一种在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法
【专利摘要】本发明公开了一种在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法。具体步骤为S1.根据育种作物的密码子偏好性，优化PSY、CrtI、BHY和BKT的4个基因的序列，将序列优化后的4个基因分别与育种作物胚乳表达启动子和质体转运肽融合，分别构建基因表达盒；将S1中的4个基因表达盒构建成植物转化载体，获得含PSY、CrtI、BHY和BKT的植物转化载体；将S2所述植物转化载体转化育种作物，获得种子胚乳为橙红色的合成虾青素的转基因作物。本发明实现虾青素在作物（尤其是水稻）种子胚乳中的合成，其产品即可以直接用于食用，也可以作为生产虾青素的原料，对于新型功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。
【专利说明】
一种在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法。
【背景技术】
[0002]虾青素(Astaxanthin)，化学名3，3’-二羟基_4，4’ -二酮基-酮，β’-胡萝卜素，又名超级维生素E，是一类橙红色类胡萝卜色素，在生物体具有超强的抗氧化性，其抗氧化活性是维生素E的550倍。具有抗辐射、预防肿瘤、预防心血管疾病、预防糖尿病、延缓衰老以及提高免疫力等功效，在食品、保健品、医药用品、化妆品、食品添加剂、水产养殖等领域具有广阔的应用价值。自然界中，虾青素主要是由一些藻类、细菌、浮游植物产生，高等植物由于缺乏关键的β-类胡萝卜素酮化酶(BKT)而不能合成。目前虾青素的来源主要是从粉碎虾壳提取、红酵母菌发酵生产、雨生红球藻养殖提取以及人工合成。天然产物提取的方法存在产量低和成本高的问题，人工化学合成法由于存在安全风险问题，而被限制使用。因此，利用基因工程手段，以植物作为生物反应器生产虾青素，则可以解决上述限制因素。由于植物中富含虾青素的前体类胡萝卜素，目前利用基因工程手段，已在烟草、番茄、土豆中实现了虾青素的合成。
[0003]水稻是一种重要的粮食作物和模式植物，同时其种子也是一种优良的生物反应器，稻米的蛋白和活性营养成分主要存在于种皮和胚中，而日常食用的精米是去掉种皮和胚的胚乳(主要成分是淀粉)，其营养价值大大下降。因此通过基因工程方法在胚乳中增加、强化合成特定的营养成分和功能性物质，是功能型水稻育种的主要目标。如在胚乳产生β_类胡萝卜素的“黄金大米”，以及以胚乳作为生物反应器生产具有生物活性的“人血清蛋白米”。但是，目前还没有在水稻胚乳中生产虾青素的报告，因为，水稻中缺乏合成虾青素的关键酶，而且对于具体需要那些酶才能在胚乳中合成虾青素，也是一个非常难以攻克的课题研究。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术的上述不足，提供了一种在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的:
[0006]本发明通过研究首次发现，要想在作物胚乳中合成虾青素，PSY、Crt1、BHY和BKT是四个必须的关键酶。因此，本发明首先保护PSY、Crt1、BHY和BKT四个基因在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种中的应用。
[0007]另外，在此研究的基础上，本发明提供一种具体的在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法，包括以下步骤:
[0008]S1.根据育种作物的密码子偏好性，优化PSY、Crt1、BHY和BKT四个基因的序列，将序列优化后的四个基因分别与育种作物胚乳表达基因启动子和质体转运肽分别构建基因表达盒；
[0009]S2.将SI中的4个基因表达盒依次与植物转化载体质粒组装，获得含PSY、Crt1、BHY和BKT四个基因的植物转化载体；
[0010]S3.将S2中的植物转化载体转化育种作物胚愈伤组织，获得在种子胚乳生产虾青素的转基因作物。
