在两个或三个维度上跟踪微粒时，获得用于这种确定的充 足的信息。例如，类似的概念用于公知的四象限光电二极管中以确定激光束的位置。此外， 其
【发明内容】
以全文引用的方式并入本文中的S.J.Sahl等人的Fast molecular tracking maps nanoscale dynamics of plasma membrane lipids(PNAS，April 13,2010,Vol.107, No.15,6829-6834)，公开了由三个光纤输入面(fibre input face)提供的用于跟踪荧光微 粒的三个邻近的点检测器在标准的分子跟踪过程中的使用。这些点检测器还可以用于本发 明的用于检测由微粒发射的光子的方法中。
[0050] 由于根据本发明的方法的目标在于对由微粒发射的光子的速率的最小化，所以除 那些感兴趣的光子之外检测到的背景很重要。所述背景例如可以是因被施加到样本上以便 驱使微粒发射光子的光以及散射到检测器的光而产生的，或者是因样本的自体荧光而产生 的。为了使背景的影响最小化，可以将驱使微粒发射光子的光以脉冲的形式施加到样本上， 并且可以在光的脉冲中的每个脉冲之后的有限的时间间隔内检测由微粒发射的光子。可以 调整该时间间隔或门控从而实现最大的信噪比。减少背景的另一种方法是选择一微粒，以 使得该微粒经由多光子过程被光驱使以发射光子。继而，由微粒发射的光子具有比施加到 样本的光短得多的波长，并且因这个光而产生的背景可以容易地受到波长抑制。此外，多光 子激发或吸收在所有三个维度上局限于微粒周围的区域。多光子激发不会遍布样本的增大 的体积，从而使不想要的（自体)荧光激发最小化。根据多光子激发荧光显微法公知对多光 子激发的限制。
[0051]在本发明的方法中，可以根据波长从白光中选择用于驱使微粒发射光子的光。通 过改变这个选择，可以跟踪属于由微粒构成的不同组的不同微粒。提供白光的光源通常是 已知的。它们例如可以从NKT Photonics，Denmark获得。这些光源提供在扩展的波长范围内 强度基本上恒定的光脉冲。可以从这个范围中选择本发明的方法中所使用的光。
[0052]在根据本发明的方法的一个实施例中，对由所跟踪的微粒发射的光子进行另外地 分析，以确定选自由以下特征构成的组中的至少一个特征:波长、偏振、绝对速率、由邻近的 点检测器检测到的相对数量、一致性(Coincidence)、以及在光的每个脉冲之后的时间点。 这允许收集关于所跟踪的微粒的额外信息或所跟踪的微粒的细节。这些细节可能随微粒的 轨迹发生变化。可以分析在光的脉冲之后光子的波长和光子的时间点的所产生的变化来监 测这些细节。具体而言，可以应用如A.SchSnle和S .W. He 11的Fluorescence nanoscopy goes multicolor(Nature Biotechnology，Vol.25，No.ll，November 2007，1243_1235)中 所述的类似的技术，其
【发明内容】
以全文引用的方式并入本文。用这种方式对微粒的细节进 行分析是高度灵敏的。这是由于仅单个微粒对于所分析的光子有贡献的事实，即不存在来 自具有其它细节的其它微粒的光子的稀释。这特别地允许基于由微粒发射的光子的波长或 其它特性的细微的差异对所跟踪的微粒进行准确的分类。
[0053]对来自于微粒的光子进行分析还允许确定微粒是否包括一个或多个光发射中心， 以及这些光发射中心是否在一起或者在某些时刻彼此远离。因此，可以分别针对结合体和 复合体的单个结合配偶体(partner)或复合配偶体对结合体和复合体进行监测。
[0054] 在本发明的方法中，用于检测微粒所发射的光子的检测器，还将检测由属于由微 粒构成的相同组并同样位于检测器的检测体积中的其它微粒发射的所有光子。然而，本发 明的方法仅在单个微粒发射为跟踪微粒而最小化的光子的速率下所检测到和所考虑的所 有光子的情况下正常工作。为了确认满足这一条件，可以分析从检测器的检测体积当中 (即，从包括光强度分布的最小值的体积当中）发射的光子以确定上述特征中的一个或多个 特征，并且可以检查所确定的特征与发射所分析的光子的单个微粒的符合性 (comp I iance)。特别地在这个背景下，由微粒发射的光子的绝对速率的特征也可以被称为 微粒的亮度。如果光子由一个以上的微粒发射，那么除了一个微粒以外的所有微粒都应当 被关断或漂白，或者应当在样本的另一部分中选择另一微粒。
[0055] 根据本发明的方法可以应用于跟踪可切换的微粒(例如，可切换的分子），其中，用 于驱使发射光子的光可以使可切换的分子从不能驱使微粒发射光子的状态激活到可以驱 使微粒发射光子的焚光状态中。这种可切换的分子的一个不例被称为PADRON，其为类绿色 荧光蛋白（GFP)的蛋白质。尽管未要求，但在这个实施例中可以优选的是微粒快速回到非荧 光暗状态中，因为这支持在驱使光子的发射的光的强度分布的最小值中所实现的使所发射 的光子的速率最小化的效果。微粒回到暗状态中可以自发地发生，或者可以被物理信号或 化学信号诱导。由于不需要这个诱导信号是空间结构化的，所以优选的是非空间结构化的。
