人组织激肽释放酶1胶体金定量检测试纸卡的制作方法
【专利摘要】本发明涉及检测人组织激肽释放酶1(hK1)胶体金定量检测试纸卡及其相关抗体。本发明制备了多种单克隆抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(A24及A32)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能都较好的人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡。
【专利说明】
人组织激化釋放酶1胶体金定量检测试纸卡
技术领域
[0001] 本发明属于免疫化学技术领域，具体的设及检测人组织激肤释放酶1 OiKl)胶体 金定量检测试纸卡及其相关抗体。
【背景技术】
[0002] 屯、脑血管疾病是严重危害人类健康的主要慢性非传染性疾病。其中冠屯、病及脑卒 中是世界上最常见的死亡原因。在我国，随着人口的老龄化，W冠屯、病，脑卒中为代表的屯、 脑血管疾病的发病率，致死率及致残率呈逐年上升的趋势。但是，80%的脑卒中是可W预防 的。糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症，严重危害糖尿病患者的生命质量和医疗消费质 量。若不从循证医学的高度采取积极的干预措施，糖尿病肾病就会在较短的时间内发展为 不可逆转的终末期肾病，严重威胁患者的生存寿命。因此，积极寻找有效的方法，早期诊断 脑卒中、糖尿病肾病W进行有效的防护直接关系着患者的生命质量及生存寿命。
[000引激肤释放酶一激肤系统化allikrein-kinin system, KK巧又称激肤系统，广泛存 在于动物体内的多个系统，尤其是在屯、血管系统内分布更为密集。该系统有广泛生物学活 性，并且和凝血系统、肾素-血管紧张素系统W及多种血管活性因子系统等存在密切的联 系和交叉对话，共同维护人体多器官正常的生理机能和参与各种复杂的病理生理过程，具 有调节屯、血管、肾脏、神经系统和葡萄糖代谢，舒张血管、参与炎症反应、疼痛刺激和休克反 应。近年来关于激肤系统的临床研究主要集中在屯、血管、肾脏、中枢神经系统疾病中的作 用。
[0004] 人组织激肤释放酶是激肤系统最重要的组成部分，是一组分泌型丝氨酸蛋白酶， 包含15个成员。在所有已知的组织激肤释放酶中，只有人组织激肤释放酶1 (膜/肾激肤 释放酶，Human kalIikrein l，hKl，KLKl，又称激肤原酶，Kininogenase)能有效水解低分子 量激肤原（LMWK)，释放具有活性的激肤，进而发挥屯、血管系统及肾脏功能的调节作用。基础 研究表明，在多种高血压动物模型中已证实，hKl具有降低血压，减轻肾脏和屯、脏肥大及纤 维化的作用；其在进行屯、脏重塑，减轻肾脏损害，降低脑梗死发生率W及降低神经损伤危害 等方面的作用。同时，通过外源性给药的方法，亦证明了 hKl在防止中风，屯、脑血管W及肾 脏疾病方面的作用。近些年来，进一步的研究表明，MQ水平在人的屯、脑血管疾病的发生发 展的过程中具有重要的临床意义，可能作为预测脑卒中发病率的指标。MQ水平可预测脑卒 中的发病及五年无事件性生存率，可让患者早期预防并采取相应的措施，从而一定程度上 降低脑卒中的发生概率。另外，MQ较尿微量白蛋白排泄率可更早的诊断早期糖尿病肾病。 综上可见，hKl的水平对于人的屯、脑血管疾病及糖尿病肾脏疾病具有重要的预测价值。因 此，准确测定MQ的水平，在临床及科研中均具有重要的意义。 阳0化]鉴于MQ在屯、脑血管疾病及糖尿病肾脏疾病中的治疗及预测作用，制备MQ定量 检测试剂盒具有重要临床的应用价值。国内外已有MQ科研用定量检测试剂盒：其中部分 试剂盒采用竞争法，抗体为多克隆抗体，其操作繁杂，计算繁琐且易出现非特异性结合而导 致检测结果误差较大；部分试剂盒采用多克隆抗体的夹屯、法检测模式，亦存在非特异性结 合的影响；另外一些试剂盒采用多克隆抗体及单克隆抗体的双抗体夹屯、的模式，其检测性 能有待进一步验证。双抗体夹屯、法的检测模式可有效避免上述问题。因此，多表位，高灵 敏度，特异性的抗体的制备是高质量的人组织激肤释放酶1定量检测试剂盒的关键因素之 一。天然MQ存在多个糖基化位点，因而重组表达MQ在糖基化位点等其他构象方面可能 与天然蛋白存在较大的差异。在特异性抗体筛选时采用重组MQ进行筛选就会出现筛选的 特异性抗体不能有效识别天然MQ的问题。本发明采用人天然MQ进行抗体的筛选工作， 可有效避免上述情况的发生，且已证实其与天然MQ的结合力。
[0006] 同时，为满足市场的不同应用需求，本发明制备了=种MQ定量检测试剂盒：人组 织激肤释放酶IELISA定量检测试剂盒，可满足一般小型综合医院的应用需求，且日后可发 展升级为化学发光法定量检测（全自动），满足大型综合医院的全自动检测的应用需求。人 组织激肤释放酶1胶体金定量检测试纸卡及人组织激肤释放酶1巧光定量检测试纸卡，均 可满足快速检测及床边检测的需求。其中胶体金定量检测法灵敏度和准确度虽不如巧光定 量检测法，但其使用方便易于推广且成本较低，可基本满足疾病指标的定量检测，适合于基 层医疗系统中的即时检测。巧光定量具备更高的检测灵敏度，适用于检测要求较高的检验 中屯、或大型医院临床科室的床边诊断的应用需求。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人组织激肤释放酶1的抗 体。更具体地说：
[0008] 本发明的第一目的在于提供两种抗人组织激肤释放酶1抗体。
[0009] 第一种抗人组织激肤释放酶1抗体（A24)，
[0010] 其重链可变区含有W下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :1所示的 HCDR1、如序列沈Q ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列沈Q ID NO :3所示的HCDR3 ; W11] 化及其轻链可变区序列含有W下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :4 所示的LCDR1、如序列SEQ ID N0:5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0:6所示的LCDR3。
[0012] 优选的是本发明中的抗体A24的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示， 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0013] 第二种抗人组织激肤释放酶1抗体（A32)，
[0014] 其重链可变区含有W下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO :9所示的 HCDR1、如序列沈Q ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列沈Q ID NO :11所示的HCDR3 ; 阳0巧]W及其轻链可变区序列含有W下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO: 12所示的LCDRl、如序列沈Q ID NO : 13所示的LCDR2和/或如序列沈Q ID NO : 14所示的 LCDR3。