[0011]虾青素作为一种重要的功能性物质，实现其在水稻胚乳中的合成积累，能极大的增加稻米的营养品质和产品附加值。水稻胚乳中由于缺乏类胡萝卜素合成途径相关基因的表达，不能合成类胡萝卜素(图1)。“黄金大米”主要成分是β-类胡萝卜素，是通过在胚乳中特异表达类胡萝卜素合成途径的八氢番茄红素合成酶(PSY)和细菌八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)产生的。虾青素作为β-类胡萝卜素的最高级形式，要实现其在水稻胚乳中特异合成，除需要PSY和Crt I外，还需要β_类胡萝卜素羟化酶(BHY)和β-类胡萝卜素酮化酶(BKT)。当这4个基因在胚乳中共同表达时才有可能实现胚乳合成虾青素的目标(图1)。因此与黄金大米产生
类胡萝卜素相比，在水稻胚乳中特异合成积累虾青素涉及到更多的基因，难度更大，目前相关研究在国内外还未见正式报道。
[0012]优选地，所述育种作物为水稻、玉米、小麦。
[0013]优选地，所述PSY基因为玉米的PSY基因，CrtI基因为欧文氏菌的CrtI基因，BHY基因为雨生红球藻的BHY基因，ΒΚΤ基因为莱茵衣藻的BKT基因。
[0014]优选地，当育种作物为水稻时，根据单子叶植物和水稻的密码子偏好性，优化玉米的PSY基因、欧文氏菌的CrtI基因、雨生红球藻的BHY基因、莱茵衣藻的BKT基因的序列，优化后的基因称为PSY-r、Crt1-p、BHY-p和ΒΚΤ-ρ，其序列如SEQ ID NO:1?4所示。
[0015]优选地，当育种作物为水稻时，使用的启动子为水稻胚乳特异性储存蛋白基因启动子Pensl?Pens4，序列如SEQ ID NO: 5?8所示；质体转运肽为TP，编码DNA序列如SEQ IDNO: 9所示ο
[0016]优选地，当育种作物为水稻时，育种方法包括如下步骤:
[0017]S1.根据单子叶植物和水稻的密码子偏好性，优化玉米的PSY基因、欧文氏菌的CrtI基因、雨生红球藻的BHY基因、莱茵衣藻的BKT基因的序列，优化后的基因称为PSY-r、Crt1-p、BHY-p和ΒΚΤ-ρ，序列如SEQ ID NO:1?4所示;将序列优化后的4个基因分别与水稻胚乳特异性储存蛋白基因启动子Pensl?Pens4和质体转运肽TP编码序列分别构建基因表达盒;水稻胚乳特异性储存蛋白基因启动子Pensl?Pens4和质体转运肽TP编码序列分别如SEQ ID NO:5?9所示;
[0018]S2.将SI中的4个基因表达盒构建植物转化载体，获得含PSY-r、Crt1-p、BHY-p和ΒΚΤ-ρ基因表达盒的多基因载体；
[0019]S3.将多基因载体转入农杆菌，转化育种作物水稻的愈伤组织，获得转基因水稻。
[0020]SEQ ID N0:5?8分别是水稻胚乳特异性储存蛋白基因启动子Pensl、Pens2、Pens3、Pens4的序列，PSY-r和?61181构建成表达盒，01:11和?6118 2构建成表达盒，13!1￥-口和Pens3构建成表达盒，ΒΚΤ-ρ和Pens4构建成表达盒。
[0021]更优选地，S2中4个基因表达盒构建植物转化载体时，采用多基因载体系统，构建一个T-DNA区中含有PSY-r、Crt 1-p、BHY-p和ΒΚΤ-ρ四个基因的的多基因载体。最优选地，所述多基因载体系统为专利号为ZL02134869.3的多基因载体系统。
[0022]更优选地，S3所述转化方法为农杆菌介导法。
[0023]本发明还保护含有SEQ ID NO:1?4所示PSY_r、Crt1-p、BHY-p和BKT_p四个基因的载体。优选地，含有SEQ ID NO:1?4所示PSY-r、Crtl-p、BHY-p和ΒΚΤ-ρ四个基因的载体为多基因载体 PYLTAC380-BBPC。
