垫。
[0024]图2是人髓过氧化物酶(MPO)快速定量检测试剂盒的试纸卡对样本检测结果的显不O
【具体实施方式】
[0025]实施例:人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒制备及检测
[0026]1.主要材料
[0027]1.1MPO标准品:中检所；ΜΡ0特异性配对抗体、IgG抗体:北京盛齐杨桓科技有限公司产品;氯金酸:Sigma公司产品;硝酸纤维素(NC)膜:SART0RIUS (德国)，CN140，德国赛多利斯公司产品；牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇PEG20000、水解酪蛋白:Sigma产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
[0028]1.2临床样本由公司在相关医院获得，共200份，其中血清样本100份，血浆和全血样本各50份，MPO含量分布区间为6.25?400ng/ml之间的定值血清。
[0029]2.方法
[0030]2.1MPO抗体胶体金标记氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径为30?40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2MK2C03将溶液调到pH7.5、pH8.0和pH8.5。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每10ml溶液加入0.5mg、lmg、1.5mg将标记用MPO抗体缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2小时，再加入到终浓度为I %的PEG2000和1%的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000r/min离心，弃上清，沉淀按50%原体积复溶至不同配比的胶体金工作液中(PH8.0,含BSA，羊血清，蔗糖和表面活性剂)。然后将标记胶体金溶液按Iml溶液铺20cm2的比例加样于玻璃纤维膜或无纺布上，在温度20?25°C，相对湿度< 30%的干燥间干燥2?5小时，制成胶体金垫。
[0031]2.2NC膜包被用 0.0lM pH7.4PBS将包被MPO抗体稀释成 0.5mg/ml、lmg/ml、1.5mg/ml，羊抗鼠IgG分别稀释成lmg/ml、2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜上按1.2ul/cm进行分别划线包被，包被完成后将NC膜在温度20?25°C，相对湿度< 30%的干燥间干燥2?5小时。
[0032]2.3试纸卡组装在温度20?25°C，湿度小于40 %的干燥室内，取塑底板，将已包被的NC膜放置在塑料底板的中部粘贴，将胶体金垫裁切成合适的宽度，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫，搭胶体金垫的1/4粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫，搭胶体金垫的1/3粘贴；在NC膜C线一侧搭接吸样垫，搭吸样垫的1/10粘贴；最后用裁剪机将贴好塑料板切成3?5mm宽的试纸条，再装入塑料卡内，形成试纸卡。
[0033]2.4试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用MPO标准品对试剂进行测试，寻找最佳组合。
[0034]2.5比色卡制备和仪器曲线参数设置确定好试纸工艺参数后，分别用400、100、
6.25ng/ml的MPO标准品对试纸进行测定，不同浓度的标准品显示出不同条数的色带，将相应条数的色带印刷到比色卡上，完成比色卡制备。
[0035]2.6检测方法
[0036]I)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；
[0037]2)精确吸取10 μ I血清、血浆样本，样本为全血时吸取20ul，加入洁净的离心管中，用样本稀释液(PBS)进行10倍稀释，充分混匀；
[0038]3)用移液枪吸取1ul稀释后的样本加入到样本孔中，15?20分钟内用胶体金定量比色卡(半)定量判定结果；
[0039]4)用比色卡判定结果时，将试纸卡T线的条带及颜色和比色卡上标准线进行对比，半定量判定样品的浓度区间。
[0040]2.7临床样本检测试剂制备完成后，按检测方法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。
[0041]3 结果
[0042]3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0 ；MPO抗体最佳标记量为lmg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为20mM硼酸盐缓冲液，ρΗ8.0，含1% BSA、10%羊血清，2%蔗糖，0.2% Tween20 ;最佳包被MPO抗体浓度为1.5mg/ml ο检测结果的最佳判定时间为15?20分钟。但以上参数在制备不同批次产品时可能需要适当调整。
[0043]3.2临床样本检测对200份临床定值样本检测，用仪器定量判定结果时，在检测范围内的195份样品平均偏差值均小于15%，最大偏差小于20%，R2X).97，一致性系数>0.88。用比色卡判定结果时，区间判定结果和样本值的符合率为95.5%，一致性系数>0.85。检测结果表明制备的检测试剂盒性能良好，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。
【主权项】
1.一种人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒，其特征在于可以快速检测人血浆或血清中的MPO含量，以预警早期发生心肌梗塞的风险，所述试剂盒由试纸卡和比色卡构成，其中: 所述试纸卡结构为:在塑料底板(I) 一端粘贴上样垫(2)，所述上样垫(2)的一端紧密压接含有标记抗人髓过氧化物酶(MPO)特异性抗体的胶体金垫(3)，所述胶体金垫(3)的一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，所述硝酸纤维素NC膜(4)上包被有相互分离的检测线T (5、6、7)和质控线C⑶，所述检测线T (5、6、7)为和标记抗体配对的定量MPO抗体，所述质控线C (8)为IgG抗体，所述硝酸纤维素NC膜(4)的另一端连接吸样垫(9)形成试纸条，所述试纸条装入塑料垫中形成所述试纸卡，所述定量MPO抗体是定量的MPO捕获抗体、可以对样品中的MPO浓度进行定量区间检测，所述检测线T (5、6、7)有三条，分别对应6.25、100、400ng/ml 的 MPO 浓度。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述标记抗体为MPO抗体，分别识别人髓过氧化物酶的不同表位，该MPO抗体为纯化的人髓过氧化酶特异性单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述比色卡是白色背景上印有7条不同深浅红色线条，用于对检测结果的对比判断及定量判断，分别对应400、200、100、50、25、.12.5,6.25ng/ml 的 MPO 浓度。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述硝酸纤维素NC膜(4)为孔径5?.12 μ m的多孔样结构膜，所述上样垫(2)为玻璃纤维膜或无纺布，所述吸样垫(9)为吸水滤纸。
【专利摘要】本实用新型专利公开了一种人髓过氧化物酶(MPO)快速定量免疫层析检测试剂盒，试剂盒由试纸卡、比色卡组成。试纸卡结构为：在塑料底板(1)一端粘贴上样垫(2)，上样垫的一端紧密压接含有标记抗人髓过氧化物酶特异性抗体的胶体金垫(3)，胶体金垫一端紧密压接硝酸纤维素NC膜(4)，NC膜上包被有相互分离的检测线T(5)、(6)、(7)和质控线C(8)，T线为和标记抗体配对的定量的MPO抗体，C线为羊抗鼠IgG抗体，NC膜的另一端连接吸样垫(9)形成试纸，试纸装入塑料卡内形成试纸卡。检测时通过多条检测线与待检样品的定量结合，不需要任何仪器就可实现对人血清、血浆和全血样品中MPO的定量区间测定，具有操作简便、快速、适合现场检测和经济实用等特点，可对心肌梗塞进行早期快速预警。
【IPC分类】G01N33-577, G01N33-573
【公开号】CN204330777
【申请号】CN201420255861
【发明人】杨军, 胡文波, 李静
【申请人】江苏金标世纪生物科技有限公司, 胡文波, 杨军
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年5月19日