可用于基因治疗和治疗性筛选的eNOS突变的制作方法

专利名称：可用于基因治疗和治疗性筛选的eNOS突变的制作方法
技术领域：
本发明涉及在依赖Akt的磷酸化位点处结构改变的新的NOS变体和突变体。改变后的NOS蛋白质或肽及其编码核酸分子，可以作为基因治疗剂用于治疗疾病血管成形术后再狭窄、高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、糖尿病、和血管发生缺陷的疾病。
背景技术：
动脉粥样硬化和血管血栓症是导致冠状动脉疾病、心肌梗死、和中风的发病和死亡的主要原因。动脉粥样硬化是从血管的内皮的变化开始。内皮的变化可能最终导致部分由摄取氧化态低密度脂蛋白(LDL)胆固醇引起的内皮病灶的发展。这种病灶的破损可以导致血栓形成和血管阻塞。在冠状动脉的情况中，复合病灶的破损可能促成心肌梗死；而在颈动脉的情况中，可能随之发生中风。
在动脉粥样硬化性冠心病中，内皮功能障碍可以减少血管扩张物质(诸如一氧化氮)的产生。当由于限流性冠状动脉狭窄或内皮功能障碍导致自动调控的血管舒张受到阻碍时，则发生心肌缺血。在这两种情况中，动脉血流不再能够随上升的氧需求而成比例增加。在其它情形中，当氧需求保持不变，但存在冠状动脉痉挛导致冠状动脉血流明显减少，下面的动脉粥样硬化性斑块快速发展导致冠状动脉内腔口径减小，和/或血小板聚集引起微血管间歇性阻塞时，可能发生心肌缺血。
气球血管成形术常用于因斑块而变窄的血管的再开。虽然气球血管成形术在打开血管的情况中成功率很高，但是它常常在手术过程中使内皮裸露并损伤血管。这种损伤引起血管平滑肌细胞迁移至损伤部位并增殖，形成病灶，称为肌内膜增生或再狭窄。这一新病灶导致在血管成形术后3-6个月内有显著比例的患者症状复发。
在动脉粥样硬化、血栓症、和再狭窄中，还存在正常血管功能的丧失，使得血管倾向于收缩而非扩张。血管的过度收缩引起血管内腔进一步变窄，从而限制血流。这可以引起诸如心绞痛(如果涉及心动脉)或暂时性脑缺血(即“小中风”，如果涉及脑血管)。在其它疾病状态中也发生这种血管功能异常(血管收缩过度或血管扩张不足)。高血压是由血管过度收缩以及血管壁变厚(特别是较小的血管)引起的。该过程可能影响肺血管并引起肺性高血压。已知与血管收缩过度或血管扩张不足有关的其它病症包括移植性动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、妊娠毒血症、Raynaud现象、Prinzmetal心绞痛(冠状动脉血管痉挛)、脑血管痉挛、溶血性尿毒症、和性无能。
由内皮释放的物质，最初称为“内皮衍生的松弛因子”(EDRF)，在抑制这些病理性过程中具有重要作用。现在已知EDRF就是一氧化氮(NO)。NO在人的生理学中具有许多作用，包括松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制有丝分裂、使血管平滑肌增殖、和粘附白细胞。因为NO是最具潜力的内源性血管扩张剂，因为它在运动诱导的导管性动脉血管舒张中起主要作用，所以增强NO合成也可以提高正常个体和血管病患者的运动能力。
内皮一氧化氮合酶(eNOS)是对维持全身血压、血管改造、和血管发生起作用的一氧化氮合酶(NOS)异构体(Shesely等人，1996；Huang等人，1995；Rudic等人，1998；Murohara等人，1998)。因为内皮生成的NO不足是动脉粥样硬化和血管损伤的早期而持续的特征，所以经证明，eNOS是血管基因治疗中极有吸引力的靶。虽然eNOS激活的调控机制大部分还不清楚，但eNOS应答多种形式的细胞刺激而发生磷酸化是已知的(Michel等人，1993；Garcia-Cardena等人，1996；Corson等人，1996)，但是磷酸化在一氧化氮(NO)生成中的作用和负责的激酶以前未有阐述。
发明概述本发明部分产生于新发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt(蛋白激酶B)可以直接使eNOS中对应于牛eNOS第1179位残基或人eNOS第1177位残基的丝氨酸残基发生磷酸化并激活eNOS导致生成NO。突变型eNOS(S1179A或S1177A)对Akt磷酸化和激活有抗性，而突变型eNOS(S1179D或S1177D)或(S1179E或S1177E)是具有组成活性的。此外，使用腺病毒介导的基因转移，激活的Akt增强从内皮细胞释放基础NO，而激活缺陷的Akt减少由VEGF刺激的NO生成。因此，eNOS是新描述的Akt底物，这一底物通过Akt将信号转导与气体第二信使NO的释放相联系。本发明部分还基于这两发现突变型eNOS(S1179D)展示能增高NO生成速率和增强还原酶的活性。
本发明包括NOS多肽或蛋白质及其分离的编码核酸分子，其中NOS多肽或蛋白质包含对应于牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的替代氨基酸残基。优选的替代包括R基团带负电的氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸。
本发明还包括NOS多肽或蛋白质及其分离的编码核酸分子，其中NOS多肽或蛋白质包括对应于牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的替代氨基酸残基。优选的替代包括R基团不带负电的氨基酸，诸如丙氨酸。
本发明提供了用于在内源血管发生有缺陷的局部缺血性疾病(尤其是外周血管疾病和/或心肌缺血)患者中刺激侧副血管发育的方法，包括递送编码本发明NOS多肽或Akt多肽的转化基因。
本发明还包括表达本发明NOS多肽的非人转基因动物。
最后，本发明包括用于鉴定调节受Akt调控的NOS活性的试剂的方法，一般包括步骤(a)将试剂与纯化的NOS(优选eNOS或nNOS)或者表达NOS(优选eNOS或nNOS)的细胞，以及Akt接触；并(b)测量受Akt调控的NOS(优选eNOS或nNOS)活性。
图的简述


图1A-1B。是野生型的Akt，而非无激酶活性的Akt增加了由表达膜相关eNOS的细胞释放的NO。在
图1A中，在不存在或存在Akt或无激酶活性的Akt(K179M)的情况下用eNOS的质粒转染COS细胞，通过化学发光测定NO产量(以NO2-测定)。在
图1B中，用如上的各种NOS质粒转染COS细胞。在
图1A和
图1B中，从只用β-半乳糖苷酶转染的细胞获得的水平减去NO2-产量。插图显示了总细胞裂解物中的蛋白质表达。数据是平均值±SEM，n＝3-7次实验；*表示p＜0.05。
图2A-2D。由有活性的Akt在体外和体内进行的eNOS磷酸化。在图2A中，用HA-Akt或HA-Akt(K179M)转染COS细胞，免疫沉淀裂解物，并与作为底物的组蛋白2B(25mg)或重组eNOS(3mg)一起置于体外激酶反应中。上面的图描绘了底物中掺入的32P，下面的图显示了考马斯染色的凝胶中底物的量。在图2B中，从转染的COS细胞亲和纯化32P标记的野生型eNOS或双丝氨酸突变eNOS(eNOS S635/1179)，并进行自显影(上面的图)或Western印迹(下面的图)。图2B中的图形数据反映了凝胶中经标记蛋白质相对于免疫反应性eNOS量的相对量。在图2C中，用胰蛋白酶消化经标记eNOS，并通过RP-HPLC区分肽。上面的层析图记录了一个占优势的经标记胰蛋白酶消化肽，该肽随未标记合成磷肽标准共迁移(下面的层析图)。插图证明了经标记肽(上图)和磷肽标准具有相同的质量-离子的线性模式MS。在图2D中，纯化了重组野生型eNOS或eNOS S1179A，并如上述方法以等量(2.4mg)与重组Akt一起置于体外激酶反应中。图2D的上图描绘了eNOS中掺入的32P，下图显示了考马斯染色的凝胶中底物的量。图形数据(n＝3)反映了标记的eNOS相对于体外激酶反应中eNOS量(考马斯)的相对量。
图3。证明第1179位丝氨酸对于Akt刺激NO释放的功能是重要的。在不存在或存在Akt的情况中，用野生型eNOS或eNOS突变体的质粒转染COS细胞，测定蛋白质表达和NO产量(以NO2-测定)。有趣的是，S1179突变成S的构建物不是由Akt激活的，而S1179突变成D导致获得功能。在A中，数据是4-7次实验的平均值±SEM；*代表显著差异(p＜0.05)。
图4A-4C。Akt在内皮细胞中调控NO的基础和受激生成。在图4A中，用腺病毒构建物(作为对照的β-gal、myr-Akt、和AA-Akt)感染BLMVEC，并测定24小时的NO2-产量(n＝3)。插图显示了eNOS和Akt的表达。在图4B中，检验了腺病毒感染的BLMVEC的裂解物的NOS活性。将等量的蛋白质(50mg)与各种浓度的游离钙一起温育，并测定NOS活性(n＝3次实验)。在图4C中，加上用腺病毒感染BLMVEC，随后用VEGF(40ng/ml)刺激30分钟，并通过化学发光对NO2-释放进行量化。数据表述为减去基础水平后的VEGF刺激的NO2-释放。数据是平均值±SEM，n＝4；*代表显著差异(p＜0.05)。
图5A-5B。野生型和eNOS S1179D的纯度和二聚体/单体比率。在A和B中，进行了SDS-PAGE分析，使用7.5％聚丙烯酰胺凝胶，考马斯蓝染色。分子量标准(第1道)及其大小(以kDa表示)位于左边。野生型eNOS(第2道)和eNOS S1179D(第3道)(每道1μg)由箭头指示。在B中，蛋白质(每道2μg)在SDS-PAGE上于4℃进行电泳分离。分子量标准位于第1道。野生型和eNOS S1179D未煮过的样品依次位于第2道和第3道。在第4道中，野生型eNOS在SDS加样缓冲液中煮过。
图6A-6B。eNOS S1179D比野生型eNOS具有更高速率的NO产量(A)和还原酶活性(B)。在A中，使用血红蛋白捕获实验，作为L-精氨酸浓度的函数，测定了由野生型(●)和S1179D(○)eNOS生成NO的速率，数据以双倒数曲线表述。在B中，在存在或不存在CaM的情况下，进行了DCIP和细胞色素c实验。数值是平均值±S.E.，n＝4-6次测定。由至少3份酶制剂获得相似结果。野生型与S1179D eNOS之间的显著差异(p＜0.05)由星号指示。
图7A-7B。与野生型相比，eNOS S1179D的NOS活性(A)和依赖NADPH的还原酶活性(B)增加对野生型和S1179D eNOS都进行了血红蛋白捕获实验(A)和依赖NADPH的细胞色素c还原实验(B)。在A中，在存在所有NOS辅助因子的情况中，测定了野生型(实心符号)和S1179D(空心符号)eNOS生成NO的速率。在不存在精氨酸和BH4(A)、存在(实心符号)或不存在(空心符号)120nM钙调蛋白的情况下，测定了野生型(圆圈)和S1179D(三角)还原细胞色素c的速率。数值是平均值±S.E.，n＝至少3份酶制剂的3-6次测定。
