专利名称：Acacia mangium的再生和遗传转化的制作方法
背景技术：
森林对世界经济及保持和保存我们的生态系统是非常重要的。森林树木有广泛的商业用途(提供建筑用木材，造纸和生产纸浆的原料，及作为能源)。木制产品的总需求量(大多数为发展中的国家造纸和纸浆及木材所需)已年年增加，且原始森林不能补给。重新造林是满足这种增加的需求量的解决办法。通常地，选择快速生长的，普遍适合的树种进行重新造林。多数树木改良程序是基于遗传方法处理的，包括从现存的森林中选择上好的克隆，保存遗传可变性，部分控制的繁殖及所需的性状的传统培育。除了通常培育一些子代之外，传统的培育已成功获得快速和均匀生长的精华树木。然而，许多其它性状如疾病和昆虫抗性，不同木质素组分和含量难以获得，这是由于树种的高度杂合性和大面积分离群所致。另外，赋予一些表型如疾病抗性的基因可能根本不在基因库中。另一方面，基于树种遗传转化的的分子培育提供了导入特殊的表型而不影响培养物的遗传背景的可能性。杨属种和桉树种中的遗传转化成功地修饰了木质素的含量(Tzfira等，1998；Robinson，1999)。分子培育森林树种的先决条件是有可靠的及可再生的遗传转化方法，而这依赖于从一个细胞中再生一个完整植物的系统。
金合欢(Acacia)属包括大约1200种热带和亚热带树种。其属于含羞草科植物。Acacia mangium是一种多用途的，快速生长的和固定氮的精华热带豆类树。成树接近30米高，且其树干通常直立于总高度的一半以上。幼苗的纯种叶是象蕨类植物的羽状叶。幼苗的第一个羽状叶有6-8个小叶，接着幼苗的第二个羽状叶发育为双羽状叶。通常当幼苗生长至8-12个双羽状叶时，叶柄扩宽为叶状柄，而小叶完全不发育，且真叶在幼苗中消失。叶状柄是扁平的叶状茎，其看起来且功能上类似其它植物的普通叶。小枝，叶状柄和叶柄是光洁的或轻度糠秕的。叶状柄有5-10cm宽，长为宽的2-4倍，深绿色，干燥后是似纸质的。叶状柄有3-4条主要的纵向叶脉，其在叶状柄基底的背面边缘连接在一起。二级叶脉是纤细的和不显眼的。
花是松散的穗状花序，长10cm，且独自或成对的在叶腋上。花由5个部分组成，且花萼长0.6-0.8cm，伴有短圆裂片。花冠长度是花萼的两倍。豆荚在未成熟时是线形的，光洁的，3-5mm宽，大约7.5cm长，在成熟时是木质的，卷曲的和褐色的，并在种子之间凹陷。种子是有光泽的，黑色的，椭圆形的，卵形的或长方形的，3.5×2.5mm，具有形成在种子之下的肉质假种皮的橙色纤维(Duke，1984)。由于Acacia mangium快速生长，耐受贫瘠的土壤，和高质量的纤维，其已大量用于重新造林和使退化的土壤复原。在许多国家或地区对用其进行人造林已进行多年研究，尤其在热带和亚热带地区，如澳大利亚，印度尼西亚，马来西亚，印度，泰国，夏威夷，中国和台湾。许多Acacia mangium人造林已在酸性土壤或荒野或白茅(Imperata)草原中建立，例如在孟加拉(Latif等，1995)；在马来西亚的沙巴州(Latif等，1995；Williams等，1992)和Serdong(Majid等，1994；Awang，1994)；Sangmelina，喀麦隆，肯尼亚(Duguma等，1994)；泰国Skaerat(Khemnark，1994)；美国夏威夷(Cole等，1996)；印度尼西亚的Bogor(Anwar，1992；Wibowo等，1992)，Paseh和Kadipaten(Widiarti和Alrasjid，1987)；印度的Bengal(Basu等，1987)等。
印度尼西亚有世界最大的造纸和纸浆工厂，其越来越依赖于人造林作为木材来源，优选的是Acacia mangium。亚洲纸业和纸浆集团有两个会员公司，有政府特许土地540,000公顷。到1996年，一个公司已种植Acacia mangium 123,000公顷，大约90％是人造林，相当于1亿8千万棵幼苗。估计到2004年，亚洲纸业和纸浆集团的木材来源将全部取自人造林，主要是Acacia mangium人造林(Bayliss，1998a；Bayliss，1998b)。
除了用于造纸和纸浆业，Acacia mangium木材可用于其它方面，如水泥粘合的颗粒木板，夹合板和装饰镶嵌板的制造(Yusoff等，1989；Wong等，1988)。