[0024]为了显示本发明的有效性，本发明利用可以装载多基因的基因工程载体系统(ZL02134869.3)构建了一个T-DNA区中含有在种子胚乳中合成虾青素所需的4个关键酶重组基因(PSY-r、Crt1-p、BHY-p和ΒΚΤ-ρ，分别与TP编码序列融合)，并且这4个基因分别用水稻胚乳特异启动子控制的多基因载体(双元载体)。通过农杆菌介导的方法，把聚合4个目的基因的多基因载体转入水稻获得转基因水稻株系。这4个目的基因在胚乳中特异表达，在胚乳中特异合成积累虾青素效率较高(达3.68yg/g)的转基因水稻，其水稻种子可直接食用或作为原材料进行提取加工。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0026]本发明首次实现虾青素在作物(尤其是水稻)胚乳中的合成，其产品即可以直接用于食用，也可以作为生产虾青素的原料，本发明对于新型功能性作物育种具有重要的指导意义和生产应用价值。另外，本发明可以实现在作物种子胚乳合成积累有用活性物质或营养物质(虾青素)，因此本发明对重要的、复杂生物合成途径和重要农艺性状的多基因遗传工程操作提供了技术方法，具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0027]图1为转基因作物种子胚乳中合成虾青素的途径，黑色细线小箭头代表水稻胚乳中可能存在的反应;虚线箭头代表水稻胚乳中确定不存在的反应;黑色粗细大箭头代表导入外源转基因表达的酶催化的反应。
[0028]图2为含PSY-r、CrtI_p、BHY-p和BKT_p基因表达盒的供给载体的结构示意图(A)和限制性内切内酶Not I的酶切检测图(B);箭头代表Not頂每切后获得的目的基因表达盒。
[0029]图3为含4个虾青素必须基因(PSY-r、Crt I_p、BHY_p和ΒΚΤ-ρ)的多基因载体PYLTAC380-BBPC的结构示意图(A)与不同克隆的限制性内切内酶Not I的酶切检测(B); T-DNA区的HPT为抗潮霉素基因。
[0030]图4为对导入pYLTAC380-BBPC的水稻转化体基因组DNA的4个外源基因(ORF)的PCR检测;CK+为多基因载体PYLTAC380-BBPC质粒;WT为野生型对照基因组DNA。
[0031]图5为以RT-PCR对pYLTAC380-BBPC水稻转化体的授粉后20天发育种子的4个外源基因的表达检测。
[0032]图6为合成虾青素的pYLTAC380-BBPC转化水稻精米的表型；野生型为受体品种中花11。
[0033]图7为HPLC检测pYLTAC380-BBPC转化水稻种子胚乳中的虾青素。
【具体实施方式】
[0034]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规分子生物学方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0035]实施例1
[0036]本发明通过研究发现，要想在作物胚乳中合成虾青素，PSY、Crt1、BHY和BKT是四个必需的关键酶。根据以上研究基础，本实施例建立了一种在水稻胚乳中生产虾青素的转基因育种方法，具体包括以下步骤:
[0037]S1.四个必需基因表达盒的构建:
[0038]Sll.四个必需基因(PSY-r、Crt1-p、BHY-p和ΒΚΤ-ρ)编码区的合成:以玉米的PSY基因(GenBank N0.U32636.1)为模板，根据单子叶植物和水稻密码子偏好性，利用CodonOptimizat1n Tool程序优化密码子，合成获得SEQ ID NO:1所示DNA序列的PSY_r，克隆到质粒载体，测序确定其序列；以欧文氏菌ErwiniauredovoracrtI基因(GenBank N0.D90087)为模板，根据单子叶植物和水稻密码子偏好性，利用Codon Optimizat1n Too程序优化密码子，合成获得SEQ ID N0:2所示DNA序列Crtl-p，克隆到质粒载体，测序确定其序列；以雨生红球藻Haematococcuspluvialis BHY基因(GenBank N0.BD250390.1)为模板，根据单子叶植物和水稻密码子偏好性，利用Codon Optimizat1n Tool程序优化密码子，合成获得SEQ ID NO: 3所示DNA序列BHY-p，克隆到质粒载体，测序确定其序列；以莱茵衣藻Chlamydomonasreinhardtii BKT基因(GenBank N0.JF304771.1)为模板，根据单子叶植物和水稻密码子偏好性，利用Codon Optimizat1n Tool程序优化密码子，合成获得SEQ IDNO: 4所示DNA序列ΒΚΤ-ρ，克隆到质粒载体，测序确定其序列。