图8A-8D。对于S1179D eNOS，依赖钙调蛋白和钙的NOS的激活和还原酶活性略微增强。对野生型(实心符号)和S1179D eNOS(空心符号)都进行了依赖钙调蛋白的血红蛋白捕获(A)和细胞色素c还原(B)实验。由血红蛋白捕获方法检测的NO生成速率是在存在所有NOS辅助因子的情况下进行的，而细胞色素c还原是在不存在精氨酸和BH4的情况下进行的。在C和D中，在游离钙浓度增加的情况下，进行了相同实验。C和D中的插图描绘了S1179D和野生型eNOS在NO生成和细胞色素c实验中的依赖钙的转换。野生型和S1179D eNOS的最大转换率依次如下A，22和43min-1；B，620和1400min-1；C，58和100min-1；D，1930和3810min-1。数值是平均值±S.E.，n＝至少3份酶制剂的3-6次测定。
图9A-9B。S1179D eNOS中，由EGTA启动的NOS失活降低。如上所述，和下列修改，进行了血红蛋白捕获实验(A)和还原酶实验(B)。监控反应1分钟以测定起始速率；然后向反应混和物中加入EGTA，并再次监控速率1分钟。反应中的游离钙浓度为200μM，加入的EGTA的量使得螯合剂终浓度为0、200、400、和600μM。将野生型和S1179D eNOS的特异活性相对100％标准化。数值是平均值±S.E.，n＝至少3份酶制剂的3-6次测定。nd表示野生型eNOS无可检测活性。
发明详述A.一般描述本发明部分基于下列发现丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt(蛋白激酶B)可以直接使eNOS的第1179位丝氨酸(人eNOS的第1177位丝氨酸)发生磷酸化并激活导致NO生成的酶而突变型eNOS(S1179A)对Akt磷酸化和激活有抗性。此外，使用腺病毒介导的基因转移，激活的Akt增加了由内皮细胞释放的基础NO，而激活缺陷的Akt减少了VEGF刺激的NO生成。由此，eNOS是新近描述的Akt底物，它通过Akt将信号转导与气体第二信使NO的释放相联系。本发明部分还基于发现突变型eNOS(例如S1179D)展示NO生成速率增加和还原酶活性增加。
NO生成受依赖Akt的eNOS磷酸化调控的论证提供了新的具有组成活性的eNOS突变体，这一突变体可用于与NO合成或生物学活性的功能障碍有关的心血管疾病中，以改进内皮功能为目的的基因治疗。这些疾病包括血管成形术后再狭窄、高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭(包括心肌梗死)、糖尿病、和血管发生缺陷的疾病。此发现还提供了新的治疗靶，可用于设计治疗与NO合成或生物学活性的功能障碍有关的疾病的药物。
本发明还提供了新的具有组成活性的nNOS突变体，这些突变体在大鼠nNOS第1412位或人nNOS第1415位残基有替代氨基酸，可用于目的在于治疗疾病的基因治疗。
B.详细描述NOS突变型蛋白质或多肽的产生本发明提供了NOS蛋白质或多肽、NOS蛋白质的等位基因变体、和NOS蛋白质的保守氨基酸替代，所有这些在Akt介导的磷酸化位点包含丝氨酸残基的突变。例如，本发明的蛋白质或多肽包括(但不限于)(1)包含第1177位丝氨酸向其它氨基酸(诸如丙氨酸)的突变、且对Akt介导的磷酸化有抗性的人eNOS蛋白质(Janssens等人，生物化学杂生(J.Biol.Chem.) 26714519-14522，1992，本文中全文引用作为参考)；(2)包含第1179位丝氨酸向其它氨基酸(诸如丙氨酸)的突变、且对Akt介导的磷酸化有抗性的牛eNOS蛋白质(美国专利5,498,539的SEQ ID NO2，在本文中全文引用作为参考)；(3)包含第1415位丝氨酸向其它氨基酸(诸如丙氨酸)的突变、且对Akt介导的磷酸化有抗性的人nNOS蛋白质；(4)包含第1412位丝氨酸向其它氨基酸(诸如丙氨酸)的突变、且对Akt介导的磷酸化有抗性的大鼠nNOS蛋白质；(5)包含第1177位丝氨酸向R基团带负电的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)的突变、且组成性有活性并展示NO生成增加和还原酶活性增加的人eNOS蛋白质；(6)包含第1179位丝氨酸向R基团带负电的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)的突变、且组成性有活性并展示NO生成增加和还原酶活性增加的牛eNOS蛋白质；(7)包含第1415位丝氨酸向R基团带负电的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)的突变、且组成性有活性并展示NO生成增加和还原酶活性增加的人nNOS蛋白质；(8)包含第1412位丝氨酸向R基团带负电的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)的突变、且组成性有活性并展示NO生成增加和还原酶活性增加的大鼠nNOS蛋白质；和(9)来自除了人、牛、或大鼠之外的物种，经修饰在对应于人eNOS第1177位、牛eNOS第1179位、大鼠nNOS第1412位、和人nNOS第1415位丝氨酸的位置包含除了丝氨酸之外的氨基酸，且或是对Akt介导的磷酸化有抗性；或是具有组成活性的，抑或展示NO生成增加和还原酶活性增加的eNOS蛋白质。NOS突变体还可以通过突变磷酸化基序RXRKXS/T中的其它氨基酸来产生。
本发明提供了展示NO生成和还原酶活性增加、并在Akt介导的磷酸化位点的丝氨酸残基处包含突变的具有组成活性的NOS多肽(优选eNOS或nNOS)。获得展示NO生成和还原酶活性增加的这些NOS多肽的保守性变体(诸如替代、删除、和插入突变体)同样属于本领域技术范畴。如本文所用，保守性变体指对具有组成活性的NOS(优选eNOS或nNOS)生成NO的能力或具有组成活性的NOS(优选eNOS或nNOS)的还原酶活性无不良影响的氨基酸序列中的改变。当改变后的序列影响组成性NOS的能力使得NO生成水平和还原酶活性不比野生型NOS高时，则说替代、插入、或删除对具有组成活性的NOS多肽有不良影响。例如，可以改变组成性NOS的总电荷、结构、或疏水/亲水特性，而对组成性NOS的活性无不良影响。因此，可以改变NOS多肽的氨基酸序列，例如使得多肽更疏水或亲水，而对NOS的活性无不良影响。
如在本文中所用，“具有组成活性的”NOS突变体或变体，无论是经修饰的还是天然来源的，是指生成NO的速率高于在对应于人NOS第1177位残基或牛NOS第1179位残基的氨基酸残基处包含未磷酸化形式的丝氨酸的天然NOS的NOS蛋白质(优选eNOS或nNOS)。优选的具有组成活性的变体在对应于人NOS第1177位或牛NOS第1179位的氨基酸残基处包含R基团带负电的氨基酸，诸如天冬氨酸或谷氨酸。
本发明提供了NOS蛋白质或多肽、NOS蛋白质的等位基因变体、和包含对应于牛eNOS第1177位残基、人eNOS第1179位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的替代氨基酸残基的NOS蛋白质的保守氨基酸替代，其中替代氨基酸残基的R基团不带负电，诸如丙氨酸。
本发明的NOS蛋白质(优选eNOS或nNOS蛋白质)可以是分离的形式。如在本文中所用，当采用物理的、机械的、或化学的方法从通常与蛋白质结合的细胞成分中移取蛋白质时，则说蛋白质是分离的。熟练技术人员可以容易地采用标准纯化方法来获得分离的蛋白质。
本发明还包括跨越对应于牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的Akt磷酸化位点的NOS肽。肽可以在磷酸化位点包含丝氨酸，或者优选地在对应于牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的位置处包含丝氨酸的替代氨基酸。这些替代氨基酸包括(但不限于)R基团模拟磷酸化状态丝氨酸的氨基酸，诸如天冬氨酸或谷氨酸。这些替代还包括R基团不带负电的氨基酸，诸如丙氨酸。跨越此位点的肽的长度可以是3、5、7、10、12、15、17、20、25、30、40、50、或更多氨基酸。
可以通过可获得的任何方法来制备本发明的NOS蛋白质、多肽、或肽，包括从经修饰取代或改变了编码对应于人eNOS第1177位、牛eNOS第1179位、大鼠nNOS第1412位、或人nNOS第1415位丝氨酸的丝氨酸的核苷酸三联体的NOS cDNA重组表达。任何可获得的技术都可用于突变编码丝氨酸残基的核苷酸三联体，诸如同源重组、定点诱变、或PCR诱变(参阅Sambrook等人，《分子克隆》(Molecular Cloning)，冷泉港实验室出版社，1989)。起始的cDNA可以包括人和牛eNOS cDNA，以及编码其它动物物种的eNOS蛋白质的cDNA，包括(但不限于)兔、大鼠、小鼠、猪、羊、马、和非人灵长类物种。
如在本文中所用，当核酸分子基本上与核酸来源中编码其它多肽的污染核酸分开时，则说编码NOS蛋白质或多肽(优选eNOS或nNOS蛋白质或多肽)的本发明核酸分子是“分离的”。
本发明还提供了编码核酸分子的片段。如在本文中所用，编码核酸分子的片段指完整蛋白质编码序列的一小部分。片段的大小将由意欲用途决定。例如，如果片段是选择用来编码蛋白质的活性部分的，那么片段的长度将需要足以编码蛋白质的功能区，包括Akt磷酸化位点。如果片段是用作核酸探针或PCR引物，那么在探查跨越NOS中Akt磷酸化位点的区域或引发NOS Akt磷酸化位点的侧翼区域的过程中，选择的片段长度将获得较小数目的假阳性。
可以容易地通过化学技术，例如Matteucci等人(美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.) 1033185-3191，1981)的磷酸三酯法，或者使用自动合成法，合成作为探针或特异引物(用于聚合酶链反应(PCR)，或用于合成编码本发明蛋白质的基因序列)使用的本发明的编码核酸分子的片段(即合成寡核苷酸)。另外，通过众所周知的方法可以容易地制备较大的DNA片段，诸如合成一组定义基因各个模块片段的寡核苷酸，随后连接这些寡核苷酸以构建完整修饰的基因。
本发明的编码核酸分子还可以进一步修饰从而包含用于诊断和探测目的的可检测标记。本领域已知多种这样的标记，而且可以容易地与在本文中所述的编码分子一起采用。合适的标记包括(但不限于)生物素、放射性标记核苷酸、等等。熟练技术人员可以采用任何本领域已知的标记来获得已标记的编码核酸分子。