[0016] 优选的是本发明中的抗体A32的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:15所示， 轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0017] 本发明第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体A24的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；所述单链抗体A32的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。优选的，所述单链 抗体A24、A32中不含由六个组氨酸构成的HIS标签。
[0018] 本发明第=个目的是提供两种编码上述单链抗体的核巧酸序列，编码单链抗体 A24的核巧酸序列如SEQ ID NO: 19所示，和编码单链抗体A32的核巧酸序列如SEQ ID NO: 20所示。
[0019] 本发明第四个目的是提供一种含有上述核巧酸序列的表达载体。
[0020] 本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞 可W是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。
[0021] 本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：
[0022] 1)在合适的条件下培养上述重组宿主细胞表达抗体； 阳023] 2)然后从宿主细胞中纯化、收集抗体。
[0024] 本发明的第屯个目的在于提供上述抗人组织激肤释放酶1抗体在检测人组织激 肤释放酶1含量中的应用。
[00巧]本发明的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人组织激肤释放酶1的抗 体对组合；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。
[00%] 本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人组织激肤释放酶1抗体检测人 组织激肤释放酶1的酶联免疫定量检测试剂盒，包括包被了 A24或A32抗体的酶标板、样品 稀释液、标准品、含有酶标抗体A32或A24的检测液、洗涂液、显色液及终止液。其检测步骤 主要包括：
[0027] (1)向包被A24或A32抗体的酶标板中加入样本稀释液后，再加入样本稀释液稀释
[0028] 的标准品、阴性对照及血清或血浆等待检样本；
[0029] (2)加入样本稀释液稀释的检测液；
[0030] 做加入显色液
[0031] (4)加入终止液并读取OD值。
[0032] 所述酶标抗体A32或A24是辣根过氧化物酶标记的抗体A32或A24 (A32-HRP或 A24-HR巧或者碱性憐酸酶标记的抗体A32或A24(A32-AP或A24-AP);所述标准品为中国仓 鼠卵巢细胞（CHO)表达重组人组织激肤释放酶1的纯化蛋白。
[0033] 本发明的第十个目的在于提供一种利用所述抗人组织激肤释放酶1抗体检测人 组织激肤释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水 垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体A32或A24,所述反应膜上有检测带和质控 带，检测带位置包被有抗体A24或A32,质控带位置包被抗化S标签抗体或Protein L。
[0034] 本发明第十一个目的在于提供一种利用所述抗人组织激肤释放酶1抗体检测人 组织激肤释放酶1的时间分辨免疫巧光层析定量检测卡，包括样品吸收垫、巧光微球垫、反 应膜和吸水垫；所述巧光微球垫喷涂有巧光微球标记的上述所述抗体A32或A24,所述反 应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有上述所述抗体A24或A32,质控带位置包被抗 His标签抗体或Protein L。
[0035] 所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所述抗化S标签抗体优选鼠抗化S抗体。
[0036] 本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的 抗体组合（A24及A32);同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述 抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能可 满足临床样本检测的人组织激肤释放酶1的酶联免疫定量检测试剂盒、人组织激肤释放酶 1的胶体金免疫层析定量检测卡及人组织激肤释放酶1的时间分辨免疫巧光层析定量检测 卡。
【附图说明】
[0037] 图1.抗体重链及轻链可变区基因电泳图。Lane 1为标准DNA，Lane 2为抗体A24 重链可变区DNA，Lane 3为抗体A24轻链可变区DNA，Lane 4为抗体A32重链可变区DNA， Lane 5为抗体A32轻链可变区DNA。
[0038] 图2.单链抗体结构示意图。Vh表示重链可变区序列，V L表示轻链可变区序列，His 标签为六个组氨酸。
[0039] 图3.单链抗体表达PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图（a)为A24基因 PCR产物； 图化）为A32基因 PCR产物。
[0040] 图4.重组毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液鉴定图。图4(a)为抗体A24重组毕 赤酵母菌株诱导表达上清培养液鉴定图；图4(b)为抗体A32重组毕赤酵母菌株诱导表达上 清培养液鉴定图。上述左图为SDS-PAGE电泳鉴定图、右图为Western blot鉴定图。
[0041] 图5.单链抗体纯化效果图（SDS-PAGE)。图（a)为抗体A24,图化）为抗体A32。
[0042] 图6.抗体A24及A32的Western Blot鉴定图。泳道1为尤瑞克林扣K);泳道2 为酵母表达MQ ;泳道3为大肠杆菌表达MQ ;泳道4为C册表达MQ。图（a)为A32抗体 Western Blot 结果；图（b)为 A24 抗体 Western Blot 结果。
[00创图7.本发明酶联免疫检测试剂盒标准曲线。其中横坐标为蛋白浓度（ng/mL);纵 坐标为检测0D450 ;r表示检测相关系数，为0. 99980322。
[0044] 图8.本发明酶联免疫检测试剂盒检测特异性。横坐标为检测物浓度（ng/mL);纵 坐标为检测OD值。UK表示尤瑞克林，是从人尿液中提取的人组织激肤释放酶1 ;KLK2表示 人组织激肤释放酶2 ;KLK3表示人组织激肤释放酶3。
[0045] 图9.本发明胶体金免疫层析定量检测卡及时间分辨免疫巧光层析定量检测卡结 构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、4为质控线（C线）、5为检测线灯线）、6 为金标垫或巧光结合垫、7为PVC片材。
[0046] 图10.本发明胶体金免疫层析定量检测卡标准曲线。其中横坐标为蛋白浓度（ng/ 血）；纵坐标为T/C值；r2为0. 992。
[0047] 图11.本发明时间分辨免疫巧光层析定量检测卡标准曲线。其中横坐标为蛋白浓 度（ng/mL);纵坐标为检测值；r2为0. 9952。
[0048] 图12.时间分辨免疫巧光层析定量检测与酶联免疫检测结果相关性
【具体实施方式】 阳049] 定义