[0039]S12.质体转运肽编码序列TP(Transit peptide)的合成:参考豌豆RbcS小亚基基因(GenBank N0.X00806)的序列，合成编码质体转运肽TP的序列(SEQ ID NO:9)。
[0040]S13.虾青素合成必需的4个基因表达盒在供给载体上的构建:Crt Ι-p基因表达盒pYL322dl-Crt I_p构建:反向扩增多基因供给载体I(Lin et al.，2003;ZL02134869.3)，获得载体骨架片段a;以水稻基因组DNA为模板，扩增水稻胚乳特异储存蛋白基因(GenBankN0.BAC83236.I)的I.5kb的启动子Pens I (SEQ ID NO: 5)，作为片段b;扩增质体转运肽的序列TP(SEQ ID N0:9)，作为片段c;扩增Crt Ι-p基因，作为片段d ;从质粒pCAMBIAl 300(GenBank N0.AF234296.1 Wj^fCaMV 35S终止子35sT作为片段e。每个片段两侧，分别带有25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理(Gibson,2011)，按质粒载体多片段一步组装的方法(Zhu et al.,2014)，获得含 Crt Ι-p 基因表达盒的载体 pYL322dl_Crt Ι-p(图 2) WSY-r基因表达盒pYL322d2-PSY-r构建:反向扩增多基因供给载体II(Lin et al.,2003；ZL02134869.3)获得载体骨架片段a;以质粒pSAT7(GenBank N0.DQ5453)为模板，扩增agropine synthase终止子agsT作为片段b;扩增反向PSY_r基因，作为片段c;以水稻基因组DNA为模板，扩增水稻胚乳特异储存蛋白基因(GenBank N0.BAD61649.1)约Ikb的启动子Pens2(SEQ ID N0:6)，作为片段d。每个片段两侧分别带有25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含PSY-r基因表达盒的载体pYL322d2-PSY-r (图2)。ΒΚΤ-ρ基因表达盒pYL32 2d 1-ΒΚΤ-ρ构建:反向扩增多基因供给载体I，获得载体骨架片段a;以水稻基因组DNA为模板，扩增水稻胚乳特异储存蛋白基因(GenBankN0.AAP50945.1)约2.4kb的启动子Pens3(SEQ ID NO: 7)，作为片段b ；扩增质体转运肽的序列TP(SEQ ID N0:5)，作为片段c;扩增ΒΚΤ-ρ基因，作为片段d;从质粒pSAT3(GenBankN0.DQ005465)扩增manopine synthase终止子masT作为片段e。每个片段两侧分别带有25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含BKT-p基因表达盒供给载体pYL322dl-BKT-p (图2)。BHY-p基因表达盒pYL322d2_BHY-p构建:反向扩增多基因供给载体II，获得载体骨架片段a;从质粒pSAT3(GenBank N0.DQ005465)扩增manopine synthase终止子masT作为片段b;扩增反向BHY_p基因，作为片段c;扩增质体转运肽的序列TP(SEQ ID NO: 5)，作为片段d;以水稻基因组DNA为模板，扩增水稻胚乳特异储存蛋白基因(GenBank N0.BAC19997.1)约2.4kb的启动子Pens4(SEQ ID N0:8)，作为片段e。每个片段两侧分别带有25bp的同源序列，利用Gibson组装的原理，按质粒载体多片段一步组装的方法，获得含BHY基因表达盒供给载体pYL322d2-BHY-p (图2)。
[0041 ] S2.水稻胚乳特异合成虾青素的多基因载体pYLTAC380-BBPC的组装:多基因载体系统是由I个基于可转化人工染色体(TAC)的接受载体和2个装载基因的供给载体组成，利用Cre/loxP位点特异重组方法，使不同的供给载体交替地和接受载体进行2轮以上的基因组装，构建多基因载体(Lin et al.，2003)o