从单一的植物大面积单一营养繁殖面临着感染疾病的危险。已发现在这种人造林中疾病传播的非常快，并导致大量经济损失。许多疾病毁坏Acacia mangium肉桂真菌(Phytophehera cinnamomi)感染导致植物枯萎和死亡；幼苗枯萎，落叶和凋谢是由于Glomerellacingulata导致苗圃中Acacia mangium严重受损。由Cyclindrocladiumquinqueseptatum所致叶斑导致幼苗和幼树落叶；粉状霉菌(Oidiumspp)严重影响泰国苗圃中的Acacia mangium；由ganoderma sp.所致的红色根病影响马来西亚的Acacia mangium；由Phellinus noxium引起的褐色根病影响马来西亚和所罗门群岛的Acacia mangium(Simmons，1987；Gutteridge和Shelton，1994)。传统的培育较少能在Acacia mangium中成功获得疾病抗性，主要是由于在天然基因库中缺乏这种基因所致。通过导入外源疾病抗性基因的分子培育成为一种重要选择。
关于Acacia mangium组织培养的研究限于微型繁殖(Bhaskan和Subbash，1996；Ahmad，1991；Galiana等，1991a；Galiana等，1991b)。组合精华树木的传统培育方法和大规模植物繁殖方法使大规模人造林成为可能。关于再生或遗传转化Acacia mangium还没有报道。本发明阐述了通过器官发生和遗传转化系统再生完整植物的条件。
例证本发明的背景，或提供额外的相关实践的阐述的出版物和本文所用其它物质，在此并入参考，并分别附于参考文献表中。
发明概述A从Acacia mangium中的愈伤组织再生的系统将Acacia mangium幼苗或营养微型繁殖的小植物的不同部分(下胚轴，子叶，小叶，叶柄和茎(stem))用作外植体。幼苗来自分离的种胚培养物，小植物通过从2年树的分生组织中经微型繁殖而获得。通过补加生长素(0.5-5mg/L的2，4-D或0.5-2mg/L的α-萘乙酸(NAA))和细胞因子(0.5-3.0mg/L的激动素(KT)或0.5-3.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6-BA或BA))的MS基本培养基(Murashige和Skoog，1962)诱导愈伤组织形成。
在16/8小时光周期(L/D)，28℃的生长条件下在AM-265培养基上实现了不定芽诱导，AM-265培养基是由MS基本培养基加上1.0mg/L的脱叶灵(1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)尿素或称TDZ)，0.25mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)，100mg/L的酪蛋白酶水解物(CH)，100mg/L的L-抗坏血酸(维生素C或称Vc)，150mg/L的L-谷氨酰胺(Gln)，150mg/L的L-天冬酰胺单水解物(Asn)，150mg/L的L-脯氨酸(Pro)，高压灭菌后pH5.8，phytagle 0.275或0.30％，或琼脂0.8％，蔗糖30g/L组成。
羽状叶形成和不定芽伸长是在补加0.5-2.5mg/L的赤霉酸(GA3)的AM-337培养基或AM-41培养基上进行的，AM-337培养基由MS基本培养基加上0.01mg/L TDZ，100mg/L CH，100mg/L Vc，150mg/L Gln，150mg/L Asn，和150mg/L Pro，高压灭菌后pH5.8，phytagle 0.275或0.30％，或琼脂0.8％，蔗糖30g/L组成，AM-41培养基是由MS基本培养基加上2mg/L 6-BA，100mg/L CH，100mg/LVc，150mg/L Gln，150mg/L Asn，和150mg/L Pro，高压灭菌后pH5.8，phytagle 0.275或0.30％，或琼脂0.8％，蔗糖30g/L组成。生长条件是在28℃，光周期16/8小时。
