专利名称:一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法
一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法技术领域：
[0001]本发明涉及种子组织的取样方法。
技术背景[0002]随着现代分子生物学发展，高通量测序技术及分子标记得以迅速应用，但目前还没有与之相配套的简易高通量取样技术，限制了该技术的发展。许多研究如数量遗传性状定位、植物数量性状基因克隆以及分子育种，均需要从种子大量提取DNA，进行基因型鉴定， 从而选择出有用的基因型个体，淘汰不需要用的基因型个体。传统的从种子中来提取DNA 的方法如“半粒种子法”，是一个非常复杂与繁琐的过程，不能满足现化高通量提取DNA的要求。另一方面，虽然美国孟山都公司的专利产品自动无污染种子取样器(中国专利公开号CN101437391)，可以用于种子取样技术，但是由于该机器的价格十分昂贵，不利于推广使用。最接近的方法为“钻孔法”(Kamiya and Kiguchi 2003,Rapid DNA Extraction Method from Soybean Seeds, Breeding Science 53(3) :277-279)，但是其操作程序复杂，钻取单个种子费时间较长，钻取的植物组织采用玻璃纸、1. 5毫升离心管或2. 0毫升离心管收集， 不适于高通量样品的连续采集。
发明内容
[0003]本发明是要解决现有的种子取样器价格昂贵，不利于推广使用，以及现有的“钻孔法”操作复杂，不适于高通量样品连续采集的问题，而提供一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法。[0004]本发明一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法按照以下步骤完成[0005]一、准备材料植物种子、钻头、可调速台钻、孔板、移液管枪头、空气压缩机、铝箔纸；用双层铝箔纸将孔板上口处包裹严密，用胶带将铝箔纸边缘固定在样品板上，轻压铝箔纸，使孔板的样品孔轮廓凸现；[0006]二、钻孔、收集胚乳组织将可调速台钻放置于操作台上，安装上钻头，钻孔的位置选取植物种子上远离胚胎的一侧，使钻头不破坏种子胚胎，钻头转速为200 400r/min，最初钻取的表皮部分弃去，钻至胚乳组织时，使用移液管枪头收集，移液管枪头小头的一端用带有乳胶手套的手指按住，将钻取的胚乳组织从移液管枪头大头一端倒入移液管枪头中， 钻孔后的种子编号存放；[0007]三、转移胚乳组织，将步骤二中盛有胚乳组织的移液管枪头倾斜，使移液管枪头与水平面呈10 30度角，移液管枪头小头一侧位于低处，移开按住移液管枪头小头的手指， 用移液管枪头的小头将铝箔纸刺破，将移液管枪头插入孔板的样品孔中，然后直立移液管枪头，使胚乳组织流入到孔板的样品孔中；[0008]四、清洗，用空气压缩机吹出的高压空气将步骤二和三中使用的移液管枪头、钻头和乳胶手套上沾有的胚乳组织吹走；[0009]五、重复步骤二至四，直至完成所有种子的取样。[0010]本发明方法使用移液管枪头收集钻取的种子组织材料，并转移至孔板中，转移后利用高压气流清除所用共具上的残余样品后，进行下一个种子的取样。整个过程简单、高速。收集的种子组织材料用于进行基因型鉴定及其它下游分析。钻取后的种子编号存放， 可用于科研与育种中。
本发明的有益效果本发明一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，只需利用简单的设备即可实现连续钻取、收集种子组织样品，同时保持种子的发芽势，钻取的种子组织并不需要粉碎，可以直接用于高通量的DNA基因型鉴定。本发明方法效率高，每人每日钻取的植物种子组织样品为4 6块384样品板，相当于大豆种子1500 2300粒，与现有的钻孔法相比，效率提高了 7. 5 11. 5倍。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式
，还包括各具体实施方式
之间的任意组合。 具体实施方式
一本实施方式一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法按照以下步骤完成
一、准备材料植物种子、钻头、可调速台钻、孔板、移液管枪头、空气压缩机、铝箔纸；用双层铝箔纸将孔板上口处包裹严密，用胶带将铝箔纸边缘固定在样品板上，轻压铝箔纸，使孔板的样品孔轮廓凸现；
二、钻孔、收集胚乳组织将可调速台钻放置于操作台上，安装上钻头，钻孔的位置选取植物种子上远离胚胎的一侧，使钻头不破坏种子胚胎，钻头转速为200 400r/min，最初钻取的表皮部分弃去，钻至胚乳组织时，使用移液管枪头收集，移液管枪头小头的一端用带有乳胶手套的手指按住，将钻取的胚乳组织从移液管枪头大头一端倒入移液管枪头中， 钻孔后的种子编号存放；
三、转移胚乳组织，将步骤二中盛有胚乳组织的移液管枪头倾斜，使移液管枪头与水平面呈10 30度角，移液管枪头小头一侧位于低处，移开按住移液管枪头小头的手指， 用移液管枪头的小头将铝箔纸刺破，将移液管枪头插入孔板的样品孔中，然后直立移液管枪头，使胚乳组织流入到孔板的样品孔中；