[0042]S21.Crt1-p基因表达盒的组装:将供给载体(I)pYL322dl-Crt1-p质粒与接受载体PYLTAC380H2质粒混合，电激转化表达Cre酶的大肠杆菌菌株NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氯霉素双抗平板上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和供给载体骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用1-SceI酶切消除未重组的质粒后，转化不含Cre基因的大肠杆菌DH10B，在卡拉霉素平板上鉴定获得含I个基因的载体 PYLTAC380-C。
[0043]S22.PSY-r基因表达盒的组装:将供给载体(II)pYL322d2-PSY-p质粒与步骤构建的含Crt Ι-p基因表达盒的接受载体PYLTAC380-C质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氨苄霉素双抗平板上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和供给载体骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用P1-SceI酶切切断未重组质粒后，转化大肠杆菌DHlOB，在卡拉霉素平板上鉴定获得含2个基因的载体pYLTAC380-PCo
[0044]S23.BKT-p基因表达盒的组装:将供给载体(III )pYL322dl_BKT-p质粒与步骤获得的含2个目的基因的接受载体PYLTAC380-PC质粒混合，共同电激转化表达Cre酶的大肠杆菌菌株NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氯霉素双抗平板上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和其骨架的删除，洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用1-SceI酶切消除未重组质粒后，转化DHlOB，在卡拉霉素平板上鉴定获得含3个基因的载体 PYLTAC380-BPC。
[0045]S24.BHY-P基因表达盒的组装:将供给载体(IV)pYL322d2-BHY质粒与步骤获得的含3个基因的接受载体pYLTAC380-BPC质粒混合，电激转化NS3529感受态细胞，在卡拉霉素和氨苄霉素双抗平板上筛选转化子，利用NS3529内源表达的Cre酶，实现供给载体质粒重组和其骨架的删除。洗下双抗平板上的混合菌落混抽质粒，再用P1-SceI酶切消除未重组质粒后，转化DH10B，在卡拉霉素平板上鉴定获得含虾青素合成必需的4个基因的多基因载体PYLTAC380-BBPC(见图3)。
[0046]S3.多基因载体PYLTAC380-BBPC的水稻转化与检测
[0047]水稻的遗传转化:把多基因载体pYLTAC380-BBPC质粒转入农杆菌EHA105，用于转化水稻胚愈伤组织。将水稻未成熟种子或成熟种子，在25°C黑暗条件下诱导愈伤组织。用适量的农杆菌悬浮于加有ΙΟΟμπιοΙ/L乙酰丁香酮的侵染液培养基中，28°C震荡培养(200rpm，
0.5h)，用分光光度计调0D550值为0.3?0.4，即可用于愈伤组织的浸染。挑选颜色新鲜呈淡黄色、生长旺盛的颗粒状胚性愈伤组织，和农杆菌菌液混合，浸泡20min，吸干菌液后转到共培养培养基，暗培养3天后，转移到含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，每2周继一次代，继代2次。抗性筛选后，把带有绿点的抗性愈伤转到有分化培养基上，分化出转化苗，获得转化植株。
[0048]转化植株基因组PCR检测:对获得的TO代植株叶片，用SDS法抽提基因组DNA作为模版，用PCR扩增方法，分别检测外源HPT、Crt 1-p、PSY-r、BHY-p和BKT-p。所用引物如下:
[0049 ]引物F-HPT: 5 ’ -GGACGCAACGCCTACGACTGGAC-3 ’ ；
[0050]弓丨物R-HPT:5，-TCATCGCAAGACC GGCAACAGGA-3，；
[0051 ] 扩增约720bp片段。