本发明还提供了包含上述NOS编码序列的重组DNA分子(rDNA)。如在本文中所用，rDNA分子是进行了分子操作的DNA分子。产生rDNA分子的方法在本领域是众所周知的，参阅Sambrook等人，《分子克隆》(Molecular Cloning)，1989。在优选的rDNA分子中，编码DNA序列是与表达控制序列和/或载体序列可操作连接的。
正如本领域众所周知的，与本发明蛋白质家族编码序列之一可操作连接的载体和/或表达控制序列的选择直接取决于期望的功能特性(如蛋白质表达)和转化的宿主细胞。本发明所关注的载体至少能够指导rDNA分子中包含的结构基因的复制或插入宿主染色体中，优选还能够表达。
用于调控可操作连接的蛋白质编码序列的表达的表达控制元件在本领域是已知的，包括(但不限于)可诱导启动子、组成性启动子、分泌信号、和其它调控元件。优选的可诱导启动子是易于控制的，诸如应答宿主细胞培养基中的营养。
在一个实施方案中，含编码核酸分子的载体将包括原核复制子，即在用重组DNA分子转化的原核宿主细胞(诸如细菌宿主细胞)中具有指导其自主复制并维持在染色体外的能力的DNA序列。这些复制子在本领域是众所周知的。另外，包含原核复制子的载体还可以包含其表达给出可检测标记(诸如药物抗性)的基因。典型的细菌药物抗性基因是给出氨苄青霉素或四环素抗性的基因。
包含原核复制子的载体还可以包含能够在细菌宿主细胞(诸如大肠杆菌)中指导编码基因序列表达(转录和翻译)的原核或噬菌体启动子。启动子是由允许RNA聚合酶结合和启动转录的DNA序列形成的表达控制元件。与细菌宿主兼容的启动子序列通常供应在含便于插入本发明DNA片段的限制性位点的质粒载体中。这些载体质粒的典型例子是可以从Biorad Laboratories(Richmond，CA)获得的pUC8、pUC9、pBR322、和pBR329，和可以由Pharmacia(Piscataway，NJ)获得的pPL和pKK223。
与真核细胞兼容的表达载体，优选与脊椎动物细胞兼容的表达载体，也可以用于形成含编码序列的rDNA分子。真核细胞表达载体在本领域是众所周知的，可以由多个商业性来源获得。通常，提供的这些载体包含便于插入需要的DNA片段的限制性位点。这些载体的典型例子是pSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies公司)、pTDT1(ATCC编号31255)、等等真核表达载体。
用于构建本发明rDNA分子的真核细胞表达载体还可以包含在真核细胞中有效的可选择标记，优选药物抗性选择标记。优选的药物抗性标记是其表达导致新霉素抗性的基因，即新霉素磷酸转移酶(neo)基因(Southern等人，分子和分析遗传学杂志(J.Mol.Anal.Genet.) 1327-341，1982)。或者，可选择标记可以存在于另一个质粒上，且通过共转染宿主细胞导入两种载体，并通过在对应可选择标记的适当药物中培养来进行选择。
本发明还提供了用编码本发明NOS蛋白质(优选eNOS或nNOS蛋白质)的核酸分子转化或转染的宿主细胞。宿主细胞可以是原核的或真核的。可用于表达本发明蛋白质的原核细胞是不受限制的，只要细胞系与细胞培养方法兼容且与表达载体的增殖和基因产物的表达兼容。优选的真核宿主细胞包括(但不限于)酵母、昆虫、和哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞，诸如来自小鼠、大鼠、猴、或人细胞系的细胞。优选的真核宿主细胞系包括可以从ATCC以CCL61号获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、可以从ATCC以CRL1658号获得的NIH瑞士小鼠胚胎细胞NIH/3T3、仓鼠幼体肾细胞(BHK)、等等真核组织培养细胞系。任何原核宿主都可用于表达编码本发明蛋白质的rDNA分子。特定地，对于具有组成活性的NOS突变体，优选的原核宿主是大肠杆菌。
可以使用众所周知的方法实现用本发明rDNA分子转化或转染合适的细胞宿主，方法通常取决于所采用的载体类型和宿主系统。至于原核宿主细胞的转化，通常采用电穿孔和盐处理方法，参阅例如Cohen等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)692110，1972；和Maniatis等人，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，NY，1982。至于用含rDNA的载体转化脊椎动物细胞，通常采用电穿孔、阳离子脂类、或盐处理方法，参阅例如Graham等人，病毒学(Virol.) 52456，1983；和Wigler等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)761373-1376，1979。可以使用众所周知的技术，包括选择可选择标记，来鉴定经成功转化或转染的细胞，即包含本发明rDNA分子的细胞。例如，可以克隆导入了本发明rDNA的细胞以产生单个菌落。收获并裂解那些菌落的细胞，使用诸如Southern(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.) 98503，1975)或Berent等人(生物技术(Biotech.) 3208，1985)描述的方法，对它们的DNA内容物，检验rDNA的存在，或者使用免疫学方法，检验细胞的蛋白质生成。
本发明还提供了使用在本文中所述的核酸分子生产本发明NOS蛋白质(优选eNOS蛋白质或nNOS蛋白质)的方法。一般而言，重组形式蛋白质的生成通常涉及下列步骤。首先获得编码本发明蛋白质的核酸分子。如果编码序列未被内含子中断，那么它直接适用于在任何宿主中表达。然后，如上所述，优选将核酸分子与合适的控制序列可操作连接以形成含蛋白质开放读码框的表达单位。将表达单位用于转化或转染合适的宿主，并在允许重组蛋白质生成的条件下培养经转化或经转染的宿主。任选地，由培养基或细胞分离重组蛋白质；在容忍一些杂质的某些情况中，蛋白质的回收和纯化可能是不必要的。
可以以多种方式进行上述任一步骤。例如，需要的编码序列可以从基因组片段获得，并直接用于合适的宿主中。如上所述，使用合适的复制子和控制序列完成在各种宿主中可操作的表达载体的构建。控制序列、表达载体、和转化或转染方法取决于表达基因的宿主细胞的类型，而且以前已经详细讨论过。如果不能以通常方式获得合适的限制性位点，那么可以添加在编码序列的末端，从而提供将插入这些载体中的可切割基因。熟练技术人员可以容易地采用本领域已知的任何宿主/表达系统，与本发明核酸分子一起，用于生产重组蛋白质。
基因治疗本发明涵盖与使用最合适的递送路径的适宜的基因表达系统相结合的任何合适的基因递送系统。例如，可以在体外或在体内将本发明的NOS突变或变异基因(优选eNOS或nNOS突变或变异基因)或Akt基因转移至心脏(或骨骼肌)，包括心肌细胞(和骨骼肌细胞)以指导所编码的蛋白质的生成。特别有用的是人Akt基因和NOS突变体，优选地，在对应于人eNOS第1177位丝氨酸处包含R基团带负电的氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)的人eNOS。施用NOS突变体或变异基因的路径包括(但不限于)血管内、肌肉内、腹膜内、真皮内、和动脉内注射。
腺病毒基因递送系统提供了几种优势腺病毒可以(i)接纳较大的DNA插入片段；(ii)生长至高滴度；(iii)感染广泛的哺乳动物细胞类型；和(iv)与大量可获得的含不同启动子的载体一起使用。并且，因为腺病毒在血流中是稳定的，所以它们可以通过静脉内注射来给药。优选的递送载体是不依赖辅助噬菌体的复制缺陷型人腺病毒5，但是也可以获得并使用其它递送方法，包括直接向感兴趣的细胞递送核酸(参阅Sawa等人，基因治疗(Gene Ther.)5(11)1472-1480，1998；Labhasetwar等人，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.) 87(11)1347-1350，1998；Lin等人，高血压(Hypertension)30307-313，1997；Chen等人，循环研究(Circ.Res.)80(3)327-335，1997；Channon等人，心血管研究(Cardiovasc.Res.)32962-972，1996；Harv Heart Lett.9(8)5-6，1999；和Nabel等人，自然医学(Nat. Med.)5(2)141-142，1999)。
已经证明，使用腺病毒5系统，通过一次冠状动脉内注射，在体内心肌细胞中转染率超过60％(Giordano和Hammond，临床研究(Clin.Res.) 42123A，1994)。非复制重组型腺病毒载体在转染冠状动脉内皮和心肌细胞中特别有用，在冠状动脉内注射后产生高效率的转染。非复制重组型腺病毒载体还可用于转染外周血管系统的目的细胞(参阅美国专利5,792,453，在本文中全文引入作为参考)。
可以通过Graham等人(病毒学(Virology) 163614-617，1988)描述的挽救重组技术来构建用于本发明的腺病毒载体。简而言之，将eNOS转基因克隆到含启动子、多接头、和删除了E1A/E1B基因的部分侧翼腺病毒序列的穿梭载体中。作为穿梭载体，可以以质粒pAC1(或其类似物)和质粒ACCMVPLPA作为例示质粒pAC1(病毒学(Virology)163614-617，1988)(或其类似物)编码人腺病毒5基因组(病毒学(Virology)163614-617，1988)左端部分，但是减去了编码对病毒复制重要的早期蛋白质的E1A和E1B序列；而质粒ACCMVPLPA(生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 26725129-25134，1992)含多接头、CMV启动子、和SV40多聚腺苷酸化信号的，以删除了E1A/E1B基因的部分腺病毒序列为侧翼。质粒PAC1和ACCMVPLA的使用有助于克隆过程。然后将穿梭载体与含长度大得不能装囊的完整人腺病毒5基因组的质粒一起共转染到293细胞中。可以通过磷酸钙沉淀或脂质感染(生物技术(Biotechniques)15868-872，1993)进行共转染。质粒JM17编码完整人腺病毒5基因组，加上载体pBR322的一部分，包括氨苄青霉素抗性基因(4.3kb)。虽然JM17编码产生成熟病毒颗粒所需的所有腺病毒蛋白质，但是它太大了，不能装囊(40kb，野生型为36kb)。在一个小子集的共转染细胞中，含转基因的穿梭载体(转染质粒pAC1)与含完整腺病毒5基因组的质粒(诸如pJM17)之间的挽救重组提供了E1A/E1B序列缺陷的重组基因组，它包含需要的转基因，但是在重组过程中失去了其它序列，诸如pBR322序列，因此小得足以装囊。使用X-gal处理，可以将编码腺病毒HCMVSP1 lacZ(临床研究(Clin.Res.) 42123A，1994)的CMV驱动的β-半乳糖苷酶用于评价基因转移的效率。