不定芽形成的根和完整的小植物是在补加0.5-3.0mg/L NAA及0-0.5mg/L KT或0.01-0.5mg/L IBA(吲哚丁酸)和100mg/L CH，100mg/L Vc，150mg/L Gln，150mg/L Asn，和150mg/L Pro，高压灭菌后pH5.8，phytagle 0.35％，或琼脂1.4％，蔗糖20或30g/L的MS或1/2MS基本培养基上，在光周期16/8小时及28℃的生长条件下获得的。将完整的小植物移植入泥炭土∶白沙为3∶1的生长室中，光周期为16/8小时(光/暗)，温度为25℃。B.Acacia mangium的遗传转化系统基于上述建立的再生系统，携带双向载体pBI121的农杆菌菌株LBA4404(Ooms等，1981)用于遗传转化Acacia mangium，所述载体中GUS基因在800bp的花椰菜花叶病毒启动子调节之下。具有质粒的农杆菌与以下外植体共同培养(1)从取自2年龄树的辅助芽(auxiliary buds)中营养微型繁殖的嫩不定枝。这种枝由幼茎和羽状叶组成但没有叶状柄。在分离除去羽状叶和辅助芽后，长度为大约2-3cm的茎片用作外植体。(2)产生自种胚培养物的幼苗的长度为1-2cm的叶柄和0.4-0.5×0.3-0.4(cm)的小叶用作外植体。将外植体在AM-265培养基上在28℃，光周期16/8小时(光/暗)预培养3天，之后用活化的农杆菌感染15分钟。然后感染的外植体在相同的培养基中于黑暗中在22℃培养3天。接着进行冲洗并置于AM-265中，以诱导愈伤组织和不定芽。转基因植物用培养基中G418在以下4个阶段选择12mg/L G418 25天，20mg/L G418 60天，30mg/LG418 25天，然后12mg/L G418。不定芽伸长是由具有2.5-5mg/L的GA3，存在12mg/L G418的AM-265诱导的。为形成羽状叶，将不定芽移入具有2.5mg/L GA3的AM-41中，生长条件为28℃，光周期16/8小时(光/暗)。切下再生的枝并用GUS染色检测，有16％测试为阳性。将推定的转基因不定芽移入有或无G418(10mg/L)的AM-357或AM-451中，在光周期16/8小时(光/暗)下诱导生根。当NPTII基因用作探针时，Southern印迹杂交示出阳性结果。
附图简述
图1A-E示出从叶中诱导不定芽。
图1A示出愈伤组织诱导。
图1B示出不定芽的恢复。
图1C，1D和1E示出胚芽形成和不定芽伸长。
图2A-C示出从叶柄中再生Acacia mangium。图2A示出愈伤组织诱导。图2B示出不定芽的恢复。图2C示出胚芽形成和不定芽伸长。
图3A-E表明从茎片中再生Acacia mangium。图3A示出从愈伤组织中再生。图3B示出从愈伤组织中诱导的不定芽。图3C示出根形成，图3D示出完整的小植物，图3E示出在盆栽土中一月龄的小植物。
图4是pBI121的图谱，pBI121具有含有克隆在GUS基因上游的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的800bp的HindIII-BamHI片段。
图5A-C表明树的复壮。图5A示出两年的树。图5B示出不定芽的诱导。图5C示出具有胚芽的繁殖的不定芽。
图6A示出不定芽，图6B示出作为用于转化的外植体的茎片。
图7表明推定的转基因不定芽的选择和诱导。
图8A和8B例证了在选择5个月后，不定芽的GUS染色。
图9A-C例证了转基因的幼茎片的GUS染色。图9A-B示出茎片，图9C示出枝。
图10A-C示出转基因叶和叶片的GUS染色。
图11示出用NPTII探针的Southern印迹结果。将20μgDNA用HindIII消化，在凝胶上电泳并印迹。1-6泳道是转基因品系。ck泳道是使用来自非转基因植物的DNA的阴性对照。7泳道是使用来自通过用NPTII作为选择标记的质粒pWS42转基因的番茄品系DNA的阳性对照。
发明详述本发明涉及遗传转化树木尤其Acacia mangium的组织的方法，以及通过器官发生从转化的组织中再生整个植物的方法。
本发明在以下实施例中作进一步阐述，实施例只是举例说明本发明而无任何限制之意。使用的是本领域熟知的标准方法或以下特别阐述的方法。
实施例1试剂和培养基A.MS基本培养基MS培养基(Murashige和Skoog，1962)名称 分子式 浓度(mg/L)Sigma目录号常量营养元素硝酸铵 NH4NO31650 A-3795硝酸钾 KNO31900 P-8291氯化钙二水合物 CaCl2·2H2O 440C-2536硫酸镁七水合物 MgSO4·7H2O 370M-7774无水磷酸二氢钾 KH2PO4170P-8416硫酸铁七水合物 FeSO4·7H2O 27.8 F-8263乙二胺四乙酸(EDTA) C10H14N2O8Na2·2H2O37.3 E-6635(Na2EDTA)微量营养元素碘化钾 KI 0.83 P-8166硼酸H3BO36.2B-9645硫酸镁单水合物 MnSO4·H2O 16.9 M-7899硫酸锌七水合物 ZnSO4·7H2O 8.6Z-1001钼酸(钠盐二水合物)Na2MoO4·2H2O 0.25 M-1651硫酸铜(五水合物)CuSO4·5H2O 0.025 C-3036氯化钴(六水合物)CoCl2·6H2O 0.025 C-2911有机试剂肌醇 C6H12O6100I-3011烟酸 C6H5NO20.5N-0765甘氨酸 C2H5NO22.0G-6143硫胺素(维生素B1) C12H17ClN4OS.HCl 0.1T-3902盐酸吡哆醇(维生素B6) C8H11NO3.HCl 0.5P-9755B.