[0052]引物Forf-CrtIp: 5，-ATGAAGCCGACTACCGTGATAG-3 ；
[0053]引物Rorf-CrtIp:5’-CTAAATCAGGTC CTCCAACATC-3，；
[0054]扩增Crt 1-p基因约1.48kb的编码框。
[0055]引物Forf-PSYp: 5 ’ -ATGGCCATCATACTCGTACGAG-3 ’ ；
[0056]引物Rorf-PSYp: 5，-CTAGGTCTGG CC ATTTCTCAA-3，；
[0057]扩增PSY-r 基因约 1.2kb 的 0RF。
[0058]引物Forf-BKTp: 5 ’ -ATGGGTCCAGGCATCCAGCCTAC-3 ’ ；
[0059 ]引物Rorf-BKTp: 5 ’ -CTAGGCGA GCGCAGCCCCGCGAG-3 ’ ；
[0060] 扩增BKT-p基因约Ikb的0RF。
[0061 ]引物Forf-BHYp: 5 ’ -ATGGCCATCATACTCGTACGAG-3 ’ ；
[0062]弓丨物Rorf-BHYp:5，-CTAGGTCTGGCCATTTCTCAA-3 ’；
[0063]扩增BHY-p 基因约 0.9kb 的 ORF。
[0064]所用扩增程序:94°C预变性4min;94°C变性30sec，58°C褪火30sec，72°C延伸1.5min，共30个循环;最后72°C再延伸5min。结果显示，野生型(WT)对照都不能扩出外源基因，转基因植株都能扩出上述5个基因(图4)。
[0065]转基因植株Tl种子的RT-PCR检测:把转基因植株的Tl代授粉后20天呈现橙红色的发育种子，液氮条件下研磨成粉，再用Trizol方法抽提种子的总RNA，用MMV逆转录试剂盒，oligDT引物反转录为cDNA，用如下引物和扩增条件进行外源Crt I_p、PSY_r、BHY_p和BKT-p基因的RT-PCR检测，水稻内源Actin I基因作为内参。所用引物如下:
[0066]引物F-RT-Crtlp282: 5，-TCGCATACCTCGAGCAGCAC-3，；
[0067]引物R-RTCrtl-p 282(5'-TCAGG TCCTCCAACATCAGG-3，；
[0068]扩增Crt 1-p基因282bp的片段。
[0069]引物F-RT-PSYr381: 5，-GATGAGCTTGCACAGGCAGG-3 ’ ；
[0070]引物R-RTPSY-r 381:5'-CAATGA ACATGGGAGCAGTAGC-3，；
[0071]扩增pSY-r基因381bp的片段。
[0072]引物F-RT-BKTp261: 5，-CTCCACTCGCTAACCAGCTG-3，；
[0073]引物R-RT-BKTp261: 5，-CGCGAG CTATCTGTCTGCAC-3 ’ ；
[0074]扩增BKT-p基因约261bp的片段。
[0075]引物F-RT-BHYp322: 5，-GGCTATGCTGCTCTGCACG-3，；
[0076]引物R-RT-BHYp322(5，-CCTCTTACTCCAGTCCAACTC-3，；
[0077]扩增BHY-p基因322bp的片段。
[0078]所用扩增程序:94°C预变性4min;94°C变性30sec，58°C褪火30sec，72°C延伸30sec，共25个循环;最后72°C再延伸5min。结果显示，对照野生型种子不能扩出外源基因，橙红色的转基因种子能扩增出特异的正确条带，外源基因在种子中均能表达(图5)。
[0079]实施例2
[0080]转基因水稻胚乳中虾青素的外观和高效液相色谱检测:
[0081]转基因水稻胚乳中虾青素的观察:在导入上述4个基因的转基因水稻种子加工成精米(去除种皮)以及将米粒切碎观察，可见整个精米内外均呈现出橙红色(图6)，表明胚乳中合成了虾青素。