[0050] "抗体"又称免疫球蛋白，是一类由B淋己细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过 Y形的其中两个分叉顶端的互补位点（抗原结结合位）特异性结合祀抗原的免疫球蛋白分 子，所述祀抗原如蛋白质、糖、多核巧酸、脂、多肤、小分子化合物等。
[0051] "单链抗体"（scFv)指的是抗体的重链可变区（Vh)和轻链可变区（\)通过15~ 20个氨基酸短肤（linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨 酸和丝氨酸，W利于单链抗体的稳定性与柔初性。连接方式可将\的N端连接至V H的C末 端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker,单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异 性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
[0052] 互补决定区（complementarit^determining region, CDR)，也叫做高变区。成型 于抗体单体氨基酸的末端，是祀抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗 体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。
[0053] W下实施例中所用标准品均为C册系统表达重组MQ (Img/mU制备方法见专利 201310746269. X)
[0054] 实施例1.抗人组织激肤释放酶1杂交瘤细胞株的制备 阳〇5引 1.动物免疫 W56] W重组人组织激肤释放酶1(中国仓鼠卵巢细胞表达，制备方法见专利 201310746269.讶按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠（购自常州卡文斯实验动物有限 公司）。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接化ISA法跟踪免疫小鼠 血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。 [0057] 2.细胞融合 阳05引 （1).脾脏细胞的制备
[0059] 将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75% (v/v)的酒精中浸泡10分钟， 于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基 (购自Gibco公司）离屯、洗涂数次后，重悬细胞W制成单细胞悬液，并计数，备用。
[0060] (2).饲养细胞的制备
[0061] 取8~10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置 75% (v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌掲开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约IOmL 1640HT 培养基（购自SIGMA公司）注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨隧细胞 的培养基注入20% 1640HAT培养基中备用； 阳06引取2~3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75 % (v/v)酒精中浸 泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨隧细胞 的20% 1640HAT培养基中，备用。 阳〇6引 （3).细胞融合
[0064] 选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0,收集并计数。取约IO8个上述脾 细胞与2 X IO7个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，100化pm离屯、10分钟后弃上清（尽 量弃净），将融合管置手掌上来回轻轻摩擦W使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入ImL预热 的阳G1450(聚乙二醇1450,购自SIGMA公司），加入1640HT培养基30血终止，100化pm离 屯、10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20%的1640HAT培养基中。 阳0化]将上述HAT培养基充分混匀后，W 200 y L/孔分装至96孔细胞培养板中，置37°C， 5% C02的细胞培养箱中培养。一周后用10% 1640HT培养基替换20% 1640HAT培养基，3 天后取上清进行检测。
[0066] 3.抗人组织激肤释放酶1特异性杂交瘤细胞株筛选
[0067] (1).检测板的准备：用CB包被液稀释尤瑞克林0JK，购买于广东天普生化医药公 司）至1 y g/mU包被96孔化ISA酶标板，100 y L/孔，2~8°C包被过夜，洗涂一次拍干；含 2%酪蛋白的PBST缓冲液封闭（200uL/孔），37°C封闭2小时；拍干，备用。 W側 似.阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清lOOiiL/孔加入上述检测板中，于 37°C作用30分钟后洗涂并拍干，加入100 y L/孔的HRP标记的羊抗鼠 IgG,于37°C作用 30分钟后洗涂并拍干，加入100 y L/孔的TMB显色液，于37°C避光显色15分钟，每孔加入 50 y L的2M H2SO4终止反应，并于0D450处读取数值。阳性孔确定原则：0D450值/阴性对 照值>2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过=至四轮的克隆化筛选后，单克 隆细胞株阳性率100%即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株C24及C32 均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。
[0069] 实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定
[0070] 对上述杂交瘤细胞株C24及C32抗体可变区序列进行测定。
[0071] a. RNA的提取：参照细胞总RNA抽提试剂盒（购自Roche公司）说明书对上述杂 交瘤细胞株C24及C32进行总RNA提取并立即进行反转录；
[0072] b. RNA 反转录成为 DNA :参照 Hiermo Scientific Reverted First strand cDNA Synthesis Kit (购自化ermo公司）对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA， 冻存于-20°C备用； 阳07引 C.可变区序列的PCR扩增及回收：W上一步骤中所得CDNA为模板，W鼠 IgG亚型 单克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR 产物经DNA胶回收试剂盒（购自TIANGEN公司）进行回收，见附图1 ;
