本发明涉及一种磁性微球，尤其涉及一种镍化磁性微球及其制备方法和其应用。
背景技术：
：目前用于his标签蛋白纯化的主要是商品化的具有一定交联度的多孔琼脂糖微球，其具有高的表面积的，其可蛋白质相互接触，并可以容纳大量的液体。但是在纯化大量蛋白的时候，这种多孔的结构也会带来一些问题，如：1)抗体被困在孔内，难以洗去，因此需要大量的洗涤来降低背景；2)免疫沉淀的洗涤是在微量离心管中进行的，液体之间的交换通过移液枪来完成，很容易丢失样品。3)微球上的抗体与目标蛋白接触的慢，需要长的孵育时间。4)长的孵育时间及大量的洗涤导致目标蛋白的机械及生物(蛋白酶水解)损失。近年来，磁分离技术被广泛应用于生物分离纯化的各个领域。磁分离技术不仅可以通过外加磁场进行简单的分离，而且磁性基质表面容易功能化，其在实际的生物应用领域易于修饰，研究和应用越来越广泛。磁性微球在his标签蛋白的纯化和分离方面也有一定的潜在应用，目前也开发一系列商品。但其主要是在传统琼脂糖微球的基础上负载一定量磁性物质，其制备繁琐，且微球结构和性能不均一。技术实现要素：针对现有的磁分离技术存在的上述问题，现提供一种镍化磁性微球及其制备方法和其应用，旨在提供一种结构和性能均一的镍化磁性微球。具体技术方案如下：本发明的第一个方面是提供一种镍化磁性微球的制备方法，具有这样的特征，包括如下步骤：1)、向磁性基质中加入0.01mol/l强酸溶液，在超声条件下活化处理20-40min，磁分离后用超纯水将磁性基质洗涤至中性，再向分离出的经强酸活化过的磁性基质中依次加入无水醇、超纯水、25wt％氨水和正硅酸烷基酯，超声反应2-5h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到磁性二氧化硅微球，磁性基质、强酸、无水醇、超纯水、氨水、正硅酸烷基酯的用量比为1g:10-40ml:80-160ml:20-80ml:0.4-1.6ml:0.5-4ml；2)、向磁性二氧化硅微球中依次加入无水醇、超纯水、25wt％氨水和kh-560超声反应2-5h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到环氧化磁性二氧化硅微球，磁性二氧化硅微球、无水醇、超纯水、氨水、kh-560的用量比为1g::80-160ml:20-80ml:0.4-1.6ml:0.5-4ml；3)、将亚氨基二乙酸溶解于1mol/l的第一碱溶液中，并用饱和第二碱溶液调节其ph＝11-12，加入环氧化磁性二氧化硅微球，室温下反应6-12h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到羧基化化磁性二氧化硅微球，亚氨基二乙酸、第一碱溶液、环氧化磁性二氧化硅微球的用量比为2-4g:10-30ml:2-6g；4)、将羧基化磁性二氧化硅微球超声分散于0.5mol/l镍盐的水溶液中，然后室温搅拌反应24-48h后，磁分离后用超纯水洗涤至中性，真空干燥后即得镍化磁性微球，羧基化磁性二氧化硅微球与镍盐的水溶液的用量比为1g:100ml。上述的制备方法，还具有这样的特征，磁性基质选自fe3o4、α-fe2o3、γ-fe2o3、铁、钴、镍、mnfe2o4、mgfe2o4、cofe2o4、copt3或fept合金中的一种。上述的制备方法，还具有这样的特征，强酸溶液选自盐酸、硝酸、硫酸中的一种。上述的制备方法，还具有这样的特征，正硅酸烷基酯选自正硅酸甲酯或正硅酸乙酯中的一种，优选为正硅酸乙酯。上述的制备方法，还具有这样的特征，无水醇选自无水甲醇、无水乙醇或无水异丙醇中的一种。上述的制备方法，还具有这样的特征，第一碱溶液和第二碱溶液中碱分别独立地选自碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种。上述的制备方法，还具有这样的特征，镍盐选自氯化镍、硫酸镍或硝酸镍中的一种。本发明中超声用超声风散器功率为100-500w，氨水浓度为25wt％。本发明的第二个方面是提供一种利用上述制备方法制备获得的镍化磁性微球。本发明的第三个方面是提供一种上述镍化磁性微球的应用，具有这样的特征，镍化磁性微球制备后无需额外装饰可直接应用于his标签蛋白的分离纯化。上述方案的有益效果是：本发明采用溶胶-凝胶法制备了以磁性基质颗粒为核，以正硅酸乙酯作硅源并反应成壳的磁性二氧化硅微球，以此微球作模板经环氧硅烷偶联剂kh-560以及亚氨基二乙酸修饰后形成的配体为络合剂，螯合金属镍离子，制备成表面螯合镍离子的磁性二氧化硅微球。本发明采用亚氨基二乙酸修饰磁性二氧化硅微球，可以为金属镍离子提供多个配位点，不仅保证了修饰微球与金属镍离子的作用力较强，同时金属离子未饱和的配位点可以与蛋白质作用，从而实现表面螯合金属镍离子的磁性二氧化硅微球分离溶液中的蛋白质。具体实施方式下面将结合本发明实施例中对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。