[0082]转基因水稻种子虾青素的提取与高效液相色谱(HPLC)鉴定:取0.1g水稻种子在冰上研磨成粉末，加入2mL甲醇继续均勾研磨5min ；再转入2ml离心管，避光低温振荡(10rpm)提取1min; 4°C8000rpm离心5min收集上清;重复提取沉淀物，直到沉淀呈白色;将上清在4°C8000rpm离心5min后合并上清，将收集的上清低温避光浓缩干燥;最后将干燥的虾青素加600yL甲醇用于测定。将上述待测样品过0.22μπι的有机滤膜，再注入到2mL棕色取样瓶，进样量20yL，用C30高效液相色谱柱进行HPLC分析。流动相为甲醇:水=95:5。色谱条件为柱温为室温，流速为lmL/min。测定波长为480nm。虾青素HPLC纯标准品购自Sigma(CAS号472-61-7)。称取Imgii下青素标样，定溶于1mL甲醇中，再用甲醇分别稀释制成Oppm，5ppm，1ppm的溶液，按上述色谱条件分别取20yL进样。以峰面积为纵坐标，标准品的浓度为横坐标进行线性回归分析。结果显示，转基因水稻种子具有与虾青素标样相同的特征峰，表明在转基因水稻种子中成功合成了虾青素，含量可达2.68yg/g (图7)。
【主权项】
1.PSY、Crt1、BHmBKM个基因在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种中的应用。2.—种在作物种子胚乳生产虾青素的转基因育种方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.根据育种作物的密码子偏好性，优化Cril、和別71^4个基因的序列，将序列优化后的4个基因分别与育种作物胚乳表达启动子和质体转运肽融合，分别构建基因表达盒； 52.将SI中的4个基因表达盒构建成植物转化载体，获得含psr、CriIjMfP別7前植物转化载体； 53.将S2所述植物转化载体转化育种作物，获得在种子胚乳生产虾青素的转基因作物。3.根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于，所述育种作物为水稻、玉米、小麦。4.根据权利要求2或3所述的育种方法，其特征在于，所述51?因为玉米的因，Crtm因为欧文氏菌的CriJ基因，BHM因为雨生红球藻的因，Β_因为莱茵衣藻的I堪因。5.根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，当育种作物为水稻时，根据单子叶植物和水稻的密码子偏好性，优化玉米的基因、欧文氏菌的CriJ基因、雨生红球藻的说_因、莱茵衣藻的別TTS因的序列，优化后的序列如SEQ ID NO:1?4所示。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当育种作物为水稻时，使用的启动子为水稻胚乳特异性储存蛋白基因启动子Pensl?Pens4，序列如SEQ ID N0:5?8所示;使用的质体转运肽编码序列为TP JnSEQ ID NO:9所示。7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当育种作物为水稻时，育种方法包括如下步骤: 51.根据单子叶植物和水稻的密码子偏好性，优化玉米的因、欧文氏菌的CriI基因、雨生红球藻的5_因、莱茵衣藻的別TTS因的序列，优化后的基因称为PSr-r ￡rtl-p、 和別T-/7，序列如SEQ ID NO:1?4所示;将序列优化后的4个基因分别与水稻胚乳特异性储存蛋白基因启动子Pensl?Pens4和质体转运肽TP编码序列分别构建基因表达盒;水稻胚乳特异性储存蛋白基因启动子Pensl?Pens4和质体转运肽TP编码序列分别如SEQ IDNO: 5?9所示； 52.将SI中的4个基因表达盒构建植物转化载体，获得含PSr-rCrtl-p ?ΗΥ-ρΜΒΚΤ-ρ基因表达盒的多基因载体； 53.将多基因载体转入农杆菌，转化育种作物水稻的愈伤组织，获得转基因水稻。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S2中4个基因表达盒构建植物转化载体时，采用多基因载体系统，构建一个T-DNA区中含有PSY、Crt 1、BHY、BKT四个基因的的多基因载体。9.含有SEQID NO:1?4所示PSrT Crtl-p W/y-p和別T_p四个基因的载体。
【文档编号】A01H5/00GK105907780SQ201610283794
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】刘耀光, 祝钦泷, 曾栋昌, 陈乐天
【申请人】华南农业大学