在另一个实施方案中，通过减毒型或缺陷型DNA病毒，诸如(但不限于)单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、Epstein-Barr病毒(EBV)、腺病毒、和腺伴随病毒(AAV)，可以将编码NOS(优选eNOS或nNOS)的基因导入体内。完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒是优选的。缺陷型病毒在导入细胞后没有感染性。使用有缺陷的、有生命的载体能够施用于特异的、定位的区域中的细胞，而不用担心载体会感染其它细胞。因此，可以将载体特异靶向特定区域，如脑或脊髓中的特定区域。在特定的实施方案中，可以使用缺陷型疱疹病毒1(HSV1)(Kaplitt等人，分子和细胞神经科学(Mol.Cell.Neurosci.) 2320-330，1991)。在另一个实施方案中，病毒载体是减毒型腺病毒载体，诸如Straford-Perricaudet等人(临床调查杂志(J.Clin.Invest.) 90626-630，1992)描述的载体。在另一个实施方案中，载体是缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski等人，病毒学杂志(J.Virol.) 613096-3101，1987；和Samulski等人，病毒学杂志(J.Virol.) 633822-3828，1989)。
本发明还关注不仅由递送转基因到例如冠状动脉或股动脉中还有利用组织特异启动子进行的细胞靶向的使用。例如通过将左心室肌球蛋白轻链-2(MLC[2V])或肌球蛋白重链(MHC)的组织特异的转录控制序列与诸如腺病毒构建物中的本发明NOS基因的转基因融合，转基因的表达就限制于心室心肌细胞中。使用本发明的重组腺病毒系统，测定了与lacZ一起的MLC[2V]和MHC启动子提供的基因表达的功效和特异性程度。以前，Lee等人(生物化学杂志(J.Bool.Chem.) 26715875-15885，1992)已经报导了心脏特异表达。MLC[2V]启动子包含250bp，而且易于适应腺病毒5包装的限制。已知是旺盛的转录启动子的肌球蛋白重链启动子提供了合理的备选的心脏特异启动子，它包含少于300bp。平滑肌细胞启动子，诸如SM22α启动子(Kemp等人，生化杂志(Biochem.J.)310(Pt3)1037-1043，1995)和SMα肌动蛋白启动子(Shimizu等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 270(13)7631-7643，1995)也是可以获得的。其它启动子，诸如肌钙蛋白-C启动子，虽然高效且足够小，但是欠缺适当的组织特异性。通过使用MLC[2V]或MHC启动子并体内递送转基因，相信只有心肌细胞将提供NOS蛋白质的适当表达，而在心脏的内皮细胞、平滑肌细胞、和成纤维细胞中没有伴随表达。
受限于心肌细胞的表达还具有将基因转移用于心肌缺血临床治疗的优势。通过限制于心脏的表达，避免了对非心脏组织(诸如视网膜)中的血管发生的潜在有害影响。另外，在心脏的各种细胞中，肌细胞将有可能提供最长的转基因表达，因为这种细胞不进行快速转换，由此表达将不会被与内皮细胞一起发生的细胞分裂和死亡所降低。可用于此目的的内皮特异的启动子早已获得。内皮特异启动子的范例包括Tie-2启动子(Schlaeger等人，美国国家科学院院报(Proc.Nat1.Acad.Sci.USA)94(7)3058-3063，1997)、内皮素启动子(Lee等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26510446-10450，1990)、和eNOS启动子(Zhang等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270(25)15320-15326，1995)。
在心脏病治疗方面，本发明包括用高滴度的载体通过冠状动脉内或肌肉内注射靶向心脏，目前优选的是转染所有细胞类型。如上所述，可以使用NOS转基因(优选eNOS或nNOS转基因)治疗诸如勃起障碍等疾病和心血管疾病(包括心肌梗死、心肌缺血、心力衰竭、再狭窄、支架狭窄、血管成形术后狭窄、和旁路移植失败)。
可以按照标准方法对成功的重组载体进行噬菌斑纯化。将获得的病毒载体在反向提供E1A和E1B功能的293细胞上繁殖至优选滴度范围为约1010-约1012病毒颗粒/ml。可以在80％汇合时感染细胞，并于48小时后收获。3次冻融循环后，通过离心沉淀细胞碎片，并通过CsCl梯度超速离心(优选双CsCl梯度超速离心)纯化病毒。在体内注射之前，通过Sepharose层析柱(诸如G25 Sephadex)的凝胶过滤将病毒原液脱盐。然后将产物滤过30μm滤器，由此降低未经过滤的病毒在冠状动脉内注射时的有害影响(危及生命的心脏心率失常)并促进有效的基因转移。获得的病毒原液的最终病毒滴度范围是1010-1012病毒颗粒/ml。重组腺病毒必须是高度纯化的，不含野生型(潜在能复制)病毒。不纯的构建物能够在宿主动物中引起强烈的免疫应答。关于这一点，可以通过例如引物合适的PCR鉴定成功的重组体、进行两轮噬菌斑纯化、和双CsCl梯度超速离心，进行繁殖和纯化以除去污染和野生型病毒。另外，通过在冠状动脉内注射之前将重组腺病毒滤过合适大小的滤器，可以避免与给患者注射腺病毒载体诱导的心脏心率失常有关的问题。这种策略似乎从本质上改进了基因转移和表达。
如果需要，病毒原种可以是含制药学可接受载体(如盐)的可注射制剂的形式。优选地，载体在可注射制剂中的终滴度能够有效转移基因的范围，大约107-大约1013病毒颗粒。下文描述了其它制药学载体、配方、和剂量。使用基于经皮导管的标准方法，在荧光镜指导下，通过直接的冠状动脉内(或移植血管)注射，以足以将转化基因表达到允许高效治疗的剂量向心肌膜递送腺病毒转基因构建物。可以深入冠状动脉(或移植血管)的内腔(动脉内腔内大约1cm)进行注射，优选在两条冠状动脉中都进行注射，因为侧血管的生长在患者个体中是高度可变的。通过经冠状动脉导管直接向冠状动脉注射物质，相当有效地靶击基因并在注射过程中将主动脉近端的重组载体的损失最小化是有可能的。已知，在冠状动脉内注射后的任何时候，以这种方式递送的基因不会在肝细胞中表达，而且不会在尿中发现病毒RNA。本发明可以使用各种冠状动脉导管，或者例如Stack灌注导管。另外，可以使用本领域普通技术人员已知的其它技术来向动脉壁转移NOS基因(优选地eNOS或nNOS)。
对于外周血管疾病，特征为腿部供血不足的疾病的治疗，可以通过在股动脉或动脉近端插入导管递送表达本发明NOS(优选地，eNOS或nNOS)蛋白质或肽的重组腺病毒，由此使基因转到由股动脉供血的骨骼肌细胞中。
在首先将编码本发明NOS(优选eNOS或nNOS)或Akt蛋白质的转基因或核酸转移到体外内皮或血管平滑肌细胞(包括患者自身细胞)的情况中，可以将DNA直接转染到细胞中(参阅美国专利5,658,565)。一般而言，为了转染靶细胞，可以在脂质体介导的靶细胞转染中利用含编码本发明的Akt或NOS的DNA序列或其有生物学活性的片段的质粒载体。与这些囊泡的不可渗透的本质相关的脂质体稳定性使得它们可用于治疗性DNA序列的递送(综述参阅Mannino和Gould-Forgerite，生物技术(BioTechniques)6(7)682-690，1988)。已知脂质体被许多细胞类型通过融合而吸收。在一个实施方案中，可以利用含阳离子胆固醇衍生物(诸如SF-chol或DC-chol)的阳离子脂质体。如Gao和Huang(生化和生理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)179280-285，1991)所述，DC-chol分子包含叔氨基、中等长度的间隔臂、和氨甲酰接头键。
在关于使用脂质体的技术的另一个实施方案中，用脂质转染胺试剂(Bethesda Research Laboratory)转染靶细胞，向靶细胞递送含编码有生物学活性的NOS蛋白质片段(优选eNOS或nNOS蛋白质片段)的DNA序列的基于病毒或非病毒的载体。脂质转染胺是多聚阳离子脂质2，3-二油氧基-N-[2(精胺羧酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOPSA)与中性脂质二油酰基-磷脂酰乙醇胺的(DOPE)的3∶1脂质体配方。
其它非病毒模式的基因递送包括(但不限于)(a)直接注射裸露的DNA；(b)磷酸钙[Ca3(PO4)2]介导的细胞转染；(c)通过电穿孔转染哺乳动物宿主细胞；(d)DEAE-葡聚糖介导的细胞转染；(e)聚凝胺介导的递送；(f)原生质体融合；(g)微注射；和(h)聚赖氨酸介导的转化，将经基因工程改造的细胞转移回哺乳动物宿主。
转基因动物的产生本发明还包括含上述突变型NOS基因(优选突变型eNOS或nNOS基因)的转基因动物。转基因动物是已经实验性地转移了重组的、外源的、或克隆的遗传材料的经遗传修饰的动物。这些遗传材料常常称为“转基因”。转基因的核酸序列(在这个案例中是NOS形式)可以整合至在其它情况下通常没有发现该特定核酸序列的基因组的一个基因座或者转基因的通常基因座中。转基因可以包含从靶动物物种的相同物种或不同物种的基因组中得到的核酸序列。
术语“微生物细胞系转基因动物”指将基因的变化或遗传信息导入微生物细胞系的转基因动物，由此赋予转基因动物将遗传信息传递给后代的能力。如果这些后代真的具有一些或所有这样的变化或基因信息，那么它们也是转基因动物。
这样的变化或遗传信息可以是对于受体所属的动物物种是外来的，只对于特定的个别受体是外来的，或可以是受体早已具有的遗传信息。在最后一种情况中，改变或诱导的基因可以与天然基因的表达不同。
转基因动物可以由多种不同的方法产生，包括转染、电穿孔、微注射、胚胎杆细胞中的基因靶向、和重组病毒和逆转录病毒感染(参阅例如美国专利号4,736,866；美国专利号5,602,307；Mullins等人，高血压(Hypertension)22(4)630-633，1993；Brenin等人，外科学和肿瘤学(Surg.Oncol.) 6(2)99-110，1997；Tuan(编)，重组基因表达方案，《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，NO.62，Humana Press，1997)。
