一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法
【专利摘要】本发明涉及一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法。本发明蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量的测定方法包括：样品制备；样品前处理；有机溶剂提取；固相萃取小柱去除色素杂质，氮气吹至近干，以流动相溶解残渣，溶液经滤膜过滤供HPLC分析；标准溶液的配制；高效液相色谱仪测定等过程。本发明的方法，操作简单，快速，自动化程度高，萃取效率快，回收率和重复性好，可实现蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量的同时测定。
【专利说明】
一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种蔬菜、水果中烯酰吗啉与赤霉素残留量的测定方法，具体涉及一 种蔬果中2种农药残留测定的高效液相色谱方法，属于农药残留的理化检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，温室大棚等保护地蔬果种植面积迅速增加，重茬、连作导致农产品中病虫 害加重，各地在防治蔬果病虫害中，大量和连续地使用烯酰吗啉、赤霉素等农药，使得农产 品中病虫对化学农药产生了普遍的抗药性，菜农只能加大农药的使用量。由此，农药使用和 依赖程度呈现出恶性循环状态，使得农产品中农药残留量超标问题日益突出。
[0003] 食用农药残留超标的蔬菜与水果，会直接危及人体的神经系统和肝脏、肾脏等重 要器官，残留农药在人体内蓄积过一定限度后会导致一些慢性疾病，如癌症、动脉硬化、心 血管病、胎儿畸形、死胎、早夭、早衰等疾病。农药残留不但对人体健康造成极大的危害，同 时也严重污染人类生存环境，造成空气、土壤、河流等污染，并在环境中不断积累起来，造成 动植物中毒，破坏了生态平衡。
[0004] 烯酰吗啉是一种肉桂酸衍生物，对藻状菌的霜霉和疫霉属真菌有独特的作用方 式；赤霉素是一种高效能的广普性植物生长促进物质，有诱导无子果实的形成、提高座果 率、改善果实品质、防止落花落果、促进果实早熟、延迟果树花期、增加果品贮藏能力和打破 休眠的调控作用。生产中，二者广泛应用于葡萄、苹果、西红柿、马铃薯、黄瓜、白菜等作物。
[0005] 目前，国内尚无烯酰吗啉与赤霉素同时测定的液相色谱分析方法，文献报道主要 有气相色谱法、气-质联用法、液-质联用法测定其中一种农药，还未报道通过高效液相色谱 法同时测定蔬果中的烯酰吗啉与赤霉素。已报道的国外文献中，利用气相色谱-质谱联用法 (GC/MS)检测啤酒和干啤酒花中烯酰吗啉残留，但尚未用于蔬菜水果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种操作简单，快速，自动化程度高， 萃取效率高，回收率和重复性好的，同时测定蔬果中烯酰吗啉与赤霉素农药残留量的方法。
[0007] 为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：一种蔬果中烯酰吗啉与赤 霉素残留量测定的方法，包括如下步骤： (1) 样品制备:将蔬果样品绞碎、匀浆，冷冻保存，得冷冻样品； (2) 样品前处理:称取10g冷冻样品，精确到0.01 g，置于50mL离心管中，加入10 mL 80% 甲醇水混勾，祸旋，2 min;振荡，10 min;4°C，8000 r/min离心，提取上清液;再加入10 mL 80%甲醇水，祸旋，2 min;振荡，10 min;4°C，8000 r/min离心，提取上清液;合并两次提取 液，浓缩至4 mL，得浓缩液；用2 m〇VL盐酸调节上述4 mL浓缩液的pH至2.5,加入15mL乙酸 乙酯，祸旋，2min;振荡，10min;4°C，8000 r/min离心，提取有机相;再加入15 mL乙酸乙酯， 涡旋，2min;振荡，lOmin; 4°C，8000 