[0056] 在使用可切换的微粒的本发明的另一个实施例中，与驱使光子的发射的光的波长 不同的另一波长的光，例如可以用于按照对单个微粒的任何跟踪的需要来调整样本中的被 激活的微粒的小浓度，该被激活的微粒可以被驱使以发射光子。出于这个目的，可以使用被 称为DR0NPA、rsEGFP、E0S和Dendra2的光可切换的蛋白质，这些蛋白质可以在与它们的激发 波长不同的另一波长下激活。DRONPA和rsEGFP不仅被激发以发射光子，而且在它们的激发 波长下被去激活。由于本发明的方法所需的光子的数量低，然而尽管如此也可以在一些时 间内利用激发光的光强度分布来成功地跟踪这些光子。首先并未使EOS和Dendra2在它们的 激发波长下去激活;它们只可以漂白。
[0057] 在使用可切换的微粒的本发明的所有实施例中，用于驱使光子的发射的光(形成 该光以提供具有空间受限最小值的光强度分布)可以仅包括一个波长的一个光成分，或包 括不同波长的两个成分。在仅有一个光成分的情况下，该光成分可以激发微粒以进行光子 的发射，所述微粒已经用另一种方式被接通或激活;或者该光成分可以同时激活和激发微 粒以进行光子的发射。在有两个光成分的情况下，这些两个光成分中一个光成分可以用于 激活微粒，而光成分中的另一个光成分激发微粒以进行光子的发射。
[0058]在本发明的一个实施例中，单独的关断信号被提供具有信号强度分布并且包含光 强度分布。这个关断信号关断属于由在受到光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的组 的其它微粒。例如，可以通过光化学漂白或者通过将可光去激活的微粒切换到稳定的暗状 态来进行关断。本发明的这个实施例通过发射对将被最小化的光子的速率有贡献的光子， 来确保穿过所跟踪的微粒的路径的微粒不会干扰它的跟踪。关断信号可以是关断光。关断 信号通常可以采用与光相同的方式而形成，并且可以与光的强度分布的最小值同心地形成 但在公共中心处具有关断信号的较大的最小值。关断信号的这个较大的最小值避免所跟踪 的微粒被关断。
[0059]在本发明的方法的一个实施例中，对由微粒发射并被检测到的光子进行计数，并 且指示已由微粒发射并被检测到的光子的绝对数量。通常，在微粒被漂白并从而不再是可 跟踪的之前，可以驱使每个微粒发射一定数量的光子。这个数量的光子不是绝对固定的，但 也不会在由微粒构成的每个组内强烈地变化。因此，由微粒发射并被检测到的光子的绝对 数量，是微粒的可跟踪寿命的已经到期的部分以及可跟踪寿命的剩余的部分的良好的指示 器，在所述可跟踪寿命的剩余的部分内依然可以对微粒进行跟踪。
[0000]在本发明的方法的一个实施例中，通过光强度分布的最小值交替地跟踪选自由在 受到光的照射时被驱使以发射光子的微粒构成的相同组中的至少两个微粒。根据STED和 RES0LFT荧光显微法已知的上述这些扫描仪，适用于比任何微粒可以在样本中运动的速度 快得多地以高精度对光强度分布的最小值进行重新定位。其它适当的扫描仪是已经例如在 光镊中用于跟踪和捕获多个微粒的这些扫描仪。因此，可以并行地跟踪多个微粒，这是因为 针对多个微粒中的每个微粒交替地执行根据本发明的方法的步骤。
[0061] 在前述段落中所述的本发明的实施的变型中，周期性地沿着穿过样本的线或轨线 来回移动光强度分布，选自由微粒构成的相同组中的两个或更多个微粒位于所述线或轨线 上。在垂直于这条线或轨线的所有方向上，对两个或更多个微粒进行直接跟踪，因为这条线 的线程被重新调整以使由微粒发射的光子的速率最小化。然而，可以根据沿着线的由微粒 发射的检测到的光子的速率的局部最小值的位置，来确定沿着线的微粒的位置。这个实施 例还允许单独地跟踪互相非常靠近的微粒。在这种情况下，沿其来回移动光强度分布的线 特别地可以在微粒之间的距离的方向上延伸。在这个实施例中，微粒的距离为沿着线的检 测到的光子的速率的局部最小值的距离。
[0062] 根据本发明的方法，还可以跟踪两个或更多个不同微粒的运动。出于这个目的，可 以使用两种或更多种不同波长或偏振的光，并且可以检测为相应微粒的特性的波长或偏振 的光子。除公共物镜以外，可以利用独立的设备来执行对两个或更多个不同微粒的这种跟 踪。在本发明的另一个实施例中，仅存在独立的光源，然而跟踪设备的所有其它部分是共享 的。所有的共享部分将以交替的方式用于微粒两者，即通过在对一个微粒的跟踪与另一个 微粒的跟踪之间进行切换。
[0063] 根据本发明，对微粒的跟踪用于对样本成像。出于这个目的，针对样本的多个部分 中的每个部分，确定微粒的驻留时间。样本的这些部分可以特别地是由样本的整个体积细 分成的体积元素或体素。当对样本上的驻留时间的分布进行绘图时，获得了样本的图像。在 基本实施例中，样本的所产生的图像可以指示其