大量的重组或转基因小鼠已经产生，包括表达激活的癌基因序列(美国专利号4,736,866)；表达猴SV40 T抗原(美国专利号5,728,915)；干扰素调控因子1(IRF-1)的表达缺失(美国专利号5,731,490)；展示多巴胺异常(美国专利号5,723,719)；至少表达一种参与血压控制的人基因(美国专利号5,731,489)；展示与天然发生的Alzheimer病中存在的状态具有较高相似性(美国专利号5,720,936)；介导细胞粘附的能力降低(美国专利号5,602,307)；具有牛生长激素基因(Clutter等人，遗传学(Genetics)143(4)1753-1760，1996)；或能够产生完全人抗体应答(McCarthy，柳叶刀(The Lancet)349(9049)405，1997)的小鼠。
当小鼠和大鼠仍然是大多数转基因实验的选择动物时，在某些情况中，优选地或甚至必须使用其它动物物种。转基因方法已经成功地用于多种非鼠动物，包括绵羊、山羊、猪、狗、猫、猴、黑猩猩、仓鼠、兔、牛、和豚鼠(参阅如Kim等人，分子生殖和发育(Mol.Repord.Dev.)46(4)515-526，1997；Houdebine，生殖营养学发展(Reprod.Nutr.Dev.)35(6)609-617，1995；Petters，生殖生育能力和发育(Reprod.Fertil.Dev.)6(5)643-645，1994；Schnieke等人，科学(Science)278(5346)2130-2133，1997；和Amoah，动物科学(Animal Science)75(2)578-585，1997)。
将核酸片段导入能重组活性态哺乳动物细胞的方法可以是支持多种核酸分子共转化的任何方法。本领域技术人员可以容易地获得用于生产转基因动物的详细步骤，包括美国专利号5,489,743和美国专利号5,602,307。此外，NOS转基因动物的生产发展得很好。例如，已经产生了可诱导地表达或过度表达野生型eNOS的转基因小鼠(参阅Ohashi等人，临床调查杂志(J.Clin.Invest.) 102(12)2061-2071，1998；和Drummond等人，临床调查杂志(J.Clin.Invest.) 102(12)2033-2034，1998)。这些方法可用于产生表达本发明NOS突变体的转基因小鼠。
治疗性筛选实验eNOS的磷酸化能够调控其活性的发现使得能够发展筛选实验来鉴定调节Akt调控的NOS(优选eNOS或nNOS)活性或表达的试剂。可以使用任何可获得的形式，包括体内转基因动物实验、体外基于蛋白质的实验、细胞培养实验、和高生产率形式。
在测试化合物文库的许多药物筛选程序中，需要将高通量实验用于在给定的时间段里普查最多数目的化合物。在诸如由纯化的或半纯化的蛋白质得到的无细胞系统中进行的实验，常常优选地称为“初级”筛选，因为创造这些实验方法允许快速发展并较容易地检测由待测化合物介导的分子靶中的变化。此外，在体外系统中通常可以忽略待测化合物的细胞毒性和/或生物有效度的影响，实验改为集中研究可能在例如对分子间结合的抑制中显现出来的药物对分子靶的影响。
例如，可以通过将COS-7细胞(100mm培养皿)涂板并使用磷酸钙用NOS(7.5-30mg)和Akt(1mg)质粒转染，由此进行基于细胞或组织培养的实验。为了平衡所有的转染，可以共转染β-半乳糖苷酶cDNA的表达载体。转染后24-48小时，可以通过Western印迹分析，使用eNOS mAb(9D10，Zymed)、HA mAb(12CA5，Boehringer Mannheim)、iNOS pAb(Zymed Laboratories)、或nNOS mAb(Zymed Laboratories)确认合适蛋白质的表达(40-80mg)。
转染后24-48小时，如其所述(Sessa等人，1995)，处理培养基，通过特异于NO的化学发光来测量水溶液中NO的稳定分解产物，亚硝酸盐(NO2-)。将培养基除蛋白，并将含NO2-的样品在含碘化钠的冰醋酸中回流。在这些条件下，NO2-定量地还原成NO，在NO分析仪(Sievers，Boulders，CO)中与臭氧反应后通过化学发光检测仪定量NO。在所有实验中，可以通过使用NOS抑制剂抑制NO2-释放来制备对照。另外，可以将用β-半乳糖苷酶cDNA转染的细胞的NO2-释放减去对照作为血清或培养基的NO2-背景水平。如上所述，对于NO生成，在COS中积累cGMP也可以作为生物测定实验。如以前所述(Garcia-Cardena等人，1998)，在备选形式中，3H-L-精氨酸向3H-L-瓜氨酸的转变可用于测定COS细胞或内皮细胞裂解物中的NOS活性。
对于体内磷酸化研究，可以用野生型或S635(对照)、牛1179A、D、E eNOS、人1177D或E eNOS、大鼠1412D或E nNOS、人1415D或E nNOS、和HA-Akt的cDNA转染COS细胞过夜。转染后36小时，将细胞在含经透析的血清、无磷酸盐、添加了80μCi/ml32P正磷酸的Dulbecco极限必需培养基中放置3小时。在无磷酸盐培养基中，一部分细胞可以用渥曼青霉素(500nM)预处理1小时，在标记过程中也可以用该青霉素预处理(500nm)。然后收获裂解物，如以前所述，将NOS溶解并通过ADP Sepharose亲和层析法部分纯化，SDS-PAGE(7.5％)后通过自显影观察NOS中掺入32P，并通过针对NOS的Western印迹检验NOS蛋白质的量。
对于体外磷酸化研究，将从大肠杆菌纯化的重组NOS、从另一来源纯化的eNOS、或跨越Akt磷酸化位点的NOS肽与从转染的COS细胞免疫沉淀的野生型或无激酶活性的Akt一起温育。简而言之，将NOS蛋白质或肽与32P-ATP(2ml，特异活性3000Ci/mmol)、ATP(50mM)、DTT(1mM)一起，在含HEPES(20mM，pH＝7.4)、MnCl2(10mM)、MgCl2(10mM)、和免疫沉淀Akt的缓冲液中于室温温育20分钟。
在检验野生型和突变型NOS的体外磷酸化的实验中，使用与上述基本相同的条件，将从杆状病毒感染的SF9细胞纯化的重组Akt(1mg)与野生型、S1179A牛eNOS、S1177A人eNOS、S1179D或E牛eNOS、S1177D或E人eNOS、S1412D或E大鼠nNOS、或者S1415D或E人nNOS一起温育。可以通过SDS-PAGE分辨蛋白质，并如上通过考马斯染色测定蛋白质的量。
测定依赖Akt的NOS磷酸化或激活的上述筛选实验可以用于筛选广泛的各种试剂。例如，在对应于牛eNOS第1179位、人eNOS第1177位、大鼠nNOS第1412位、或人nNOS第1415位丝氨酸的氨基酸处抑制NOS发生磷酸化的试剂(磷酸酶抑制剂)可能是有用的治疗分子。相似地，激活Akt或模拟eNOS上Akt磷酸化位点的试剂也可能是有用的治疗分子。
可以随机选择或者合理地选择或设计在上述方法中分析的试剂。如在本文中所用，当随机选择试剂而不考虑涉及本发明蛋白质单独或与其底物、结合配偶、等等一起结合的特异序列时，则说试剂是随机选择的。随机选择的试剂的范例是利用化学文库或肽组合文库，或者生物体的生长培养基。
如在本文中所用，当在非随机的基础之上考虑到靶位点的序列和/或其与试剂作用相关构象来选择试剂时，则说试剂是理性选择或设计的。例如，理性选择的肽试剂可以是其氨基酸序列与NOS中的Akt磷酸化位点相似的肽，特别是模拟NOS磷酸化位点的肽或小分子。
作为范例，本发明的试剂可以是肽、小分子、维生素衍生物、以及碳水化合物。熟练技术人员可以容易地认识到，本发明试剂的结构特性是没有限制的。
如本领域已知的，本发明的肽试剂可以使用标准固相(或液相)肽合成方法来制备。另外，可以使用商品化的寡核苷酸合成仪器来合成，并使用标准重组生产系统来重组生产编码这些肽的DNA。如果待包含非基因编码的氨基酸，那么必须使用固相肽合成法来生产。
本发明的另一类试剂是对本发明蛋白质的决定性位点具有免疫反应性的抗体。抗体试剂是用含抗原区(意欲作为抗体的靶的那些蛋白质部分)的肽免疫合适的哺乳动物主体来获得的。
经鉴定调节eNOS活性的试剂的用途已鉴定的试剂在调节eNOS活性时的用途经胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、穿真皮、或口腔途径可以给药本发明的试剂，诸如抑制NOS在对应于牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基丝氨酸的氨基酸处发生磷酸化的试剂(磷酸酶抑制剂)，以及激活Akt或模拟NOS上的Akt磷酸化位点的试剂。或者或同时，可以通过口服给药。给药的剂量将取决于受体的年龄、健康、和体重，并行治疗的种类，如果有，治疗的频率，和期望效果的本质。如下文所述，存在许多可以容易地用于给药这些试剂的方法。
本发明还提供了含一种或多种本发明试剂的组合物。当个体需要发生变化时，决定每种成分的有效量的最佳范围属于本领域技术范畴。典型的剂量范围是0.1-100mg/kg体重。优选的剂量范围是0.1-10mg/kg体重。最优选的剂量范围是0.1-1mg/kg体重。
除了有药学活性的试剂，本发明的组合物还包含合适的药学可接受的载体，这些载体包括有助于将活性化合物加工成可以以药物形式递送至作用位点的制剂的赋形剂和辅药。用于胃肠外给药的合适配方包括水溶形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性盐。另外，也可以给药活性化合物的悬浮液，如适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪油酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射悬浮液可以包含，增加悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇、和/或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含稳定剂。还可以利用将脂质体装囊试剂，以递送到细胞中。
可以配制根据本发明的用于全身给药的药物制剂，用于肠、胃肠外、或局部给药。事实上，可以同时使用所有三种类型的配方以实现活性成分的全身给药。
用于口服给药的合适配方包括硬的或软的明胶胶囊、药丸、药片(糖衣片)、酏剂、悬浮液、糖浆、或吸入剂及其受控释放形式。
在本发明方法的实践中，本发明的化合物可以单独或组合使用，或者与其它治疗性或诊断性试剂组合使用。在某些优选实施方案中，本发明的化合物可以与通常接受的医学实践条件中开出的药方中的其它化合物共给药，诸如抗凝剂、溶栓剂、或其它抗栓剂，包括血小板聚集抑制剂、组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶、尿激酶原、链激酶、肝素、阿司匹林、或华法林。通常本发明的化合物在哺乳动物中，诸如人、绵羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠、和小鼠中可以在体内利用，或者在体外利用。