r/min离心，提取有机相;合并两次有机相提取液;将两 次有机相提取液在45°C，旋转、浓缩至近干，加入2. OmL正己烷溶解残渣，净化，得待净化溶 液;将酸性氧化铝柱依次用5mL的丙酮+正己烷混合液、5mL正己烷预淋洗、条件化，当溶剂液 面到达柱吸附层表面时，立即倒入上述待净化溶液，用15mL刻度离心管接收洗脱液，用5mL 的丙酮+正己烷混合液冲洗烧杯后，洗脱酸性氧化铝柱，并重复一次;将盛有10mL洗脱液的 刻度离心管置于氮吹仪上，在水浴温度50°C条件下，氮气吹干，用超纯水定容至l.OmL，在旋 涡混合器上混匀，经0.45μπι滤膜过滤，供高效液相色谱测定； (3) 标准溶液的配制:混合标准工作液用乙腈稀释，配制成具有系列梯度浓度的混合标 准工作液，以超纯水定容； (4) 高效液相色谱仪测定:将工作液注入配有紫外检测器的高效液相色谱仪器中，进行 高效液相色谱测定;高效液相色谱测定条件如下:C18柱，150 mmX4.6 mmX5 μπι;流动相： 甲醇+水+乙酸水溶液(ρΗ=4.0);流速：1.0 mL/min;柱温:40°C ;进样量:20 yL;紫外吸收波 长:252 nm； (5) 残留量测定结果的计算：以保留时间对烯酰吗啉、赤霉素两种农药进行定性分析， 以峰面积进行两种农药的定量分析，用外标法计算结果。
[0008] 优选的，所述蔬果样品为西红柿或西瓜。
[0009] 所述丙酮+正己烷混合液中丙酮和正己烷的体积比为1: 9。
[0010] 步骤(2)所述乙酸乙酯在使用前用超纯水饱和。
[0011] 步骤(2)所述酸性氧化铝柱是以酸性氧化铝粉末为固相萃取填料的色谱柱，色谱 柱中酸性氧化铝粉末的加入量为每克样品加入1克酸性氧化铝粉末;所述酸性氧化铝粉末 在使用前，于马弗炉内400°c下烘干。
[0012] 步骤(3)所述混合标准工作液的系列梯度浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 yg/ mL〇
[0013] 优选的，所述步骤(1)冷冻保存温度为-18°C。
[0014]进一步的，步骤(2)所述加入80%甲醇水的体积为每克样品加入2.0 mL。
[0015] 本发明的蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定方法应用于检测西瓜、西红柿中的 农药残留量。尤其是用于同时检测西瓜、西红柿中烯酰吗啉与赤霉素残留量。
[0016] 步骤(3)所述混合标准工作液的系列梯度浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 yg/ mL； 所采用的HPLC条件为:色谱柱:C18柱，150 mmX4.6 mmX5 μπι;流动相：甲醇(A)+水(B) +乙酸水溶液(pH=4.0，C);流速：1.0 mL/min;柱温:40°C ;进样量：20 yL;紫外吸收波长： 252nm〇
[0017]优选的，所述流动相梯度及时间如表1所示。
[0018] 表1流动相梯度及时间
[0019] 本发明的有益效果是：用本方法检测蔬果农药残留量，处理操作简单，快速，自动 化程度高，萃取效率高，是一种回收率和重复性好的测定蔬果农药残留量的方法;本发明方 法可同时测定蔬果中烯酰吗啉与赤霉素农药残留量。
【附图说明】
[0020] 图1:烯酰吗啉与赤霉素2种农药的标准液相色谱图（浓度为0.1 yg/mL)，图中1-3 依次为烯酰吗啉I、烯酰吗啉S、赤霉素。
[0021] 图2:西瓜样品空白谱图。
[0022] 图3:西瓜样品加标谱图（浓度为0.5 yg/mL)。
[0023] 图4:西红柿样品空白谱图。
[0024]图5:西红柿样品加标谱图（浓度为0.5 yg/mL)。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限 制本发明的范围。