[0074] d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体PMD18-T kit(购自Takara公 司）说明书，将重链和轻链可变区基因分别与PMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌畑5a， 挑取阳性克隆，交由Invitrogen?公司进行测序。
[0075] 测序得到杂交瘤细胞株C24的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示、 轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区 的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO :1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR3 ;其轻链可变区的各互补决定 区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO :4所示的LCDRl、如序列SEQ ID NO :5所示的LCDR2 和/或如序列SEQ ID NO :6所示的LCDR3。
[0076] 测序得到杂交瘤细胞株C32的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示、 轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :16所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变 区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO :9所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :11所示的HCDR3 ;其轻链可变区的各互补决 定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO : 12所示的LCDRl、如序列SEQ ID NO : 13所示的 LCDR2和/或如序列沈Q ID NO :14所示的LCDR3。
[0077] 实施例3.单链抗体的重组表达及纯化
[0078] 根据实施例2中测序结果，分别将杂交瘤细胞株C24及C32的抗体重链及轻链可 变区之间加入连接肤（GGGG巧3,引入六个组氨酸，并将其全基因按照毕赤酵母表达系统的 偏爱性进行密码子优化的方法，进行单链抗体的重组表达。所表达得到的抗体分别命名为 抗体A24和抗体A32,其结构组成如附图2所示。上述单链抗体的重组表达具有如下： 阳0巧]1.融合蛋白基因的表达质粒构建
[0080] 密码子优化后的抗体A24的基因序列如SEQ ID NO: 19所示、氨基酸序列如SEQ ID N0:17所示；密码子优化后的抗体A32的核巧酸序列如SEQ ID N0:20所示、氨基酸 序列如SEQ ID N0:18所示。将优化后的抗体A24及A32全基因合成的片段上游引入 pPICZ a A载体中化Ol序列后DNA序列，下游引入甜al酶切位点，构建到PMD19-T Simple Vector质粒（购自Invitrogen公司）中，得到一种长期保存质粒，质粒记为pMD19-A24、 PMD19-A32。进行PCR扩增，其中上游引物Pl为CGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GAC ;下游引物 P2为：AGCGGATAACAATTTCACACAGGA。常规PCR程序后，琼脂糖凝胶电泳分析（附图3)，显 示两种产物大小与预期大小（79化p、8(K)bp) -致。将PCR获得基因产物回收纯化后，采 用）(h〇U#R0146S，购自化W ^igland Biol油S 公司）和甜aU#R0145V,购自化W ^igland Biol油S公司）双酶切，用T4连接酶连接到pPICZaA(V19520,购自Invitrogen)质粒中， 转化到D册a感受态细胞中，在含有Zeocin巧250-01，购自Invitrogen公司）的LB平板中 37°C培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到抗体A24 及A32的表达质粒，分别记为pPICZ a -A24、pPICZ a -A24。
[0081] 2.融合蛋白基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达
[0082] 毕赤酵母感受态细胞、YPDS固体培养基、BMGY培养基、BMMY培养基：均购自 Invitrogen 公司。
[0083] 将pPICZ a -A24及pPICZ a -A32质粒，用SacI限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉 淀后将线性化载体，分别电转化进入到X-33感受态酵母细胞，分别涂布到含有Zeocin的 YPDS固体培养基，30°C培养3-5天，就有阳性克隆产生。
[0084] 挑取上述获得的单克隆于5mL BMGY培养基中，30°C培养至ODe。。= 2. 0~6. 0时， 取ImL保存菌种，并将剩余菌液重悬后转移到BMMY中小量诱导表达，每隔24h补加甲醇至 终浓度为1 % (v/v)。一周后，离屯、收集菌液上清，通过SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白免疫印迹 分析（Western blot)，观察目标蛋白表达情况（附图4) oWestern blot中一抗为抗HlS-hg 抗体化S-化g(2A8)Mouse mAb，M20001，购于艾比玛特生物医药（上海）有限公司）。
[00化]将上述获得的A24及A32重组融合蛋白基因工程菌株分别接种于BMGY培养基中， 30°C，220巧m培养至菌体密度到ODe。。= 2. 0~6. 0,每隔24小时补加甲醇至终浓度为1. 0% (v/v)。一周后，收集发酵培养液。
[0086] 3.融合蛋白纯化
[0087] 采用组氨酸标签亲和柱纯化抗体A24及抗体A32融合蛋白，预装柱子选择为 HisTrap HP，具体步骤如下：
[0088] (1)发酵液的除杂预处理：将上述表达得到抗体A24及A32融合蛋白发酵液上 清，离屯、收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为SOOmM化Cl, 20mM NaHzPCV IOmM Imidazole，调抑7. 5,0. 45 Ji m 滤膜过滤。
[0089] (2)HisTrap HP亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统（AKTA avantl50,购自 GE healcare公司）对预处理获得的抗体A24及抗体A32融合蛋白发酵液进行亲和纯化， 柱子为Hishap HP(17-5248-02,购自GE healcare公司）。结合缓冲液为300mM化Cl, 20mM 化HzPCVlOmM Imidazole,抑7. 5,洗脱缓冲液为 SOOmM NaClJOmM 化HzPCVSOOmM Imidazole, pH7. 5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。通过SDS-PAGE电泳鉴定纯 度，由附图5可知，两种纯化后的蛋白纯度均达到95% W上；合并符合要求的收集管，更换 缓冲液为PBS溶液并超滤浓缩（Img/ml)，过滤除菌于-20°C保存备用。
[0090] 本领域技术人员知晓，重组蛋白可W不带标签，也可带其他标签，也可加入其他形 式的连接肤。无论是否带标签或者带不同形式的标签都可采用Capto L纯化。