下列工作实施例明确指出了本发明的优选实施方案，并且这些实施例不应当理解为以任何方式对公开书其它部分的限制。其它的一般性形式对于本领域技术人员是显然的。
实施例下列步骤用于实施例1-2。
细胞转染通过标准克隆方法，产生pcDNA3中的牛eNOS、人iNOS、大鼠nNOS cDNA和pCMV6中的HA标记野生型Akt、Akt(K179M)、或myr-Akt。通过PCR产生pcDNA3中的myr-nNOS，掺入了含eNOS N-肉豆蔻酸化共有位点(MGNLKSVG，SEQ ID NO1)的新的氨基末端，这一保守位点以相同读码框融合在nNOS编码序列的第二个氨基酸处。在COS细胞的预备实验中，根据掺入的3H-肉豆蔻酸确认了该构建物发生N-肉豆蔻酸化，而天然nNOS不发生，并且导致大约60％的总蛋白质靶向细胞的膜部分，而只有5-10％的nNOS在COS细胞中与膜结合。使用快速改变定点诱变试剂盒(Quick Change site-directed mutagenesis kit)(Stratagene)，根据制造商的指示，在eNOS中推断的Akt磷酸化位点处产生突变。通过DNA测序确认所有突变体。将COS-7细胞涂板(100mm培养皿)，并使用磷酸钙，用NOS(7.5-30mg)和Akt(1mg)转染。为了平衡所有转染，使用了β-半乳糖苷酶cDNA的表达载体。转染后24-48小时，使用eNOS mAb(9D10，Zymed)、HA mAb(12CA5，BoehringerMannheim)、iNOS pAb(Zymed Laboratories)、或nNOS mAb(ZymedLaboratories)，通过Western印迹分析，确认了合适蛋白质的表达(40-80mg)。
转染COS细胞释放的NO转染后24-48小时，如其所述(Sessa等人，1995)，处理培养基，通过NO特异的化学发光来测量NO在水溶液中的稳定分解产物亚硝酸盐(NO2-)。将培养基除蛋白，并将含NO2-的样品在含碘化钠的冰醋酸中回流。在这些条件下，NO2-定量还原成NO，在NO分析仪(Sievers，Boulders，CO)中与臭氧反应后通过化学发光检测仪进行量化。在所有实验中，NOS抑制剂可以抑制NO2-释放。另外，将用β-半乳糖苷酶cDNA转染的细胞的NO2-释放量减去对照作为血清或培养基的NO2-背景水平。如其所述，在一些实验中COS中积累cGMP也可以作为NO生成的生物试验。
NOS活性实验如Garcia-Cardena等人以前所述(1998)，3H-L-精氨酸向3H-L-瓜氨酸的转变可用于测定COS细胞或内皮细胞裂解物中的NOS活性。
体内和体外磷酸化究对于体内磷酸化研究，用野生型或S635、1179A eNOS、和HA-Akt的cDNA转染COS细胞过夜。转染后36小时，将细胞在含透析血清、无磷酸盐、添加了80μCi/ml32P正磷酸的Dulbecco极限必需培养基中放置3小时。一些细胞用无磷酸盐培养基中的渥曼青霉素(500nM)预处理1小时。在标记过程中用同样的青霉素预处理。收获裂解物，如以前所述，将NOS溶解并通过ADP Sepharose亲和层析法部分纯化，在SDS-PAGE(7.5％)后，通过自显影观察掺入NOS的32P，并通过对eNOS进行Western印迹，检验eNOS蛋白质的量。对于体外磷酸化研究，将由大肠杆菌纯化的重组eNOS与从转染COS细胞免疫沉淀的野生型或无激酶活性的Akt一起温育。将eNOS与32P-ATP(2ml，特异活性3000Ci/mmol)、ATP(50mM)、DTT(1mM)一起，在含HEPES(20mM，pH＝7.4)、MnCl2(10mM)、MgCl2(10mM)、和免疫沉淀Akt的缓冲液中，于室温下，温育20分钟。
在检验野生型和突变型eNOS的体外磷酸化的实验中，使用与上述基本相同的条件，将从杆状病毒感染的SF9细胞纯化的重组Akt(1mg)与野生型或S1179A eNOS(2.4mg，从大肠杆菌纯化)一起温育。通过SDS-PAGE和32P掺入分辨蛋白质，并通过上述考马斯染色测定蛋白质的量。
在鉴定经标记的eNOS肽的研究中，如上将免疫沉淀的Akt与重组eNOS一起温育。将样品进行SDS-PAGE，并消化凝胶中的eNOS条带，通过RP-HPLC纯化产生的胰蛋白酶消化片段。监控肽质量和32P掺入，并通过质谱进一步分析突出的标记峰。在其它实验中，合成了对应于潜在Akt磷酸化位点的肽，通过HPLC纯化，并通过质谱确认(耶鲁大学医学院W.M.Keck生物技术资源中心)。野生型肽是1174 RIRTQSFSLQERHLRGAVPWA1194(SEQ ID NO2)，突变型肽除了S1179变成丙氨酸外与野生型相同。在体外，激酶反应与上文所述基本相同地将肽(25mg)与重组Akt(1mg)一起温育。然后将反应物点到磷酸纤维素滤膜上，并通过Cerenkov计数测量掺入的磷酸盐的量。
内皮细胞中的腺病毒感染和NO释放如以前所述(Garcia-Cardena等人，1996a)，在100mm培养皿(用于基础NO释放和NOS活性实验)或C6细胞板(用于受激NO释放)中培养牛肺微血管内皮细胞(BLMVEC)。用200MOI含β-半乳糖苷酶29、HA标记的无磷酸化活性的突变型Akt(AA-Akt；Alessi等人，1996)、或羧基末端HA标记的具有组成活性的Akt(myr-Akt)的腺病毒感染BLMVEC 4小时。除去病毒，并将细胞在完全培养基中复苏18小时。在β-半乳糖苷酶病毒的预备实验中，优化这些条件以能够100％感染培养物。对于基础NO生成的测量，在最初用病毒感染后24小时，收集培养基用于NO释放的测量。对于受激NO释放的测量，用无血清培养基洗涤细胞，随后用VEGF(40ng/ml)刺激30分钟。在一些实验中，在腺病毒感染后24小时，测定NOS的钙依赖性。在含1％NP40的NOS实验缓冲液中裂解被感染的细胞，并将去污剂可溶性物质用于活性测定。将裂解物与EGTA缓冲的钙一起温育从而在温育中产生适当量的游离钙。
统计学数据以平均值±SEM表述。使用双尾学生t-检验法或ANOVA适当地与因果推理检验法一起进行比较。当p＜0.05时认为差异是显著的。
实施例1Akt调控从eNOS生成NO为了探索PI-3激酶的下游效应物Akt直接影响NO生成的可能性，用eNOS和野生型Akt(HA-Akt)或无激酶活性的Akt(HA-Akt K179M)共转染COS-7细胞(不表达NOS)，并用NO特异的化学发光测量亚硝酸盐(NO2-)的积累。转染eNOS导致NO2-的积累增加，通过野生型Akt而非无激酶活性变体的共转染，这种效果显著增强(
图1A)。使用cGMP作为有生物活性的NO的生物测定指标获得了相同结果。在这些实验条件下，使用磷酸-Akt特异Ab(识别第473位丝氨酸；未显示)的Western印迹和Akt活性实验(参阅图2A)，确认了Akt有催化活性。转染有组成活性的形式的Akt(myr-Akt)将cGMP积累(在COS细胞中测定)由5.5±0.8增加至11.6±0.9pmol cGMP/mg蛋白质(分别是在eNOS单独转染或eNOS与myr-Akt一起转染的细胞中)，而无激酶活性的Akt不影响cGMP积累(5.8±0.8pmol cGMP，n＝4次实验)。如插图所示，COS细胞裂解物中表达了相同水平的eNOS和Akt，说明Akt调控eNOS，由此增加基础条件下的NO生成。
eNOS是双重酰化的外周膜蛋白，靶击进入内皮细胞的高尔基体区和原生质膜(Liu等人，1997；Garia-Cardena等人，1996a；Shaal等人，1996)，而且在应答拮抗剂的攻击中的NO的有效生成要求区域化(Sessa等人，1995；Liu等人，1996；Kantor等人，1996)。为了检验Akt激活eNOS是否要求膜区域化，用Akt和eNOS的肉豆蔻酸化、棕榈酸化缺陷突变体G2A eNOS)的cDNA共转染COS-7细胞，并将NO释放量化。如
图1B所示，Akt不激活未酰化形式的eNOS，说明功能性相互作用要求两种蛋白质的膜区域化(Downward等人，1998)。其次，确定了Akt能否激活结构类似但是可溶性不一样的NOS异构体神经元的和可诱导的NOS(分别是nNOS和iNOS)。Akt与nNOS和iNOS的共转染没有导致NO释放的进一步增加，证明Akt对eNOS的特异性。然而，为了增强nNOS与生物膜的相互作用，在nNOS上添加N-肉豆蔻酸化位点，导致Akt以类似eNOS的方式刺激nNOS，说明当锚定在膜上时，两种异构体可能对Akt激酶是敏感的。
实施例2eNOS突变的产生上述实验暗示Akt可能经eNOS的磷酸化调控从完整细胞释放NO。事实上，eNOS中存在两个推断的Akt磷酸化基序(RXRXXS/T)(牛eNOS第635位和第1179位丝氨酸或者人eNOS第633位和第1177位丝氨酸)，nNOS中存在一个基序(大鼠nNOS第1412位丝氨酸和人nNOS第1415位丝氨酸)，iNOS中没有发现明显的基序。为了检验eNOS是否是Akt体外磷酸化的潜在底物，用HA-Akt或HA-Akt(K179M)转染COS细胞，并使用重组eNOS作为底物评估激酶活性。如图2A所示，有活性的激酶使组蛋白2B和eNOS(分别为69.32.9和115.4±3.8pmol ATP/nmol底物，n＝3)发生磷酸化，而无活性的Akt没有显著增加组蛋白或eNOS的磷酸化。为了阐明推断的eNOS中的Akt磷酸化位点是否负责32P的掺入，将两个丝氨酸突变成丙氨酸，并在完整COS细胞中检验Akt刺激野生型和突变型eNOS发生磷酸化的能力。用32P-正磷酸标记已转染细胞，通过ADP-Sepharose亲和层析法部分纯化eNOS，并将磷酸化状态和蛋白质水平量化。如图2B所示，与未刺激细胞相比Akt的共表达导致eNOS的磷酸化增强2倍。用渥曼青霉素预处理eNOS/Akt转染细胞消除了磷酸化中Akt诱导的增加。此外，第635位和第1179位丝氨酸向丙氨酸的突变消除了依赖Akt的eNOS磷酸化，说明这些残基能够在完整细胞中作为潜在的磷酸化位点。
为了直接鉴定Akt磷酸化的残基，将野生型eNOS与免疫纯化的Akt一起温育，并通过HPLC及随后的MALDi质谱(MALDi-MS)确定磷酸化位点。如图2C所示，主要的32P标记胰蛋白酶消化磷肽随合成磷肽(第1177-1185位氨基酸中第1179位是磷酸丝氨酸)共洗脱，而且通过线性模式MS测定具有相同的质量-离子。使用反射模式MALDi-MS，经标记胰蛋白酶消化肽和标准磷肽都显示HP3O4损失，说明胰蛋白酶消化肽发生磷酸化。另外，S1179A突变体与野生型蛋白质相比，依赖Akt的eNOS磷酸化显著降低(图2D)。使用由野生型或eNOS S1179A得到的肽(第1174-1194位氨基酸)作为重组Akt的底物获得了相同结果(野生型肽掺入24.6±3.7nmol磷酸/mg，丙氨酸突变肽掺入0.22±0.02nmol磷酸/mg；n＝5)。综上所述，这些数据证明eNOS是Akt的底物，而且磷酸化的主要位点是第1179位丝氨酸(人eNOS第1177位丝氨酸)。