其它有机试剂名称 分子式 Sigma目录号L-抗坏血酸(维生素C) C6H8O6A-2174酪蛋白酶促水解物(CH) C-7290L-谷氨酰胺(Gln) C5H10N2O3G-9273L-天冬酰胺一水合物(Asn) C4H8N2O3·H2O A-4284L-脯氨酸(Pro) C5H9NO2P-4655蔗糖 S-5390C.植物生长调节剂名称 Sigma目录号吲哚-3-乙酸(IAA) I-2886α-萘乙酸(NAA) N-06401-苯基-3-(1，2，3，-噻二唑-5-基)尿素(脱叶灵，TDZ)P-61866-苄基氨基嘌呤(6-BA) B-3408激动素(KT) K-0753赤霉酸(GA3) G-7645D.琼脂名称 Sigma目录号M型 A-4800纯化的 A-7921Phytagel P-8169E.抗生素Timentin(T) Beecham制药公司卡那霉素(K) SigmaGenetins(G418硫酸盐)Clontech 8056-2F.诱导愈伤组织的培养基AM-5 MS+2，4-D 2.0mg/L+KT 3.0mg/LAM-6 MS+2，4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/LAM-7 MS+NAA 2.0mg/L+KT 3.0mg/LAM-8 MS+NAA 2.0mg/L+KT 0.5mg/LAM-14MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 3.0mg/LAM-15MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 3.0mg/LAM-16MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 3.0mg/LAM-17MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/LAM-18MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/LAM-19MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/LAM-20MS+2，4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/LAM-21MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/LAM-22MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/LAM-27MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 3.0mg/LAM-28MS+NAA 1.0mg/L+6-BA 3.0mg/LAM-29MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 3.0mg/LAM-30MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.5mg/LAM-31MS+NAA 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/LAM-32MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/LAM-33MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/LAM-34MS+NAA 1.0mg/L+6-BA 1.0mg/LAM-35MS+NAA 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/LAM-231 MS+2，4-D 5.0mg/L+KT 0.5mg/LAM-233 MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 1.0mg/LAM-234 MS+2，4-D 1.0mg/L+KT 1.0mg/LG.