冲液的保存液复溶至原体积。
[0097]C、稀土荧光材料标记抗体的制备(I)
[0098]用6M HCl溶解Eu2O3,并用超纯水定容至终浓度lmg/ml，再用0.05MpH8.0NH4HCO3溶液稀释500倍。将BHHCT用无水乙醇溶解至终浓度10mg/ml。使用0.05-0.2M，pH9.0-9.5的碳酸盐标记缓冲液对肌酸激酶同工酶(CK-MB)第一抗体透析4-6次，或者超滤离心方式洗涤4-6次，调整浓度至0.25mg/mlo将BHHCT无水乙醇溶液以体积比1:200的比例加入第一抗体溶液中，室温避光持续混匀反应1-3小时。用0.05M pH8.0NH4HCO3溶液脱盐。使用Superdex200填料在l*30cm柱中纯化结合物，用0.1 % BSA溶液平衡1-3小时，用0.05MTris-HCl洗脱，流速为lml/min。根据280nm吸光度收集蛋白峰，用0.22 μ m滤器除菌过滤。再用0.05MTris-HCl稀释20倍，之后加入Eu3+的NH 4HC03溶液，按照体积比为1:5至1:15的比例添加，室温避光持续混匀反应1-2小时。用0.05M Tris-HCl以超滤离心方式清洗并浓缩至抗体浓度大于5mg/ml，备用ο
[0099]D、稀土荧光材料标记抗体的制备(2)
[0100]使用0.05M，pH4.5-5.0的2- (N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液洗涤的稀土铕荧光微球，加入碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使二者终浓度均为15-60mmol，室温反应20-30分钟，充分洗涤稀土铕荧光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂缓冲液复溶后加入透析过的第一抗体，使肌酸激酶同工酶(CK-MB)第一抗体与荧光微球的质量比为1:8至1:60，室温反应2小时后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸盐缓冲液室温封闭30分钟，充分洗涤稀土铕荧光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液的保存液复溶至原体积。
[0101 ] E、量子点标记抗体及稀土焚光材料标记抗体的混合
[0102]将本部分步骤B中制备的量子点标记抗体与步骤C或者步骤D中制备的稀土荧光材料标记抗体按抗体浓度为1:5至5:1的比例进行混匀，即制备获得联合量子点标记抗体与稀土荧光材料标记抗体的双标记混合物。
[0103]F、抗体结合垫III的制备
[0104]将本部分步骤E制备获得的量子点标记抗体与稀土荧光材料标记抗体的双标记混合物使用定量喷膜仪以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均匀喷涂于本部分步骤A中预处理过的玻璃纤维素膜或者聚酯膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时，加入干燥剂封存备用。
[0105]5)包被垫的制备
[0106]A、检测线(心肌肌钙蛋白I)的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将亲和素稀释到lmg/ml-5mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
[0107]B、检测线(肌红蛋白)的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将肌红蛋白第二抗体稀释到0.2mg/ml-4mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
[0108]C、检测线(肌酸激酶同工酶CK-MB)的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，pH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将肌酸激酶同工酶CK-MB第二抗体稀释到0.2mg/ml-4mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以1.2 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2-4小时。
[0109]D、质控线的制备:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将抗小鼠IgG稀释到0.5mg/ml-3mg/ml的浓度，使用定量喷膜仪以
0.8 μ 1/cm均匀喷涂于硝酸纤维素膜上，于35-39°C鼓风干燥箱中烘干2_4小时。
[0110]E、包被垫的制备:用封闭液(含有1-10% BSA和1-10%海藻糖的0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl缓冲液)将含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜封闭1_2小时，取出后置35-39?鼓风干燥箱中烘干2-4小时，封袋备用。6)试纸条的组装
[0111]在湿度小于30%，温度20-30°C条件下进行试纸条的组装。底板选用PVC材料，在底板同一面的方向顺次连接且相邻部位部分重叠的样品垫、抗体结合垫1、抗体结合垫I1、抗体结合垫II1、包被垫及吸水纸。在包被垫粘覆底板时，检测线的位置靠近抗体结合垫III，质控线的位置靠近吸水纸。组装好后裁剪成试纸条，并装于试纸卡内。
[0112]7)校准品及待检样品的测定
[0113]将100 μ I的标准品或者待检样品加入到加样孔，进行免疫层析反应，10-15分钟后将试纸卡置于专门的荧光检测仪中，通过读取荧光信号的大小进行定量测定。
[0114]以上实施例仅是为了清楚地说明所做的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上可以做出其他的改进和润饰，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申的显而易见的改进和润饰仍处在本实用新型的保护范围之内。
【主权项】
1.一种用于联合检测心肌肌钙蛋白1-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括依次搭接粘贴的以下部件: 1)用于接受来自全血、血浆或血清样品的样品垫； 2)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗心肌肌钙蛋白I的第一抗体以及由生物素标记的抗心肌肌钙蛋白I的第二抗体的抗体结合垫I，其中所述第一抗体和第二抗体分别特异性识别心肌肌钙蛋白I的不同表位； 3)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌红蛋白的第一抗体的抗体结合垫II ； 4)同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌酸激酶同工酶的第一抗体的抗体结合垫III ; 5)同时包被有相间隔的三条检测线和一条质控线的包被垫，其中所述三条检测线依次固定有亲和素、识别肌红蛋白不同表位的抗肌红蛋白的第二抗体及识别肌酸激酶同工酶不同表位的抗肌酸激酶同工酶的第二抗体，所述质控线固定有抗鼠IgG的抗体；和 6)用于提供检测所需的毛细作用力的吸水纸。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条进一步包括底板，其中所述底板上粘贴有依次搭接的样品垫、抗体结合垫1、抗体结合垫I1、抗体结合垫II1、包被垫和吸水纸。
3.如权利要求1的试纸条，其特征在于，所述量子点为微球形式且具有2nm-30nm的粒径范围，且所述量子点选自以下组中:CdTe、CdSe、PbSe、InP和GaN。
4.如权利要求1的试纸条，其特征在于，所述抗体结合垫1、11和/或III上进一步包被有微球，其中所述微球负载有所述稀土荧光材料和相应的抗体。
5.如权利要求4的试纸条，其特征在于，所述微球的粒径大小为50nm-400nm。
6.如权利要求5的试纸条，其特征在于，所述微球的粒径大小为100nm-300nm。
7.如权利要求6的试纸条，其特征在于，所述微球的粒径大小为10nm或300nm。
8.如权利要求1的试纸条，其特征在于，所述试纸条的宽度在0.2cm至0.5cm之间。
【专利摘要】本实用新型提供了一种用于联合检测心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的试纸条，包括样品垫；同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗心肌肌钙蛋白I的第一抗体以及由生物素标记的抗心肌肌钙蛋白I的第二抗体的抗体结合垫I；同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌红蛋白的第一抗体的抗体结合垫II；同时包被有由量子点和稀土荧光材料分别单独标记的抗肌酸激酶同工酶的第一抗体的抗体结合垫III；同时包被有相间隔的三条检测线和一条质控线的包被垫；和吸水纸。本实用新型的试纸条能够实现心肌肌钙蛋白I-肌红蛋白-肌酸激酶同工酶的三项联检，且具有灵敏度高，使用便捷等优点。
【IPC分类】G01N33-68, G01N21-64
【公开号】CN204405678
【申请号】CN201520103044
【发明人】李鼎锋, 宋芳, 朱世伟, 王义娜, 金凤, 戈军, 刘勇
【申请人】北京安百胜生物科技有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年2月12日