[0091] 实施例4.抗体的性能评价
[0092] 1.抗体 A24 及 A32 的 Western blot 鉴定
[0093] a.聚丙締酷胺凝胶电泳：配置12%分离胶、5%浓缩胶，分别上样标准蛋白质、尤 瑞克林扣K)、毕赤酵母表达MQ、大肠杆菌表达hKl W及CHO系统表达MQ，恒压下电泳1小 时；
[0094] b.转膜：恒流（35mA/膜）条件下转膜1小时，将两块聚丙締酷胺凝胶上的蛋白质 分别转移至两张硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色， 观察蛋白的残留情况； 阳0河 C.封闭：含5%脱脂奶的TBST缓冲液封闭（封闭液），4°C过夜；封闭后洗涂液 灯BST，详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涂一次，10分钟； W96] d.抗原抗体反应：封闭液稀释（按1:400体积比）辣根过氧化物酶标记 A24(A24-HRP，lmg/mU本公司采用经典过舰酸钢法标记，下同）及辣根过氧化物酶标记 A32 (A32-HRP，Img/mU本公司采用经典过舰酸钢法标记，下同），分别加入上述两张硝酸纤 维素膜中，室溫反应1小时；TBST洗涂5次，每次10分钟；
[0097] e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，每张硝酸纤维素膜分别加入2血 稳定型过氧化物酶溶液（ImL)与鲁米诺/增强剂溶液（ImL)的混合液（购买于化ermo公 司），均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室溫避光反应一分钟后于凝胶成像系统（购买于GE公 司）拍照，留取结果。
[0098] 实验结果（附图6)表明，本发明两种抗体均可与四种来源的MQ反应，证明了本 发明两种抗体的反应性，且证明其与天然MQ均有较好的反应。另外，实验结果可见，四种 来源MQ的分子量均与理论值相符：UK为天然此1，糖基化程度最高，故其分子量最大；大 肠杆菌表达hKl糖基化程度最低，故分子量最小；CHO系统表达hKl糖基化程度稍低于天然 蛋白但高于酵母表达MQ，故其分子量介于UK及酵母表达MQ之间。
[0099] 2.抗体A24及A32在ELISA检测平台的性能评价
[0100] 将上述制备例中抗体进行配对组合，分别作为包被抗体或标记抗体进行配对检测 标准品，检测步骤如下： 阳W] 1)采用20mM PH7. 4的PB缓冲液将YO (非相关单链抗体，作为阴性对照，制备方法 参加
【申请人】在先申请：201410020156. 6)、A24或A32 (作为包被抗体）分别稀释至8ug/mL， 分装至酶标板中（lOOuL/孔），4°C，过夜（16小时）；
[0102] 2)PBST(含 0. 05% Tween-20 的 20mM PB7. 4,下同）洗涂一次（200uL/ 孔）后拍 干； 阳1〇引如封闭液（含质量体积比为2% BSA的PBST)封闭（200uL/孔），37°C，2小时；弃 去封闭液后拍干；
[0104] 4)样本稀释液稀释标准品，至浓度（ng/mL)为200、100及0。分别将上述浓度溶 液加入至步骤3)获得的包被有A24及A32的酶标板中（lOOuL/孔），37°C反应1小时；PBST 洗涂5次（200uL/孔）后拍干； 阳105] 5)按照1:2000体积比稀释HRP标记A24 (A24-HRP)或A32 (A32-HRP)(作为标记抗 体）；向步骤4)所获酶标板中分别加入稀释的A32-HRP或A24-HRP，37°C反应30分钟；PBST 洗涂5次后拍干； 阳106] 6)加入TMB显色液（购买于湖州英创公司），IOOuL/孔，37°C反应15分钟； 阳1〇7] 7)加入2M H2SO4终止液，50uL/孔，立即于酶标仪（购买于Thermo公司）读取 孤450。 阳108] 结果如下表： 阳 109]
[0110] 由上述结果可知，A32、A24组成的双抗体夹屯、检测系统可应用于酶联免疫检测平 台，且A24 (包被）-A32 (标记），A32 (包被）-A24 (标记）两种配对均有较好的检测效果。 与非相关抗体无非特异性反应。 阳111] 3.抗体A24及A32在胶体金检测平台的评价
[0112] 用样本稀释液稀释标准品至浓度为20化g/ml，10化g/ml，将运两个浓度和 0. 025mol/L pH7. 5的PBS分别添加50uL到胶体金检测卡中（A24包被-A32标记或A32包 被-A24标记，具体制备参见实施例6)，IO-ISmin内将检测卡放在读数仪上进行检测。检测 结果如下： 阳11引
[0114] 上述结果可见，A32、A24组成的双抗体夹屯、检测系统可应用于胶体金检测平台，且 A24 (包被）-A32 (标记），A32 (包被）-A24 (标记）两种配对均有较好的检测效果。
[0115] 4.抗体A24及A32在时间分辨巧光检测平台的评价
[0116] 用0. 025mol/L pH7. 5的PBS将A24或A32稀释至Img/ml，划线于硝酸纤维素膜 上；用0. 05mol/L P册.0的棚酸缓冲液将时间分辨巧光微球标记的A32或A24稀释20倍， 喷点于结合垫上；按附图9所示贴膜、切条、装卡（具体制备参见实施例7)。将检测卡分别 检测浓度含量为200、l(K)ng/ml的标准品和0. 025mol/L pH7. 5的PBS，检测结果如下： 阳117]
[0118] 由上述结果可知，A32、A24组成的双抗体夹屯、检测系统可应用于时间分辨巧光检 测平台，且A24 (包被）-A32 (标记），A32 (包被）-A24 (标记）两种配对均有较好的检测效 果。
[0119] 实施例5.抗体A24及A32在酶联免疫定量检测试剂盒中的应用
[0120] 本检测方法采用双抗体夹屯、法的原理。
[0121] 1.材料：
[0122] 包被缓冲液：0. 02M PH7. 4的PB缓冲液；封闭液：含2% BSA(质量体积比，下同） 的PBST缓冲液；洗涂液：PBST缓冲液；样本稀释液：含1% BSA、0. 5%酪蛋白、5%山羊血 清、0. 02% Procline 300及0. 05% Tween-20的憐酸盐缓冲液（PH7. 4);标准品：C册系统 表达重组hKl (Img/mL，制备方法见专利201310746269. X);显色液：TMB (购买于湖州英创公 司）；终止液：2M H2SO4。 阳123] 2.仪器：
[0124] 酶标仪（购买于化ermo公司），通用型微生物培养箱（购买于化ermo公司），全 自动洗板机（购买于深圳汇松公司） 阳125] 3.方法： 阳1%] (1)检测板的制备：包被缓冲液将抗体A24稀释至8ug/mL，IOOuL/孔加入至酶标 板中，4°C放置过夜（16小时）；PBST洗涂一次后拍干；200uL/孔封闭液封闭，37°C放置2小 时后拍干，抽干过夜（16小时），侣锥袋真空包装，4°C保存备用； 阳127] (2)样本稀释液的制备：含1% BSA、0. 5%酪蛋白、5%山羊血清、0. 02% Procline 300及0. 05% Tween-20的憐酸盐缓冲液（20mM，PH7. 4)，按照上述成分比例配置样本稀释 液，于4°C保存备用；
[0128] (3)标准品的制备：将IOuL标准品加入至19. 99血样本稀释液中，充分混匀后于 4 °C保存备用；
[0129] (4)检测液的制备：将辣根过氧化物酶（HR巧偶联至抗体A32 (A32-HRP，Img/ml); 将加 L A32-HRP加入至9. 995mL的样本稀释液中，充分混匀后于4°C保存备用.