[0026] 实施例1采用本发明的方法，按如下步骤分别测定5个西瓜与西红柿样品中的烯 酰吗啉与赤霉素残留量： (1) 样品制备:将5个西瓜与5个西红柿分别绞碎匀浆，_18°C条件下冷冻保存，得冷冻样 品； (2) 样品前处理:称取10g冷冻样品，精确到0.01 g，置于50mL离心管中，加入10 mL 80% 甲醇水混勾，祸旋，2 min;振荡，10 min;4°C，8000 r/min离心，提取上清液，得提取液80% 甲醇水10 mL;再加入10 mL 80%甲醇水，祸旋，2 min;振荡，10 min;4°C，8000 r/min离心， 提取上清液，得提取液80%甲醇水10 mL;合并两次提取液，浓缩至4 mL;用2 mol/L盐酸调节 上述4 mL浓缩液pH至2.5，加入15mL乙酸乙酯，祸旋，2min;振荡，lOmin;4°C，8000 r/min离 心，提取有机相;再加入15 mL乙酸乙酯，祸旋，2min;振荡，10min;4°C，8000 r/min离心，提 取有机相;合并两次有机相提取液;将两次有机相提取液30 mL乙酸乙酯在45°C，旋转、浓缩 至近干，加入2. OmL正己烷溶解残渣，净化，得待净化溶液;将酸性氧化铝柱依次用5mL的丙 酮+正己烷(体积比为10:90)混合液、5mL正己烷预淋洗、条件化，当溶剂液面到达柱吸附层 表面时，立即倒入上述待净化溶液，用15mL刻度离心管接收洗脱液，用5mL的丙酮+正己烷 (体积比为10:90)混合液冲洗烧杯后，洗脱酸性氧化铝柱，并重复一次;将盛有10mL洗脱液 的丙酮+正己烷(体积比为10:90)刻度离心管置于氮吹仪上，在水浴温度50°C条件下，氮气 吹干，用超纯水定容至l.OmL，在旋涡混合器上混匀，经0.45μπι滤膜过滤，供高效液相色谱测 定； (3) 标准溶液的配制:混合标准工作液用乙腈稀释，超纯水定容； (4) 高效液相色谱测定:配制不同浓度的混合标准工作液，注入配有紫外检测器的高效 液相色谱中，混合标准工作液的系列梯度浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 yg/mL;采用 的HPLC条件如下：色谱柱:C18柱，150 mmX4.6 mmX5 μπι;流动相：甲醇(A)+水(B)+乙酸水 溶液(pH=4.0，C);流速：1.0 mL/min;柱温:40 °C ;进样量:20 yL;紫外吸收波长:252nm;流动 相梯度及时间如表1所示； (5) 残留量测定结果的计算:残留量测定结果的计算：以保留时间对烯酰吗啉与赤霉素 两种农药进行定性分析，以峰面积进行烯酰吗啉与赤霉素两种农药的定量分析，用外标法 计算结果，结果在1个西瓜样品、2个西红柿样品中检测到农药，结果见表2。
[0027]表2菠菜样品中残留农药的含量
重复性和回收率的测定:分别采用阴性西瓜样品与阴性西红柿样品（所述阴性指在样 品中2种农药均无检出）进行测定，以3倍信噪比确定分析物的检测限，以10倍信噪比确定分 析物的定量限，结合回收率和样品量，方法的定量检出限为10-30ug/kg，采用样品中添加标 准溶液的方法，在同样的样品处理下对两种农药进行加标回收率实验，结果见表3。
[0028]表3西瓜中2种农药进行加标回收率及标准偏差(n=5)
[0029] 表4高效液相色谱仪测定蔬果样品中2种目标化合物的线性及检出限(n=5)
[0030] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非是对本发明的 范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术 方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，其特征在于:包括如下步骤： (1) 样品制备:将蔬果样品绞碎、匀浆，冷冻保存，得冷冻样品； (2) 样品前处理:称取10g冷冻样品，精确到O.Olg，置于50mL离心管中，加入10 mL 80% 甲醇水混勾，祸旋，2 min;振荡，10 min;4°C，8000 r/min离心，提取上清液;再加入10 mL 80%甲醇水，祸旋，2 min;振荡，10 min;4°C，8000 r/min离心，提取上清液;合并两次提取 液，浓缩至4 mL，得浓缩液；用2 m〇VL盐酸调节上述4 mL浓缩液的pH至2.5,加入15mL乙酸 