四、清洗，用空气压缩机吹出的高压空气将步骤二和三中使用的移液管枪头、钻头和乳胶手套上沾有的胚乳组织吹走；
五、重复步骤二至四，直至完成所有种子的取样。
本实施方式中可调速台钻是上海标杆工具有限公司的BG-5158型便携式台钻，也可选用其它可控速的台钻；空气压缩机是上海捷压缩机制造有限公司的风豹双机头无油空气压缩机95/7，也可选用其它空气压缩机。
由于种皮的基因型为母本基因型，在分离群体或选择群体中应剔除种皮后再取样，或不收集钻取的种皮部分。若上一代基因型对试验无影响，可以不分离种皮，如纯合的品种，种子种皮的基因型与种子内部的基因型一致。
钻孔后的种子不影响发芽，出苗后在子叶表面会留下相应的孔洞，并不影响植株的生长。若是皮层较厚的豆类种子，如野生大豆，发芽前需要机械划破种皮使其易于吸水， 此类种子钻孔后可以省去机械划破种皮的步骤，直接进行发芽作业。[0022]本实施方式的有益效果本实施方式一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法， 只需利用简单的设备即可实现连续钻取、收集种子组织样品，同时保持种子的发芽势，钻取的种子组织并不需要粉碎，可以直接用于高通量的DNA基因型鉴定。本发明方法效率高，每人每日钻取的植物种子组织样品为4 6块384样品板，相当于大豆种子1500 2300粒， 与现有的钻孔法相比，效率提高了 7. 5 11. 5倍。[0023]具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中钻头大小根据种子大小来确定，以百粒种子的重量m为标准，当m彡6. Og时，选用直径为1. 0 1. 3mm 的钻头；当6.0g<m< 20. Og时，选用直径为1.5 2. Omm的钻头；当20. Og时，选用 2. 1 5. Omm的钻头。其它与具体实施方式
一相同。[0024]具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一中孔板的规格为96孔、2mL/孔或384孔、200 μ L/孔。其它与具体实施方式
一或二相同。[0025]具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一或三之一不同的是步骤一中孔板的选择根据每个种子的取样量来确定，当取样量为30mg IOOmg时，选用96孔、2mL/孔的孔板，当取样量为2mg 8mg时，选用384孔、200 μ L/孔的孔板。其它与具体实施方式
一或三之一相同。[0026]具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一或四之一不同的是步骤一中移液管枪头规格为5mL。其它与具体实施方式
一或四之一相同。[0027]具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一或五之一不同的是步骤二中钻头转速为250 350r/min。其它与具体实施方式
一或五之一相同。[0028]具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一或六之一不同的是步骤三中移液管枪头与水平面呈15 25度角。其它与具体实施方式
一或六之一相同。[0029]具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一或七之一不同的是步骤四中空气压缩机的排气量为95L/min。其它与具体实施方式
一或七之一相同。[0030]采用以下实施例验证本发明的有益效果[0031]实施例一[0032]本实施例一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法按照以下步骤完成[0033]一、准备材料大豆种子、1.0mm钻头、可调速台钻、孔板(384孔、200 μ L/孔)、5mL 移液管枪头、空气压缩机(排气量为95L/min)、铝箔纸；用双层铝箔纸将孔板上口处包裹严密，用胶带将铝箔纸边缘固定在样品板上，轻压铝箔纸，使孔板的样品孔轮廓凸现；[0034]二、钻孔、收集胚乳组织将可调速台钻放置于操作台上，安装上钻头，钻孔的位置选取植物种子上远离胚胎的一侧，使钻头不破坏种子胚胎，钻头转速为300r/min，最初钻取的表皮部分弃去，钻至胚乳组织时，使用移液管枪头收集，移液管枪头小头的一端用带有乳胶手套的手指按住，将钻取的胚乳组织从移液管枪头大头一端倒入移液管枪头中，钻孔后的种子编号存放；[0035]三、转移胚乳组织，将步骤二中盛有胚乳组织的移液管枪头倾斜，使移液管枪头与水平面呈15度角，移液管枪头小头一侧位于低处，移开按住移液管枪头小头的手指，用移液管枪头的小头将铝箔纸刺破，将移液管枪头插入孔板的样品孔中，然后直立移液管枪头， 使胚乳组织流入到孔板的样品孔中；[0036]四、清洗，用空气压缩机吹出的高压空气将步骤二和三中使用的移液管枪头、钻头和乳胶手套上沾有的胚乳组织吹走；
五、重复步骤二至四，直至完成所有种子的取样。
本实施方式中可调速台钻是上海标杆工具有限公司的BG-5158型便携式台钻；空气压缩机是上海捷压缩机制造有限公司的风豹双机头无油空气压缩机95/7。