诱导不定芽的培养基a.AM-265MS基本培养基+TDZ 1.0mg/L，IAA 0.25mg/L，CH100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.275或0.30％或琼脂0.8％(A-4800，Sigma)，蔗糖30g/L。b.AM-261MS基本培养基+TDZ 1.0mg/L，IAA 0.5mg/L，CH100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.275或0.30％或琼脂0.8％(A-4800，Sigma)，蔗糖30g/L。c.AM-304MS基本培养基+TDZ 2.0mg/L，IAA 0.25mg/L，CH100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.275或0.30％或琼脂0.8％(A-4800，Sigma)，蔗糖30g/L。d.AM-308MS基本培养基+TDZ 1.0mg/L，IAA 2.0mg/L，CH100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.275或0.30％或琼脂0.8％(A-4800，Sigma)，蔗糖30g/L。H.形成成羽状叶的培养基a.AM-337MS基本培养基+TDZ 0.01mg/L，CH 100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro 150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.275或0.30％或琼脂0.8％(A-4800，Sigma)，蔗糖30g/L。b. AM-41MS基本培养基+6-BA 2mg/L，CH 100mg/L，Vc100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro 150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.275或0.30％或琼脂0.8％(A-4800，Sigma)，蔗糖30g/L。I.生根培养基a. 改进的AM-8MS基本培养基+NAA 2mg/L，KT 0.5mg/L，CH 100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.30％，蔗糖30g/L。b. AM-3571/2 MS基本培养基+NAA 2.0mg/L，KT 0.5mg/L，CH 100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.30％，蔗糖30g/L。c. AM-4511/2 MS基本培养基+NAA 2.0mg/L，KT 0.1mg/L，CH 100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro150mg/L，高压灭菌后pH5.8，phytagel 0.35％，蔗糖30g/L。J.移植泥炭土∶白沙为3∶1K.活化根癌农杆菌的培养基LB培养基胰化蛋白胨 1.0％酵母提取物 0.5％NaCl0.8％高压灭菌前pH7.0(Sambrook等，1989)YEP培养基(每升)(Chilton等，1974)Bacto肽胨 10g酵母提取物 10gNaCl 5gAB培养基20×磷酸盐缓冲液(每升)K2HPO460gNaH2PO420g单独将此溶液高压灭菌20×盐溶液(每升)NH4Cl 20gMgSO4.7H2O 6gKCl3gCaCl20.2gFeSO4.7H2O 0.05g高压灭菌前pH7.0为制备最终培养基，组合以下溶液至终体积为1L50ml 20×磷酸盐缓冲液50ml 20×盐溶液900ml无菌ddH2O诱导培养基MES缓冲液，pH6.0 30mM1×AB培养基葡萄糖 0.5％乙酰丁香酮 100μM(乙酰丁香酮的母液必须在DMSO中新鲜制备)实施例2分析GUS活性将组织在37℃在GUS染色液中染色过夜。