[0130] 4.人激肤释放酶1酶联免疫检测试剂盒的使用方法 阳131] (1)于4°C取出真空包装的检测酶标板及相关试剂于室溫平衡后备用；
[0132] (2)标准品的稀释：将IOuL标准品加入至490uL样本稀释液中，充分混匀后即得 IOng/血标准品溶液；将IOng/血标准品溶液倍比稀释，分别获得终浓度（ng/mL)为5、2. 5、 1. 25、0. 625、0. 3125、0. 15625及0. 078125的标准品溶液；W样本稀释液为阴性对照，即 On邑/mL ; 阳133] (3)酶标板中分别加入50uL/孔的样本稀释液；再向酶标板中加入标准品、阴性对 照W及待检样本巧Oul/孔）；37°C放置60分钟；PBST洗涂5次后拍干； 阳134] (4)检测孔中加入检测液，IOOuL/孔，37°C放置30分钟；PBST洗涂5次后拍干； 阳13引 妨检测孔中加入显色液，IOOuL/孔，37°C放置15分钟；
[0136] (6)检测孔中加入终止液，50uL/孔，立即于酶标仪读取0D450。
[0137] 按照标准品各浓度对应的0D450读值，采用化rveExpert 1. 3软件W浓度为横坐 标，OD值为纵坐标进行标准曲线的绘制，获得标准曲线方程；将检测样本的OD值代入标准 曲线方程后计算出待检样本的浓度（ng/mL)。 阳13引 5.检测性能评价：
[0139] 根据上述检测条件进行本发明所述检测方法的性能评价。
[0140] (1)添加回收率： 阳141] 回收率是验证检测准确性的指标，遂本发明对基于A24及A32的检测试剂盒进行 添加回收率的验证。
[0142] 将20份血浆混合后获得混合血浆，采用本发明的方法测量混合血浆B中的MQ含 量为Co;将浓度分别为5ng/mL、2. 5ng/mL、1. 25ng/mL W及0. 625ng/mL的标准品（A液）加 入到混合血浆B中，所加入A液与血浆B之间的体积比为1:9,根据公式（1)计算出各个添 加量的回收率。 阳 14引
-......................................................(!) 阳144] 式中：R为回收率； 阳145] V为加入A液的体积； 阳146] V。为混合血浆样本B的体积； 阳147] C为混合血浆样本B加入A液后的检测浓度； 阳148] C。为血浆样本B的检测浓度； 阳149] Cs为A液的浓度。
[0150] 本发明检测标准曲线（附图7)可见，该检测具有良好的线性关系（r = 0. 99)且 具有高灵敏度（156pg/mL)及阴性本底值（OD = 0. 0525)。根据上述添加回收率计算方法， 计算结果见下表：
[0151]
阳152] 表中可见，上述四个浓度添加回收率平均值为101. 17%，各浓度添加回收率与回 收率均值相差小于等于8. 29%，证明本检测方法准确性高。 阳153] 似特异性：
[0154] 经蛋白序列比对可见，人组织激肤释放酶1与人组织激肤释放酶家族中的人组织 激肤释放酶2化LK2)及人组织激肤释放酶3化LK3)的同源性分别达到66%及60%，遂本实 验主要考察本发明所建立的检测方法对KLK2及KLK3的检测特异性。检测方法如上所述， 分别加入样本稀释液梯度稀释后的尤瑞克林扣K)，KLK2 (购买于R&D公司）及KLK3 (购买 于R&D公司），最终检测该检测方法的特异性。检测结果（附图8)可见，本发明所述的人组 织激肤释放酶1酶联免疫定量检测法特异性好。
[0155] 做重复性
[0156] 将S份具有代表性的血浆样本分别重复检测10次，计算10次测量结果的平均值 M和标准差SD，根据公式CV = SD/MX100%得出变异系数CV，结果如下： 阳 157]
阳15引上述结果可见，S份血浆检测CV<10%，本发明ELISA检测试剂盒具有较好的重复 性。
[0159] 6.本发明尝试多种试剂盒制备方法，下表展示几种不同制备方式（表中未列出的 步骤、参数等同本实施例所述）及相应试剂盒的检测性能。
[0160]
阳161] 实施例6.抗人组织激肤释放酶I的胶体金免疫检测卡的制备
[0162] 1.胶体金的标记
[0163] 抗体A32的胶体金标记：用K2CO3调节胶体金抑值（每1ml胶体金中加入加 L 0. 2M K2CO3)，向胶体金溶液中缓慢加入W 0. 2M的PBS稀释的抗体A32 (每1ml胶体金中加 入30ug抗体A32)，低速揽拌30分钟；加入封闭液（1% BSA)至其终浓度为10% (质量百 分比），揽拌20分钟；静置30min后1200化pm离屯、30min ;去上清用金标抗体复溶液0.0 lM PB PH7. 4+1% BSA+0. 025% Tween 20巧％薦糖）复溶即得胶体金标记的A32抗体。
[0164] 2.金标垫及反应膜制备
[01化]将A32金标抗体稀释好后，喷涂在金标垫6上，干燥备用；将抗体A24和抗化S标 签抗体分别用包被抗体稀释液（3%甲醇巧5mM PBS缓冲液（pH7. 5))稀释好后，分别包被在 反应膜2 (硝酸纤维素膜）的T线5, C线4位置，干燥后备用。
[0166] 3.贴膜、切膜、组装 阳167] 将样品垫1、金标垫6、包被有抗体的硝酸纤维素膜2、吸水垫3从左至右依次设置 (如图9所示），且两两之间应少许接触，所述包被有抗体的硝酸纤维素膜的T线5在左、C 线4在右，并根据外壳大小进行切割，装入外壳，完成检测卡制备。 阳1側 4.试剂盒组装 阳169] 将组装好的检测卡，干燥剂，滴管装入侣锥袋中，热封机封口，贴标签。
[0170] 5.抗人组织激肤释放酶1的胶体金免疫检测卡的使用方法 阳17U 1)样本稀释液（IOmM PH7. 4的PB缓冲液）恢复至室溫，震荡混匀备用； 阳172] 2)检测样本稀释：在洁净的离屯、管加入1血样本稀释液，再精确吸取IOii L血清/ 血浆样本，加入到离屯、管中，振荡充分混匀。 阳173] 3)加样及判读：用移液枪吸取50 iiL稀释后的样本慢慢加入加样孔中，开始计时， 10~15分钟内将检测卡放置在读数仪上进行检测，仪器将对检测卡进行扫描，并将结果显 示在读数仪的屏幕上。超过15min钟判定，结果无效。