其次，我们检验了第635位丝氨酸处的推断的Akt磷酸化位点和第1179位丝氨酸的已鉴定位点的功能重要性。用双重突变eNOS S635/1179A转染COS细胞消除了依赖Akt的NO释放。第635位丝氨酸向丙氨酸的突变不削弱NO释放，而eNOS S1179A消除了依赖Akt的激活eNOS(图3)。这些结果说明第1179位丝氨酸对于NO释放功能是重要的。为了替代由添加的磷酸提供的负电荷，第1179位丝氨酸向天冬氨酸的突变(eNOSS1179D)部分模拟了由Akt诱导的激活(人eNOS S1177D)。所有定点突变体在细胞裂解物中都充分表达了，并保持了NOS催化活性(参阅插图Western印迹)在只用eNOS转染的COS细胞，NOS活性依次是85.3±27.0、71.9±2.9、80.8±23.2、和131.8±36.7pmol生成的L-瓜氨酸/mg，它们分别来自表达野生型、S1179A、S635、和eNOS S1179D的COS细胞裂解物的蛋白质，n＝3次实验)。
为了检验Akt是否介导从内皮细胞释放NO，用表达激活的Akt(myr-Akt)、激活缺陷的Akt(AA-Akt)、或作为对照的β-半乳糖苷酶的腺病毒感染牛肺微血管内皮细胞(BLMVEC)，并测量NO积累。如图4A所示，myr-Akt刺激BLMVEC的NO基础生成，而用β-半乳糖苷酶或激活缺陷的Akt感染的细胞释放低水平的NO，接近检测极限。这些数据连同COS细胞的类似结果说明eNOS的Akt磷酸化足以在钙的静止水平调控NO生成。事实上，相对于用β-半乳糖苷酶病毒感染的BLMVEC中的NOS活性，在myr-Akt感染的BLMVEC裂解物中测量的NOS活性证明酶对钙激活作用的敏感性(在固定的钙浓度下测定)增强(图4B)。有趣的是，相对于myr-Akt和β-半乳糖苷酶病毒感染细胞激活缺陷的Akt感染的细胞中的NOS活性的钙敏感性受到大大的抑制。
已知用VEGF处理细胞激活Akt23和PI-3激酶抑制剂部分阻断的机制释放NO(Papapetropoulos等人，1997)。为了检验VEGF作为NO释放和Akt激活的拮抗剂之间的功能联系，用mry-Akt、AA-Akt、或β-半乳糖苷酶的腺病毒感染BLMVEC，并将VEGF刺激的NO释放量化。如图4C所示，用myr-Akt感染内皮细胞增强了VEGF驱动的NO生成，而AA-Akt削弱了NO释放。这些结果暗示，Akt参与内皮细胞中基础和受激NO生成所需的信号转导事件。
综上所述，这些资料证明了，Akt能够磷酸化eNOS的第1179位丝氨酸(人eNOS第1177位丝氨酸)，而且磷酸化作用增强了酶生成NO的能力。
实施例3材料和方法eNOS构建物和蛋白质纯化如以前所述，用大肠杆菌BL21细胞中的groELS表达质粒pCW中的野生型牛eNOS(Martasek等人，1996)。如下产生用于在大肠杆菌中表达的S1179D突变型eNOS。用XhoI/XbaI消化pcDNA3(Fulton等人，1999)中的eNOS S1179D，亚克隆到pCW中的eNOS的相同位点，并与groELS共表达。如以前所报导的(Roman等人，1995；Martasek等人，1999)，以下列修改进行重组eNOS的分离。用10mMNADPH或10mM 2’AMP从2’5’-ADP Sepharose洗脱eNOS。使用409-412nm处的峰吸光率对eNOS定量，血红素的消光系数是0.1μM-1cm-1。通过7.5％SDS-PAGE及随后的考马斯染色测定eNOS的纯度。同样进行低温SDS-PAGE，除了样品不用煮沸且电泳是于4℃在冰/水混和物中进行的(Klatt等人，1995)。在滴定NOS辅助因子(L-精氨酸、钙调蛋白、和NADPH)的实验中，它们在酶的纯化和储存中是忽略的，并如下文所述温育。
NOS活性实验如其所述(Kelm等人，1988)，通过血红蛋白捕获实验测量NO生成。简而言之，反应混和物在HEPES缓冲液(50mM)中含有eNOS(0.5-2.5μg)、氧合血红蛋白(8μm)、L-精氨酸(100μM)、BH4(5μM)、CaCl2(120μM)、钙调蛋白(120-200nM)、和NADPH(100μM)，pH7.4。在eNOS的钙EC50值的测定中，上述反应混和物修改如下用MOPS缓冲液(10mM，pH7.6)、KCl(100mM)、和CaM(250nM)替代。在这些条件下，使用WinMAXC程序1.8版(斯坦福大学)计算游离钙，Kd＝2.2×10-8M。通过混和比例适当的10mM K2EGTA和10mM CaEGTA原液(Molecular Probes)来调准游离钙浓度。于401nm监控NOS活性的线性化超过2分钟，并根据吸光率的变化，使用消光系数60mM-1cm-1计算NO生成。所有反应于23℃进行，每个数据点代表3-8次观察。用于276nm处的消光系数0.0033μM-1cm-1确定钙调蛋白浓度。使用这种方法生成NO被加入的硝基-L-精氨酸(1mM)完全阻断。当通过向反应混和物添加EGTA(200-800μM)来测定eNOS的失活时，螯合剂是在NADPH起始反应后1分钟加入的。当检验NADPH-细胞色素c还原酶活性时，使用的条件相同。这些反应在0.5ml体积中含有CaM(120nM)和CaCl2(200μM)，以及eNOS(0.5μg)。
如Bredt等人(1990)以前所述，测定L-精氨酸向L-瓜氨酸的转变。简而言之，将eNOS(0.25-2μg)于23℃在下列反应混和物中温育3-10分钟50-100μL的反应终体积中含有3pmol L-[3H]-精氨酸(55Ci/mmol)、10-300μM精氨酸、1mM NADPH、120-200nM钙调蛋白、2mM CaCl2、和30μM BH4。通过加入0.5ml含有2mM EGTA和EDTA的20mMHEPES(pH5.5)来终止反应。将反应混和物置于Dowex AG50WX8中，并在Packard 1500液闪分析仪上对流经液计数。
还原酶活性实验如Martasek等人(1999)和Masters等人(1967)以前所述，以550nm处的吸光率变化测量NADPH-细胞色素c还原酶活性和2，6-二氯酚靛酚(DCIP)还原，细胞色素c和DCIP都使用0.021μM-1cm-1的消光系数。简而言之，反应混和物(1m1)含有细胞色素c(90μM)；DCIP(36μM)、HEPES缓冲液(50mM，pH7.6)、NaCl(250mM)、NADPH(100μM)、钙调蛋白(120nM)、和CaCl2(200μM)；或已指明的其它物质。加入eNOS后监控反应60秒钟(于23℃)。当需要加入EGTA(200-800μM)来测定还原酶活性的失活时，在反应起始后1分钟加入螯合剂，并再监控1分钟。用NADPH(100μM)起始含HEPES缓冲液(50mM，pH7.6)、CaM(120nM)、和CaCl2(200μM)的反应。在检验EGTA失活eNOS的反应实验中不加入NaCl，以模拟血红蛋白捕获实验的条件。加入的NOS抑制剂不影响细胞色素c还原的速率(未显示)。如上文血红蛋白捕获实验所述，进行eNOS的钙EC50的测定。
数据分析和统计学所有数据表述为平均值±S.E.。至少进行3次测定，每个数据组至少使用3个不同批次的酶。同时纯化野生型和突变型酶以控制制剂之间的活性变化。使用学生t-检验法确定统计学差别明显性，认为p＜0.05在统计学上差别是明显的。
结果eNOS的表达和纯化由大肠杆菌表达并纯化野生型和S1179D eNOS。在1.6升培养物中，使用2’5’-ADP Sepharose 4B层析法通常可以回收大约2.5-4.0mg eNOS。如图5A所示，根据考马斯染色，两种酶的纯度都＞90％。如平行制备的野生型和S1179D eNOS的7份独立制剂所示，这些结果具有代表性。如低温SDS-PAGE所示(图5B)，两种酶都主要以其二聚体形式存在。
eNOS S1179D的NO合酶和还原酶活性比野生型eNOS高然后，通过测量NO生成的速率比较野生型和S1179D eNOS的活性。S1179D eNOS相对于野生型酶展示更高的转换数(在最佳条件下)(84±6对27±1min-1，n＝6份分离的和配对的酶制剂)。野生型和S1179D eNOS与L-精氨酸的Km值相似(图6A，分别为1.8对2.5μM；参阅表1)。

因为从还原酶结构域流向氧化酶结构域的电子流速率对于NOS催化作用是决定性的，所以，为了确定能否归功于还原酶活性的增强，检测了S1179D eNOS活性的增加。在检测DCIP和细胞色素c时，观察到S1179D活性比野生型eNOS的显著增加(图6B)。此外，CaM的存在削弱这种增加，但增加了两种酶的整体活性。当不存在CaM时，S1179D的基础细胞色素c还原比野生型eNOS高4倍。S1179D eNOS的CaM刺激的还原细胞色素c的数量级较高(野生型和S1179D eNOS依次为749±35对1272±55min-1，n＝3-5)；然而，野生型eNOS的CaM刺激水平是8倍，而S1179D eNOS只有3倍。
其次，确定了S1179D eNOS产生的过氧化物是否比野生型eNOS多，(过氧化物能够还原细胞色素c)。正如预期的，当不存在CaM时，没有观察到可抑制细胞色素c还原的过氧化物歧化酶(作为过氧化物阴离子生成指数)，正如以前报导的，野生型eNOS为86±6对95±8min-1，S1179DeNOS为278±9对288±7min-1，n＝3-5。然而，当存在CaM时，过氧化物歧化酶降低了野生型(610±51对866±8min-1)和S1179D(1179±43对1518±19min-1)eNOS还原细胞色素c的速率。当存在过氧化物歧化酶时，两种酶的细胞色素c活性的相对降低是相似的(野生型eNOS为30％，S1179D eNOS为22％)，说明S1179D与野生型相比，eNOS还原酶活性增强(通过细胞色素c还原测定)不能归功于酶的未偶联。