GUS染色液如Jefferson(1987)所述，其组成为X-gluc 1mM，磷酸钠(pH7.0)100mM，EDTA 10mM，Triton X-100 0.1％。GUS染色示出在不定芽和茎及叶中呈阳性蓝色反应(图8，9，和10)。实施例3Southern分析进行Southern印迹分析的方法见于Sambrook等，(1989)所述，该方法如下A.DNA提取将2-5g新鲜样品在液氮中冷冻，之后将样品在液氮中用研钵和杵研磨成细末。将此粉末移至离心管(50ml)中。加入15ml提取缓冲液，2ml 10％SDS并充分混合。将此溶液在65℃温育15分钟。加入5ml 5M KAc并用力摇动。将此混合物在冰上保温20分钟，然后在25000×g离心20分钟。通过Microcloth将上清过滤到新试管中。DNA用1/2体积的异丙醇沉淀，混合并在-20℃保温30分钟。
将DNA在25000×g离心30分钟，弃去上清，并将试管倒转在空气中干燥30分钟。将沉淀溶解于0.7ml的1 ×TE(pH8.0)中，移至Eppendorf试管中。离心10分钟。将上清移至新试管中，加入7μL RNase(10mg/ml)并置于室温下10分钟，然后加入75μL 3MNaAc(pH5.3)和500μL异丙醇。将溶液混合并在微离心管中最大速度离心5分钟，使DNA沉淀。将此沉淀用70％乙醇洗涤，在空气中干燥，并溶解于100μL 1×TE(pH8.0)中。B.提取缓冲液100mM Tris-HCl，pH850ml50mM EDTA，pH8 50ml500mM NaCl 50ml10mM β-ME 0.6mlddH2O 至500mlC.酶消化反应系统IDNA样品100μL(20μg)，10×HindIII缓冲液40μL，HindIII 8μL(80单位)，加入无菌双蒸水252μL至总体积为400μL。
将反应在37℃保温过夜。将40μL的3M NaAc(pH5.3)和2/3体积的100％乙醇加入反应系统中，并将其在-20℃保温30分钟。在4℃将其最大速度离心20分钟。弃去上清并将试管在空气中干燥30分钟，然后将沉淀溶解于30μL无菌双蒸水中。D.电泳在0.8％琼脂糖凝胶上在28V于1×TBE中进行电泳过夜。E.将DNA从琼脂糖凝胶中移至尼龙膜此步骤如Sambrook等(1989)所述进行。F.预杂交制备预杂交溶液，该溶液由6×SSC，5×Denhardt’s试剂，0.5％SDS，100μg/ml变性剪切的鲑精DNA(Stratagene产品)和50％甲酰胺组成。5×Denhardt’s试剂为5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白并加入ddH2O至体积为500ml，过滤并在-20℃贮存。
将DNA固定于膜上之后，将此膜置于含有适当预杂交溶液的杂交试管中，每平方厘米尼龙膜使用0.2ml预杂交液。将此膜在42C保温6小时。G.探针标记在预杂交期间，用Boehringer Mannheim High Primer DNA标记试剂盒制备标记的探针。加入50ng的NPTII，然后用水将体积调节为8μL。将DNA在100℃热模块中变性10分钟，迅速在冰上冷却，并脉冲离心。
在冰上将变性的DNA与以下物质混合4μL High Prime反应混合物，3μL dATP，dGTP，dTTP的混合物，和5μL α-32P dCTP，3000Ci/mmol(Biolab)。将此混合物在37℃保温10分钟。加入20μL的50mM EDTA(pH8.0)终止反应。
标记的探针通过在制备于小Pasteur吸液管上的小Sephadex G50柱过柱而纯化。用计数仪监测洗脱液并收集第一个峰。H.杂交将探针加入杂交试管中，然后在42℃保温10-24小时。I.冲洗膜倒掉杂交液，将膜在室温下浸入2×SSC，0.5％SDS中10分钟。将膜移至2×SSC，0.1％SDS中15分钟。将溶液用0.5×SSC，0.1％SDS置换，并将膜在室温保温15分钟。将溶液用0.1×SSC，0.1％SDS置换，并将膜在55℃保温30-55分钟。将膜在室温移至0.1×SSC中3-5分钟，然后在3MM Whatman纸上在空气中干燥30分钟。J.放射自显影在-80℃下将膜在X光胶片(Kodak)上曝光一或多天以获得放射自显影图。