[0174] 6.抗人组织激肤释放酶1的胶体金免疫检测卡检测效果评估 阳175] 1)线性范围检测 阳176] 测定不同浓度的标准品（0. 125,0. 25,0. 5,1，2,4,8,16ng/ml)，绘制标准曲线，线 性检测范围，结果如附图10所示。检测卡灵敏度为0. 125ng/ml。 阳177] 2)重复性检测
[0178] 同一批次检测卡对lng/ml、4ng/ml样本进行重复检测10次，计算变异系数CV， 阳179] CV =标准差SD/平均数MX 100% 阳 180]
阳181] 3)准确度检测（添加回收率） 阳182] 用于评估该检测试剂盒准确测定加入纯分析物的能力。将混合血清分为体积相同 的3份，在其中2份中加入标准品，制成5ng/ml，1. 25ng/ml浓度的回收样本，在另一份样本 中加入同样量的无被测物的PH7. 4的PB缓冲液，制成基础样本。 阳 183]
[0184] 7.除上述最优制备方式外，本发明还尝试了多种制备方案，例如下表的4种制备 例： 阳化5]
阳187] 实施例7.人组织激肤释放酶1的时间分辨巧光免疫检测卡的制备
[0188] 本检测方法采用双抗体夹屯、免疫层析法的原理。
[0189] 1、溶液配制 阳 19〇] 0. 05mol/L P册.0 的棚酸缓冲液制备：取 0.1mol/L 的 HsBCyOml，用 0. 025mol/L 的 胞284〇7 ? 10&0调节抑至8.0,并定容至100ml，置于4。(：备用，有效期3个月。 阳1W] 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐巧DC，购自SIGMA公司）溶液制备： 1. 5姐DC加入100mL去离子水，配成水溶液置于4°C备用，有效期3个月。 阳192] 封闭液的制备：含10% BSA(所述百分比均为质量体积比），0. 05mol/L P册.0的 棚酸缓冲液，用0. 22um滤膜过滤，置于4°C备用，有效期7天。 阳193] 巧光抗体稀释液制备：含l%BSA，10%薦糖，0.025%吐溫-20,0.05mol/Lp册.0 的棚酸缓冲液，用0. 22um膜过滤，置于4°C备用，有效期7天。
[0194] 包被抗体稀释液制备：含1%薦糖，3%甲醇0. 025mol/L pH7. 5的PBS，用0. 22U膜 过滤，置于4°C备用，有效期7天。 阳1巧]样本稀释液：含0. 1 % BSA，0. 025 %吐溫-20,0.0 l %安替比林，0. 02 % proclin300,0. 05mol/L P册.0的棚酸缓冲液，10-30°C保存有效期1年。 阳196] 2、人组织激肤释放酶1巧光检测卡制备 阳197] 1)时间分辨巧光微球标记
[0198] A32抗体标记方法如下（W 500uL反应体系为例）：加400uL棚酸缓冲溶液于2ml 离屯、管中，加入IOOuL浓度1 %粒径200皿的空载巧光微球（购自Thermo公司），縱满振荡 混匀。再加入IOuLEDC溶液，室溫振荡15min。14000巧m 10°C离屯、lOmin，去上清，沉淀用 0. 5ml棚酸缓冲液溶解，超声分散，功率100W，时间Imin (超声3s间隔3s)。 阳199] 活化后的微球中加入浓度Img/ml的A32抗体50uL，250r/min20°C恒溫震荡反应 2h;加入55uL封闭液，恒溫震荡反应地。14000巧m 10°C离屯、15min，洗涂2次，去上清，沉 淀用0. 5ml棚酸缓冲液溶解，最后一次离屯、后沉淀用巧光抗体稀释液溶解并超声分散，置 于4°C恒溫保存。 阳200] 2)巧光结合垫的喷点 阳201] A32抗体巧光结合垫喷点方法如下：用巧光抗体稀释液将上述制备的A32巧光抗 体稀释20倍，喷点于整条结合垫上。 阳202] 3)硝酸纤维素膜的包被 阳203] 硝酸纤维素膜包被方法如下：取0. 5ml浓度4mg/ml的A24抗体，加到5ml刻度离 屯、管中，加包被抗体稀释液至1ml，包被于硝酸纤维素膜2的T线5位置。取0. 5ml浓度为 4mg/ml抗HIS抗体，加到离屯、管中，加包被抗体稀释液至1ml，包被于硝酸纤维素膜2的C 线4位置。
[0204] 4)贴膜、切条、装卡 阳205] 样品垫1、巧光结合垫6、包被有A24抗体的硝酸纤维素膜（反应膜）2、将吸水垫3 从左至右依次设置，且两两之间少许接触，所述硝酸纤维素膜的T线5在左、C线4在右（如 附图9所示），并根据卡壳大小进行切割，装入卡壳，完成检测卡制备。
[0206] W试剂盒组装 阳207] 取侣锥袋和干燥剂；打开热封机，预热；将检测卡、干燥剂装入侣锥袋中；用热封 机封好侣锥袋；贴上标签。 阳20引同时，
【申请人】也采用A24抗体做巧光标记、采用A32抗体包被在硝酸纤维素膜（反 应膜）2T线处，其余步骤、参数不变，进行巧光检测卡制备。 阳209] 3、人组织激肤释放酶1巧光检测卡的使用方法
[0210] 1)稀释待测样本：在洁净的离屯、管加入1血样本稀释液，再精确吸取IOy L血清/ 血浆样本，加入到离屯、管中，振荡充分混匀。 阳211] 2)加样及判读：用移液枪吸取50 iiL稀释后的样本慢慢加入加样孔中，开始计时， 10~15分钟内用巧光免疫层析仪定量判定结果。超过15分钟判定，结果无效。
[0212] 4、人组织激肤释放酶1巧光检测卡检测效果评估 阳21引 1)精密性：将A32 (包被）-A24 (标记）检测卡检测0. 25、l、4ng/ml的标准品各25 次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示S个浓度检测结果变异系数 CV<15%。
阳214] 阳215] 将八24(包| :表， 阳216] 阳217] 2)检测线性：将A32 (包被）-A24 (标记）检测卡检测不同浓度的标准品：0. 0625、 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、3211邑/1111，标准曲线及线性关系（如附图11)。检测卡检测灵 敏度为 〇.〇625ng/ml。
[0218] A24(包被）-A32(标记）检测卡灵敏度为0. 0625ng/ml。
[0219] 3)准确度一回收率：将A32(包被）-A24(标记）检测卡检测添加量分别为1、5、 20ng/ml的标准品，检测结果如下表。