野生型和S1179D eNOs中依赖NADPH的NO形成和还原酶活性没有差异因为NADPH结合位点位于eNOS第1179位丝氨酸附近，所以检验了NO生成和细胞色素c还原对NADPH的依赖性。根据存在CaM时测定的NO生成，S1179D eNOS的最大转换数(kcat)比野生型酶高(图7A)。kcat的增加与S1179D eNOS的NADPH Km比野生型eNOS增加4倍有关(依次为36对8μM)。当不存在CaM时，S1179D eNOS依赖NADPH还原细胞色素c的kcat比野生型eNOS高(依次为290对70min-1；图7B)。当存在CaM时，S1179D还原细胞色素c的kcat显著高于野生型eNOS(依次为840对460min-1)。当不存在或存在CaM时，NADPH的Km值没有变化(当存在或不存在CaM时，野生型eNOS依次为0.40和0.75μM，S1179D eNOS依次为2.0和1.9μM)。
在野生型和S1179DeNOS之间CaM的EC50值没有变化为了评估S1179DeNOS的活性增加能否归功于酶对CaM的亲和力变化，当所有NOS辅助因子过度存在时，检验了作为CaM浓度函数的NOS活性和细胞色素c还原的动力学。野生型和S1179D eNOS CaM激活NOS活性的kcat依次为22min-1和43min-1。数据变换(kcat差异的归一化)揭示了S1179D eNOS的曲线略向左移，但是CaM的EC50差异很小，这与磷酸-eNOS报导的数据是一致的(Mitchell等人，1999)。野生型和S1179D eNOS的EC50值为8nM和7nM(图8A)。测量了NADPH介导的细胞色素c还原。CaM激活S1179D eNOS还原细胞色素c的kcat比野生型酶高大约2倍(S1179D和野生型eNOS依次为1140和620min-1)。数据变换(kcat差异的归一化)揭示了野生型与S1179D eNOS之间的CaM的EC50值略有差异(21对13nM；图8B)。
eNOS的钙激活和失活的比较在以前的实验中证明，在表达大量磷酸-eNOS或S1179D eNOS的细胞中，eNOS的“表面钙敏感性”增强，说明磷酸化增强了钙/CaM激活的亲和力(Dimmeler等人，1999；Fulton等人，1999)。如图8C所示，将最大活性差异归一化之后，S1179D eNOS的钙依赖性略有增加(p＜0.05，两种分析的方差)。正如根据No生成所测定(当存在250nM CaM时)，野生型和S1179D eNOS的钙EC50值也略有差异(依次为310和250nM钙)。如图8C插图所示，游离钙浓度的增加确实使S1179D eNOS的转换比野生型酶大大增强。此外，由测定细胞色素c还原获得的钙EC50值与由测量NO生成获得的相似(图8D；野生型和S1179D eNOS依次为290和220nM)。此外，S1179D eNOS转换的钙激活的Vmax比野生型大(图4D插图)。
为了检验S1179D eNOS与野生型酶的失活是否不同，测量了用EGTA螯和钙后的eNOS活性衰退。在这些实验中，当存在钙时(200μM)，加入所有NOS辅助因子，并监控NO生成1分钟，随后加入不同浓度的EGTA并再监控1分钟。如图9A所示，向野生型和S1179D eNOS加入EGTA以依赖浓度的方式降低NO生成。然而，S1179D eNOS的NO生成对加入EGTA较不敏感；即在较低浓度的EGTA时，野生型eNOS的活性比S1179D eNOS的活性降低得更快。于400μMEGTA时，发现酶之间的活性差异最大。此外，于600μM EGTA时，没有检测到野生型eNOS的活性，而仍能检测到S1179D eNOS的残余活性。细胞色素c还原实验获得了相似结果(图9B)向反应中加入400和600μM螯合剂时发现显著的活性差异。然而，在EGTA的浓度最高时，野生型和S1179D eNOS都发现了有残余的还原酶活性。
总而言之，牛内皮一氧化氮合酶(eNOS)是直接由蛋白激酶Akt在第1179位丝氨酸磷酸化的(Fulton等人，1999)，而人内皮一氧化氮合酶是直接由蛋白激酶Akt在第1177位丝氨酸磷酸化的(Dimmeler等人，1999)。在不存在拮抗剂攻击时，牛eNOS第1179位残基向带负电荷的天冬氨酸的突变，组成性地增加了一氧化氮(NO)生成。
应当这样理解，上述讨论和实施例仅仅是某些优选实施方案的详细说明。因此，对于本领域普通技术人员来说，可以在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改和等同变化。在上文或下文标明的所有参考文献、文章、和专利全部引入作为参考。
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权利要求
1.编码选自下组的NOS多肽的分离的核酸分子有组成性活性的NOS多肽、NO生成速率增加了的NOS多肽、和还原酶活性增加了的NOS多肽。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中NOS多肽在牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基具有替代氨基酸残基。
3.权利要求2的分离的核酸分子，其中在牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的替代氨基酸残基模拟了磷酸丝氨酸。
4.权利要求2的分离的核酸分子，其中在牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的丝氨酸已经用天冬氨酸或谷氨酸残基替代。
5.权利要求2的分离的核酸分子，其中替代氨基酸的R基团模拟磷酸基团。
6.权利要求1-5的任一项分离的核酸分子编码的多肽。
7.选自下组的分离的NOS多肽具有组成活性的NOS多肽、NO生成速率增加了的NOS多肽、和还原酶活性增加了的NOS多肽。
8.权利要求7的NOS多肽，该多肽在牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基含有替代氨基酸残基。
9.权利要求8的有组成性活性的NOS多肽，其中替代氨基酸已经用天冬氨酸或谷氨酸残基替代。
10.刺激患者冠状动脉侧副管发育的方法，包括以有效促进冠状动脉侧副管发育的方式递送编码权利要求7的多肽或Akt多肽的转基因的步骤。
11.权利要求10的方法，其中转基因是从心室肌细胞特异启动子、平滑肌细胞特异启动子、或内皮细胞特异启动子表达的。
12.权利要求11的方法，其中特异于心室肌细胞的启动子包含心室肌球蛋白轻链-2或肌球蛋白重链启动子序列。
13.刺激外周血管缺陷病患者血管发育的方法，包括以有效促进外周血管发育的方式向患者外周血管系统递送编码权利要求7的多肽或Akt多肽的转基因的步骤。
14.治疗心肌缺血的方法，包括以有效治疗心肌缺血的方式向心肌膜递送编码权利要求7的多肽或Akt多肽的步骤。
15.权利要求14的方法，其中转基因的表达限制在心肌细胞。
16.权利要求15的方法，其中转基因的表达限制在心室心肌细胞。
17.权利要求10-16任一项的方法，其中转基因是由复制缺陷型载体编码的。
18.权利要求17的方法，其中复制缺陷型载体是腺病毒。
19.权利要求10-16任一项的方法，其中转基因在体外转染进细胞。
20.权利要求19的方法，其中将已转染细胞递送至患者。
21.表达权利要求7的多肽的非人转基因动物。
22.鉴定调节NOS受Akt调控的活性的试剂的方法，包括下列步骤a)将表达NOS的细胞与试剂接触；并b)测量NOS受Akt调控的活性，由此鉴定调节NOS受Akt调控的活性的试剂。
23.权利要求22的方法，其中步骤(b)包括测定在牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的氨基酸残基处的NOS磷酸化状态。
24.权利要求23的方法，其中NOS由试剂激活。
25.权利要求24的方法，其中试剂模拟Akt介导的eNOS磷酸化。
26.权利要求25的方法，其中试剂抑制在牛eNOS第1179位残基、人eNOS第1177位残基、大鼠nNOS第1412位残基、或人nNOS第1415位残基的氨基酸残基处的脱磷酸化。
27.权利要求22的方法，其中步骤(b)包括测量NO生成。
28.权利要求27的方法，其中通过测量亚硝酸盐浓度或3H-L-精氨酸向3H-L-瓜氨酸的转变来检测NO。
29.鉴定调节NOS受Akt调控的活性的试剂的方法，包括下列步骤c)将Akt和NOS蛋白质或肽与试剂接触；并d)测量NOS活性。
30.权利要求29的方法，其中通过测定NOS依赖Akt的磷酸化状态来测量NOS活性。
31.权利要求30的方法，其中NOS肽包含SEQ ID NO2。
32.权利要求30的方法，其中在步骤(b)中的NOS活性是还原酶活性。
33.权利要求30的方法，其中在步骤(b)中的NOS活性是由NOS生成NO。
34.编码选自下组的NOS多肽的分离的核酸分子在第1177位残基有替代氨基酸残基的牛eNOS、在第1179位残基有替代氨基酸残基的人eNOS、在第1412位残基有替代氨基酸残基的大鼠nNOS、和在第1415位残基有替代氨基酸残基的人nNOS，其中替代氨基酸残基的R基团不带负电。
35.权利要求34的分离的核酸分子，其中替代氨基酸残基是丙氨酸。
36.选自下组的分离的NOS多肽在第1177位残基有替代氨基酸残基的牛eNOS、在第1179位残基有替代氨基酸残基的人eNOS、在第1412位残基有替代氨基酸残基的大鼠nNOS、和在第1415位残基有替代氨基酸残基的人nNOS，其中替代氨基酸残基的R基团不带负电。
37.权利要求36的NOS多肽，其中替代氨基酸残基是丙氨酸。
38.权利要求11的方法，其中内皮细胞特异启动子是Tie-2启动子、内皮启动子、或eNOS启动子。
39.权利要求11的方法，其中平滑肌细胞启动子是SM22启动子或SMα-肌动蛋白启动子。
40.治疗患者心血管疾病的方法，包括向患者递送编码权利要求7的多肽或Akt多肽的转基因的步骤。
41.权利要求40的方法，其中心血管疾病选自下组心力衰竭、心肌梗死、再狭窄、血管成形术后狭窄、支架狭窄、和旁路移植失败。
42.用于治疗患者勃起障碍的方法，包括向患者递送编码权利要求7的多肽或Akt多肽的转基因的步骤。
43.权利要求10、13、14、40、或42任一项的方法，其中转基因是向血管内、肌肉内、真皮内、腹膜内、或动脉内递送的。
全文摘要
本发明涉及在依赖Akt的磷酸化位点具有结构变化的新的NOS变异体和突变体。改变后的NOS蛋白质或肽(尤其是人eNOS蛋白质或肽)、Akt蛋白质或肽、及其编码核酸分子,可以作为基因治疗剂治疗血管成形术后再狭窄、高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、糖尿病、和血管发生缺陷等疾病。NOS蛋白质和肽还可用于筛选调节NOS活性的试剂的方法。
文档编号A01K67/027GK1347283SQ00806325
公开日2002年5月1日 申请日期2000年4月14日 优先权日1999年4月16日
发明者W·C·塞萨 申请人:耶鲁大学