乙酯，祸旋，2min;振荡，10min;4°C，8000 r/min离心，提取有机相;再加入15 mL乙酸乙酯， 涡旋，2min;振荡，lOmin; 4°C，8000 r/min离心，提取有机相;合并两次有机相提取液;将两 次有机相提取液在45°C，旋转、浓缩至近干，加入2. OmL正己烷溶解残渣，净化，得待净化溶 液;将酸性氧化铝柱依次用5mL的丙酮+正己烷混合液、5mL正己烷预淋洗、条件化，当溶剂液 面到达柱吸附层表面时，立即倒入上述待净化溶液，用15mL刻度离心管接收洗脱液，用5mL 的丙酮+正己烷混合液冲洗烧杯后，洗脱酸性氧化铝柱，并重复一次;将盛有10mL洗脱液的 刻度离心管置于氮吹仪上，在水浴温度50°C条件下，氮气吹干，用超纯水定容至l.OmL，在旋 涡混合器上混匀，经0.45μπι滤膜过滤，供高效液相色谱测定； (3) 标准溶液的配制:混合标准工作液用乙腈稀释，配制成具有系列梯度浓度的混合标 准工作液，以超纯水定容； (4) 高效液相色谱仪测定:将工作液注入配有紫外检测器的高效液相色谱仪器中，进行 高效液相色谱测定;高效液相色谱测定条件如下:C18柱，150 mmX4.6 mmX5 μπι;流动相： 甲醇+水+乙酸水溶液(ρΗ=4.0);流速：1.0 mL/min;柱温:40°C ;进样量:20 yL;紫外吸收波 长:252 nm； (5) 残留量测定结果的计算：以保留时间对烯酰吗啉、赤霉素两种农药进行定性分析， 以峰面积进行两种农药的定量分析，用外标法计算结果。2. 根据权利要求1所述一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，其特征在于： 所述蔬果样品为西红柿或西瓜。3. 根据权利要求1所述一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，其特征在于： 所述丙酮+正己烷混合液中丙酮和正己烷的体积比为10:90。4. 根据权利要求1所述一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，其特征在于： 步骤(2 )所述乙酸乙酯在使用前用超纯水饱和。5. 根据权利要求1所述一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，其特征在于： 步骤(2)所述酸性氧化铝柱是以酸性氧化铝粉末为固相萃取填料的色谱柱，色谱柱中酸性 氧化铝粉末的加入量为每克样品加入1克酸性氧化铝粉末;所述酸性氧化铝粉末在使用前， 于马弗炉内400°C下烘干。6. 根据权利要求1所述一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，其特征在 于:步骤(3)所述混合标准工作液的系列梯度浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 yg/mL。7. 根据权利要求1所述一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，其特征在于： 所述步骤(1)冷冻保存温度为_18°C。8. 根据权利要求1所述一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定的方法，其特征在于： 步骤(2 )所述加入80%甲醇水的体积为每克样品加入2. OmL。9. 一种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定方法的应用，其特征在于:检测西瓜、西红 柿中的农药残留量。10.-种蔬果中烯酰吗啉与赤霉素残留量测定方法的应用，其特征在于：同时检测西 瓜、西红柿中烯酰吗啉与赤霉素残留量。
【文档编号】G01N30/02GK105974015SQ201610295867
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月7日
【发明人】郭宏斌, 杨春亮, 王明月, 曾日中, 林玲
【申请人】中国热带农业科学院农产品加工研究所