实施例1一种镍化磁性微球，其制备包括如下步骤：1)、称取1gfe3o4颗粒，加入10ml0.01mol/l盐酸溶液，在超声条件下活化处理20min(超声分散功率100w)，磁分离后用超纯水将fe3o4颗粒洗涤至中性，再向盐酸活化过的fe3o4颗粒中依次加入80ml无水乙醇、20ml超纯水、0.4ml25wt％氨水和0.5ml正硅酸乙酯，超声反应2h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到磁性二氧化硅微球；2)、称取1g由步骤1)制备获得的磁性二氧化硅微球，依次加入80ml无水乙醇、20ml超纯水、0.4ml氨水和0.5mlkh-560超声反应2h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到环氧化磁性二氧化硅微球；3)、称取2g亚氨基二乙酸溶解于10ml1mol/l的碳酸钠溶液，并用饱和氢氧化钠溶液调节其ph＝11，加入2g由步骤2)制备获得的环氧化磁性二氧化硅微球，室温下搅拌反应6h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到羧基化化磁性二氧化硅微球；4)、称取1g由步骤3)制备获得的羧基化磁性二氧化硅微球，超声分散于100ml0.5mol/l氯化镍水溶液中，然后室温搅拌反应24h后，磁分离后用超纯水洗涤至中性，真空干燥后即得一种可应用于his标签蛋白纯化的镍化磁性微球。实施例21)、称取1gα-fe2o3颗粒，加入30ml0.01mol/l盐酸溶液，在超声条件下活化处理30min(超声分散功率300w)，磁分离后用超纯水将fe3o4颗粒洗涤至中性，再向盐酸活化过的fe3o4颗粒中依次加入130ml无水乙醇、50ml超纯水、0.7ml25wt％氨水和2ml正硅酸乙酯，超声反应2.5h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到磁性二氧化硅微球；2)、称取1g由步骤1)制备获得的磁性二氧化硅微球，依次加入130ml无水乙醇、60ml超纯水、1.1ml25wt％氨水和0.9ml硅烷偶联剂kh-560超声反应3h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到环氧化磁性二氧化硅微球；3)、称取3g亚氨基二乙酸溶解于20ml1mol/l碳酸钾水溶液，并用饱和氢氧化钾溶液调节其ph＝11.5，加入4g由步骤2)制备获得的环氧化磁性二氧化硅微球，室温下反应8h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到羧基化化磁性二氧化硅微球；4)、称取1g由步骤3)制备获得的羧基化磁性二氧化硅微球，超声分散于100ml0.5mol/l氯化镍的水溶液中，然后室温搅拌反应32h后，磁分离后用超纯水洗涤至中性，真空干燥后即得一种可应用于his标签蛋白纯化的镍化磁性微球。实施例31)、称取1gmgfe2o4颗粒，加入40ml0.01mol/l盐酸溶液，在超声条件下活化处理40min(超声分散功率500w)，磁分离后用超纯水将fe3o4颗粒洗涤至中性，再向盐酸活化过的磁性基质中依次加入160ml无水乙醇、80ml超纯水、1.6ml25wt％氨水和4ml正硅酸乙酯，超声反应5h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到磁性二氧化硅微球；2)、称取1g由步骤1)制备获得的磁性二氧化硅微球，依次加入160ml无水乙醇、80ml超纯水、1.6ml25wt％氨水和4ml硅烷偶联剂kh-560超声反应5h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到环氧化磁性二氧化硅微球；3)、称取4g亚氨基二乙酸溶解于30ml1mol/l的碳酸钠水溶液，并用饱和氢氧化钠溶液调节其ph＝12，加入6g由步骤2)制备获得的环氧化磁性二氧化硅微球，室温下反12h，磁分离后用超纯水洗涤至中性得到羧基化化磁性二氧化硅微球；4)、称取1g由步骤3)制备获得的羧基化磁性二氧化硅微球，超声分散于100ml0.5mol/l氯化镍水溶液中，然后室温搅拌反应48h后，磁分离后用超纯水洗涤至中性，真空干燥后即得一种可应用于his标签蛋白纯化的镍化磁性微球。用元素分析仪进行测试，得到本发明实施例1-3中提供的镍化磁性微球的元素含量如下表所示：上表中，对比例选自市售磁性二氧化硅微球。由上表对比可知，本发明中提供的镍化磁性微球与市售磁性二氧化硅微球相比，c、h、n的含量显著升高，说明本发明提供的镍化磁性微球已被相应的有机成分所修饰。分别配置100ml浓度(μmol/l)分别为40、80、120、160的镍离子标准溶液，用原子吸收分光光度计进行分析，测得镍离子浓度与吸光度的标准曲线，并由此曲线得到表面螯合镍离子的磁性二氧化硅微球所含镍离子含量如下表所示：吸光度浓度(μmol/l)质量(g)sdrsd10.2291400.00271.2120.3572800.00341.0230.50241200.00280.5140.65451600.00370.64实施例10.239143.10.10270.00100.92实施例20.430591.70.21620.00531.07实施例30.303354.70.13071.00150.99由上表可知，本发明提供的镍化磁性微球中镍离子平均浓度为4.22*10-5mol/g，可有效选择性分离his标签蛋白，用于his标签蛋白纯化。以上仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。当前第1页12