通过图位克隆法分离生育期基因El时，需要从大量的个体中筛选出遗传重组体， 由于该基因位于着丝点附近，重组率很低，因而需要筛选的个体数就更多。最有效的办法就是从种子阶段就能明确其基因型，从而节省大量时间与田间地块。按照上述方法对大约2 万粒种子取样，采集了 36个384孔孔板。之后采用标准的CTAB抽提法进行种子DNA提取， 同时进行有关分子标记鉴定，其DNA提取及基因型鉴定的成功率为99. 5%，其中13761个种子中获得了有效的基因型信息，成功的鉴定出10个遗传重组体。
本实施例一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，只需利用简单的设备即可实现连续钻取、收集种子组织样品，同时保持种子的发芽势，钻取的种子组织并不需要粉碎，可以直接用于高通量的DNA基因型鉴定。本发明方法效率高，每人每日钻取的植物种子组织样品为4 6块384样品板，相当于大豆种子1500 2300粒，与现有的钻孔法相比， 效率提高了 7. 5 11. 5倍。
权利要求
1.一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，其特征在于高通量、非破坏性种子组织的取样方法按照以下步骤完成一、准备材料植物种子、钻头、可调速台钻、孔板、移液管枪头、空气压缩机、铝箔纸； 用双层铝箔纸将孔板上口处包裹严密，用胶带将铝箔纸边缘固定在样品板上，轻压铝箔纸， 使孔板的样品孔轮廓凸现；二、钻孔、收集胚乳组织将可调速台钻放置于操作台上，安装上钻头，钻孔的位置选取植物种子上远离胚胎的一侧，使钻头不破坏种子胚胎，钻头转速为200 400r/min，最初钻取的表皮部分弃去，钻至胚乳组织时，使用移液管枪头收集，移液管枪头小头的一端用带有乳胶手套的手指按住，将钻取的胚乳组织从移液管枪头大头一端倒入移液管枪头中；三、转移胚乳组织，将盛有胚乳组织的移液管枪头倾斜，使移液管枪头与水平面呈 10 30度角，移液管枪头小头一侧位于低处，移开按住移液管枪头小头的手指，用移液管枪头的小头将铝箔纸刺破，将移液管枪头插入孔板的样品孔中，然后直立移液管枪头，使胚乳组织流入到孔板的样品孔中；四、清洗，用空气压缩机吹出的高压空气将移液管枪头、钻头和乳胶手套上沾有的胚乳组织吹走；五、重复步骤二至四，直至完成所有种子的取样。
2.根据权利要求
1所述的一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，其特征在于步骤一中钻头大小根据种子大小来确定，以百粒种子的重量m为标准，当m < 6. Og时，选用直径为1.0 1. 3mm的钻头；当6. Og < m < 20. Og时，选用直径为1. 5 2. Omm的钻头；当 m彡20. Og时，选用2. 1 5. Omm的钻头。
3.根据权利要求
1所述的一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，其特征在于步骤一中孔板的规格为96孔、2mL/孔或384孔、200 μ L/孔。
4.根据权利要求
1所述的一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，其特征在于步骤一中孔板的选择根据每个种子的取样量来确定，当取样量为30mg IOOmg时，选用96 孔、2mL/孔的孔板，当取样量为2mg 8mg时，选用384孔、200 μ L/孔的孔板。
5.根据权利要求
1所述的一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，其特征在于步骤一中移液管枪头规格为5mL。
6.根据权利要求
1所述的一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，其特征在于步骤二中钻头转速为250 350r/min。
7.根据权利要求
1所述的一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，其特征在于步骤三中移液管枪头与水平面呈15 25度角。
8.根据权利要求
1所述的一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，其特征在于步骤四中空气压缩机的排气量为95L/min。
专利摘要
一种高通量、非破坏性种子组织的取样方法，它涉及种子组织的取样方法。本发明要解决现有的种子取样器价格昂贵，不利于推广使用，以及现有的“钻孔法”操作复杂，不适于高通量样品连续采集的问题。步骤一、准备材料；二、钻孔、使用移液管枪头收集胚乳组织；三、将胚乳组织转移到孔板中；四、用空气压缩机吹走所用工具上的残余植物组织；五、重复步骤二至四，直至完成所有种子的取样。本发明只需利用简单的设备即可实现连续钻取、收集种子组织样品，同时保持种子的发芽势。本发明方法效率高，每人每日能钻取大豆种子1500～2300粒，与现有的钻孔法相比，效率提高了7.5～11.5倍。本发明用于植物组织取样。
文档编号C12Q1/24GKCN102533935SQ201110451381
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月29日
发明者吴士浩, 吴红艳, 夏正俊 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan