伸平面而延 伸。
[0042]根据本发明的方法，光强度分布的最小值可能在一个、两个或三个维度上空间受 限，即该最小值可以沿着平面、沿着线或围绕着点延伸。为了跟踪微粒的运动，继而使强度 分布相对于样本沿着最小值受限的维度的所有方向移动或偏转。沿最小值不受限的方向的 移动将不会引起：由微粒发射的光子的速率降低，并且因此不能有效率地使用。这也意味着 沿着这个方向的微粒的运动不能被跟踪。因此，优选使这个方向取向为使得沿着这个方向 的微粒的运动并非是所期望的。在许多情况下，样本中微粒的运动无论如何都局限于沿特 定结构的方向。在二维样本的情况下，出于原理，忽略沿第三维度的方向的微粒的运动。 [0043]已经提到的是，具有最小值的强度分布可以形成为一个或多个相干部分光束的干 涉图样，在所述干涉图样中，空间受限的最小值是基本上零强度的点。干涉图样例如可以通 过对其波前进行调制而由一个相干光束形成、或者由多个叠加的相干光束形成。
[0044]在本发明的方法的一个实施例中，动态地改变对一个相干光束的波前的调制，以 使得光强度分布的仅一维或两维受限的最小值交替地在不同的空间维度上空间受限。例 如，相位关系可以在第一相位关系与第二相位关系之间变化，以使得最小值在第一相位关 系的情况下受到处于x-y平面的环的限制，并且使得最小值在第二相位关系的情况下在Z方 向上受限。在J · Kel Ier 等人的 "Efficient fluorescence inhibition patterns for RESOLFT microscopy"（Optics Express 3361，V〇1.15，N〇.6(2007))、以及B.HArke等人的 NanoLetters，8,1309(2008)中，对用于沿x方向和y方向或沿z方向限制最小值的适当的光 强度分布、并且对相干光束的波前的相应的调制进行了描述，这些参考文献的公开内容以 全文引用的方式并入本文中。J.Keller等和B.Harke等使用它们的图样来进行荧光抑制。然 而，相同的图样可以用在本发明的方法中，用作驱使微粒发射光子的光的光强度分布。在本 发明的这个实施例的另一变型中，不同的、相继的相位关系可以产生沿不同方向取向的类 似线或类似面的最小值。这些最小值可以被描述为转动的带(rotating stripe)并且包括 点或线作为它们的空间交叉。如果一个最小值在这些相位关系之间快速地切换，并且如果 针对每个相位关系对微粒所发射的光子的速率的最小值单独地进行定位或者在经过相位 关系的完整变化之后对其进行定位，那么可以在所有三个维度上对样本中微粒的运动进行 跟踪。
[0045] 在本发明的方法中，光可以由不同波长的光成分（component)组成。此外，光可以 是波长可变的从而能够跟踪属于由微粒构成的不同组的不同微粒。在所有的这些情况下， 如果光强度分布以其空间受限的最小值的空间位置不会随光的波长发生变化的方式而形 成，那么这会是优点。
[0046] 在本发明的方法中，由微粒发射的光子不需要由二维检测器阵列检测。相反，由于 跟踪主要取决于这些光子的速率，所以点检测器足够用于检测光子。将根据具有最小值的 强度分布相对于样本的当前位置，来确定样本中微粒的当前位置。可以根据使强度分布相 对于样本移动的这些设备的位置总结出这个位置，例如，通过用于移动强度分布的扫描仪 的当前位置。例如还可以通过利用对样本成像的照相机来检测由微粒发射的光子，以及通 过评估在照相机上的由这些光子组成的光强度分布的图像，来直接确定相对于样本的强度 分布的位置。根据定位的原理，这种确定还允许实现超出衍射极限的位置精度。
[0047] 此外，对样本成像的照相机可以用于通过用驱使微粒发射光子的光对样本进行照 射来确定微粒的初始位置，而不用在空间上使光结构化。在确定了两个或更多个微粒(所述 两个或更多个微粒发射光子并且不能彼此分离地被跟踪）的情况下，可以通过有意地应用 (例如，如其在光强度分布的邻近于其最小值的最大点中所存在的）高光强度来对多余的微 粒进行光化学漂白。还可以在检测到的光子的速率的增大不是因所跟踪的微粒移动而是因 相似类型的另一微粒穿过所跟踪微粒的路径而产生的情况下，应用这种对干扰微粒的漂 白。这个其它微粒可以由例如经由照相机由较远离光的强度分布的最小值发射的较高数量 的光子所识别。
[0048] 对样本成像的照相机还可以用于根据利用照相机检测到的微粒所发射的光子的 位置来确定微粒的运动的方向。对于该确定，还可以执行对微粒的定位，其中，定位基于在 微粒离开光的强度分布的最小值时由微粒发射的光子。然而，此处，不需要以高精度来执行 定位。因此，不需要微粒发射许多光子，因为所发射的光子仅用于确定方向，其中，必须沿着 所述方向移动光的强度分布的最小值以跟随微粒。然而，不需要所发射的光子在跟踪微粒 方面实现期望的空间精度。相反，空间精度是通过随后对由微粒发射的光子的速率的最小 化并且因此是通过光强度分布的最小值的形式和/或布置来实现的。该最小化还可以基于 试错法，以重新调整光强度分布的空间受限最小值。
[0049] 然而，不需要使用整个照相机，来基于检测到的由微粒发射的光子的位置确定微 粒的运动的方向。还可以在使用至少两个邻近的点检测器来在一个维度上跟踪微粒时或在 使用至少三个邻近的点检测器来