检测前列腺癌相关融合基因的胶体金试纸的制作方法

检测前列腺癌相关融合基因的胶体金试纸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及检测前列腺癌相关融合基因的胶体金试纸，属于医学生物技术领 域。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌（prostatecancer,PCa)位居男性好发肿瘤中第一位，在男性肿瘤死亡 率中位居第二。随着我们国家人口老龄化，PCa的发病率正逐年上升，成为威胁我国男性健 康的公共问题。
[0003] 基因融合是染色体重排导致的两个基因的融合，常见于肿瘤中。TMPRSS2-ERG基因 融合是前列腺癌中最常出现的基因融合类型。TMPRSS2-ERG融合基因是在PCa中特异存在 的，在血浆、前列腺液和尿液中检测这种DNA重组可用来筛查PCa。
[0004] 目前检测TMPRSS2-ERG融合基因的方法包括荧光原位杂交（FISH)、RT-PCR检测和 测序技术。FISH方法耗时并且技术要求高，RT-PCR容易受到RNA降解影响检测敏感性，而 测序技术因价格昂贵尚未普及。因此有必要开发一种容易操作、价格适中、检测敏感性高的 检测试剂。 【实用新型内容】
[0005] 本实用新型要解决的技术问题是提供检测前列腺癌相关融合基因的胶体金试纸。
[0006] 为实现上述目的，本实用新型采用以下设计方案：
[0007] -种检测前列腺癌相关融合基因的胶体金试纸，由载体、硝酸纤维膜、胶体金结合 物垫、样品垫和吸收垫组成，其中硝酸纤维膜上设有对照线和检测线，硝酸纤维膜的一端设 有胶体金结合物垫和样品垫，另一端设有吸收垫。
[0008] 所述胶体金结合物垫为红色胶体金标记TMPRSS2-ERG融合蛋白单克隆抗体的胶 体金结合物垫。
[0009] 所述单克隆抗体为杂交瘤细胞株4F2,CGMCCNo. 7051表达的单克隆抗体。
[0010] 本实用新型选择TMPRSS2-ERG融合基因表达蛋白序列作为抗原，采用杂交瘤技 术，以该抗原免疫小鼠，对杂交瘤细胞表达产物进行筛选和验证，得到表达强特异性的单 克隆抗体的细胞株。抗原蛋白购自艾比玛特生物医药（上海）有限公司。蛋白名称： TMPRSS2-ERGPCa融合基因表达的dERG((N-terminaltruncatedERG)(切除顶端的ERG 蛋白））蛋白；种属：Homosapiens;蛋白定位：PCa上皮细胞；NCBINumber:ACA81385. 1〇
[0011] 杂交瘤细胞株4F2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地 址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2012年12月24日，名称为杂交瘤细 胞，保藏号为CGMCCNo. 7051。该细胞株表达抗TMPRSS2-ERG融合基因表达的dERG蛋白 ((N-terminaltruncatedERG)(切除顶端的ERG蛋白））的单克隆抗体。
[0012] 胶体金标记单克隆抗体为本领域常规方法：将1 %氯金酸30ml、2%柠檬酸三钠 18ml、双蒸水720混合加热，加入胶体金，加入单克隆抗体包被，离心，得到胶体金标记的单 克隆抗体；用吸水玻璃纤维纸吸收胶体金包被的单克隆抗体并干燥，既可用于制备。
[0013] 所述对照线为包被羊抗鼠IgG多克隆抗体。
[0014] 所述检测线为包被合成抗原。（TMPRSS2-ERG截短的多肽，委托Abmart合成）
[0015] 所述样品垫为玻璃纤维材质。
[0016] 所述吸收垫为棉浆板。
[0017] 本实用新型基于胶体金的免疫层析原理，使用竞争法：
[0018] 当待测物中有被测的抗原物质（即TMPRSS2-ERG融合蛋白）时，待测物中的抗原 物质就会与标记胶体金的融合蛋白单克隆抗体形成Ag-Ab-Au(抗原-抗体-胶体金）复合 物，复合物在虹吸作用下沿硝酸纤维素膜向上层析，不与包被在硝酸纤维素膜上的合成融 合蛋白免疫原结合，仅会在对照线处出现一条色带（C线），结果为阳性，说明被检测的样品 中含有融合蛋白。
[0019]当待测物质中没有被测的抗原物质时，标记胶体金的融合蛋白单克隆抗体就会与 包被在硝酸纤维素膜上的融合蛋白合成免疫原结合，形成Ag-Ab-Au复合物，此时检测线处 可看到一条明显色带（T线，检测线），因此当检测试纸上可看到两条线（C线和T线）时，结 果为阴性，说明被检测的样品未含融合蛋白。
[0020] 基于胶体金免疫层析法原理，使用竞争法。重组抗原包被于硝酸纤维素膜的检测 线21位置，抗体包被于对照线22位置。检测时样本中的抗原与胶体金标记的抗体结合，混 合物在虹吸作用下沿硝酸纤维素膜向上层析，与膜上检测线21的重组抗原发生与抗体竞 争反应，根据竞争法原理，T线位置不会形成红色条带，相反阴性样本则会在T线位置形成 红色条带。无论样本抗原存在与否，混合物在沿膜向上层析到达对照线C线位置时，均会出 现红色条带，此红色条带表示样本量充分，流动正确且试剂有效。
[0021] 胶体金试纸的使用方法：
[0022] 1.备检样品、试纸条及其他所用器材在使用前均应平衡至室温（20_25°C);
[0023] 2.除去试剂盒外包装，标明备件样品和对照品，试纸条应在1小时内使用，尤其是 在温度高于30°C或者湿度很高的环境中应尽快使用。
[0024] 3.吸取50微升的样品，滴加于试纸条加样处，平放在桌面后计时。
[0025] 4.推荐在加样后5-8分钟内读取结果，8分钟后读取结果无效。
[0026] 检验结果的解释
[0027] 1.阳性：仅在对照线22 (C线）出现一条红色条带，初步检测结果为待测样本中待 检成分为阳性。
[0028] 2.阴性：在检测线21(T线）及对照线22(C线）各出现一条红色条带，初步检测 结果为待测样本中待检成分为阴性，建议进行其他方法检测。
[0029] 3?无效：对照线22 (C线）无条带出现。
[0030] 本实用新型的优点是：本实用新型提供了一种检测前列腺癌相关融合蛋白的胶体 金试纸，该试纸结构简单，使用方便，敏感性高，特异性强，价格低廉，能够快速检测出前列 腺癌相关TMPRSS2-ERG融合基因的表达产物。
[0031] 以下结合附图和【具体实施方式】详细说明本实用新型的设计方案，并不以此限定本 实用新型的实施范围。
【附图说明】
[0032] 图1为胶体金试纸的结构示意图
【具体实施方式】
[0033] 实施例1 :制备和筛选杂交瘤细胞株
[0034] 一 .材料
[0035] 细胞株：RWPE_1，PC3, LNcap，Vcap，购于ATCC
[0036] R1881 :人工合成的雄激素类似物，用于诱导融合基因TMPRSS2-ERG的高表达。 lOOyMR1881配制：称取0. 284mgR1881，溶于10mLDMS0，lmL枪头反复吹打至溶解，分装于 1. 5mLEP管，-20°C保存，使用终浓度为10-100nM。
[0037] 主要抗体：ERG抗体购自Abeam公司，山羊抗小鼠IgG-HRP和山羊抗