阳220] 阳221] 将A24(包被 ：表， 阳。2] 阳223] 5、准确度方法学比对： 阳224] 上述结果显示A32 (包被）-A24 (标记）的检测卡性能较优，因此将其作方法学比 对验证。选择20份临床病人标本，按1到20的顺序编号，用ELISA(实施例5制备）和巧 光检测法同时进行实验，按照1，2, 3...... 18,19, 20, 20,19,18...... 3, 2,1的样本顺序进 行测定。ELISA和巧光检测法检测结果的相关系数r2= 0. 98,说明巧光检测法与化ISA检 测结果有较好的相关性（如附图12)。 阳225] 6、配方的对比： 阳226] 除上述最优制备例1夕F，
【申请人】还尝试多种制备方案，例如下面5组检测卡制备及 应用结果如下表： 阳227]
[0228] 在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可W作出 各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的 而非限制性的。
【主权项】
1. 人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应 膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体A32或A24,所述反应膜上有检测带 和质控带，检测带位置包被有抗体A24或A32 ; 所述抗体A24是抗人组织激肽释放酶1抗体，包括： 重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID N0:1所示的 HCDR1、如序列SEQ ID NO :2所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR3 ; 以及其轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO :4所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO :5所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :6所示的LCDR3 ; 所述抗体A32是抗人组织激肽释放酶1抗体，包括： 重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID N0:9所示的 HCDR1、如序列SEQ ID NO :10所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :11所示的HCDR3 ; 以及其轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID NO :12所示 的LCDR1、如序列SEQ ID NO :13所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :14所示的LCDR3。2. 根据权利要求1所述的人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，其特征 在于所述抗体A24重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，轻链可变区的氨基酸序 列如SEQ ID NO:8所示。3. 根据权利要求1所述的抗人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，其特 征是所述抗体A24为单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。4. 根据权利要求3所述的抗人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，其特 征是所述抗体A24中不含由六个组氨酸构成的HIS标签。5. 根据权利要求1所述的抗人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，其特 征是所述抗体A32重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示，轻链可变区的氨基酸序 列如SEQ ID NO: 16所示。6. 根据权利要求1所述的抗人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，其特 征是所述抗体A32为单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示。7. 根据权利要求6所述的抗人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，其特 征是所述抗体A32中不含由六个组氨酸构成的HIS标签。8. 根据权利要求6所述的抗人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，其特 征是胶体金颗粒标记的抗体的标记方法是：调节胶体金pH值，向胶体金溶液中加入以0. 2M 的PBS稀释的抗体，低速搅拌30分钟；加入封闭液BSA至其终浓度为10%，搅拌20分钟；静 置30min后12000rpm离心30min ;去上清用金标抗体复溶液复溶即得胶体金标记的抗体， 所述复溶液含？取.40.01]?的？8缓冲液、1%834、0.025%1￥661120和5%蔗糖。9. 根据权利要求6所述的抗人组织激肽释放酶1的胶体金免疫层析定量检测卡，其特 征是所述定量检测卡带有样本稀释液，所述样本稀释液是10mM PH7. 4的PB缓冲液。
【文档编号】C07K16/40GK105988004SQ201510050984
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月30日
【发明人】马永, 丁娜, 周恩昆, 张彦玉, 时振华, 徐春林, 陈飞, 陈一飞
【申请人】江苏众红生物工程创药研究院有限公司, 常州京森生物医药研究所有限公司