用NPTII片段作探针，Southern印迹示出NPTII基因已整合入不定芽中(
图11)。结果表明这种Acacia mangium转化方法是非常成功的。实施例4Acacia mangium的再生A.胚培养将成熟种子(黑色种被)用98％H2SO4预处理2-3分钟，并用自来水冲洗几次。将处理的种子用70％的乙醇消毒2-3分钟，并用无菌ddH2O冲洗5次。然后将种子浸泡在0.1％HgCl2中6分钟，并用无菌ddH2O冲洗5次，再用30％漂白剂(市售产品)消毒6分钟，接着用无菌ddH2O冲洗5次。将无菌的种子在无菌的ddH2O中浸泡过夜，以分离进行胚培养的合子。有或无活性炭的MS基本培养基(Murashige和Skoog，1962)，pH5.8，蔗糖30g/L，phytagel 0.25％或琼脂0.7％(Sigma，A-4800)用于培养成熟胚。将分离的成熟合子胚在MS培养基上，在12/12小时或16/8小时(光/暗)或完全黑暗的光周期下，在25-28℃培养。萌发的下胚轴或叶或叶柄或茎用作外植体以诱导愈伤组织形成。B.愈伤组织诱导使用不同的培养基在12/12或16/8小时(光/暗)或在黑暗中，在25℃诱导愈伤组织，所述培养基包括AM-5，6，7，8，14，15，16，17，18，19，20，21，22，27，28，29，30，31，32，33，34，35，231，233和234。自幼叶诱导的愈伤组织AM-L；自幼叶柄诱导的愈伤组织AM-P；自下胚轴诱导的愈伤组织AM-H；自幼茎诱导的愈伤组织AM-S；自芽诱导的愈伤组织AM-B；自根诱导的愈伤组织AM-R。在16/8小时光周期、1800-2000lux及28℃条件下，所有上述愈伤组织用于诱导不定芽。在不同培养基上诱导愈伤组织的结果是不同的(表1)。通常愈伤组织的诱导是不困难的。所有外植体在12/12或16/8小时(光/暗)光周期，及在25℃下培养20天，均能产生愈伤组织(见例如
图1A；图2A；图3A)。表1在不同的培养基上在12/12小时(光/暗)，25℃培养35天，愈伤组织诱导结果培养基号 外植体数目(小 形成愈伤组织的 愈伤组织形成完叶)外植体的数目全的外植体数目AM-5 40 40 33AM-6 40 40 31AM-7 40 40 3AM-8 40 40 4AM-14 40 40 36AM-15 40 40 40AM-16 40 40 38AM-17 40 40 36AM-18 40 40 39AM-19 40 40 39AM-20 40 40 38AM-21 40 40 40AM-22 40 40 40AM-27 40 40 12AM-28 40 40 8AM-29 40 40 11AM-30 40 40 10AM-31 40 40 6AM-32 40 40 2AM-33 40 40 4AM-34 40 40 4AM-35 40 40 6AM-231 40 40 30AM-233 40 40 20AM-234 40 40 20叶柄AM-6 20 20 15AM-17 20 20 20C.不定芽诱导将诱导自小叶，叶柄，幼茎和芽的愈伤组织在AM-261，AM-265，AM-304和AM-308上，在光周期16/8小时(光/暗)，28℃的条件下培养。一个月之后，在愈伤组织上有一些芽恢复(
图1B；图2B)。易碎的愈伤组织上的芽恢复首先出现致密平滑的芽末端。在AM-265上芽恢复率达到15％。但在这些培养基上，诱导的芽不易形成羽状叶和伸长。D.羽状叶形成和不定芽伸长将愈伤组织的芽恢复移至具有GA3 2.5mg/L的AM-337或AM-41上，在光周期16/8小时(光/暗)，1800-2000lux和28℃的条件下培养。在培养一个月之后，其中一些能形成羽状叶和伸长(
图1C，D，E；图2C；和图3B)。羽状叶形成和芽伸长的比率达到16.67％。E.根形成将伸长的芽在AM-357或AM-451中培养形成根。20天后，在芽的基础茎(basic stem)上开始出现不定根(图3C)。在根形成之后，将小植物移至没有植物生长调节剂的MS基本培养基中。小植物正常迅速生长，且根系生长良好(图3D)。F.移植将小植物上的phytagel洗掉，并将其移至罐中(泥炭土∶白沙为3∶1)，并在光周期16/8小时和25℃条件下在生长室中生长。一个月后，将小植物移至温室中(图3E)。实施例5树的复壮将2年的幼树的辅助芽(图5A)，在具有NAA 0.1mg/L，6-BA3.0mg/L，CH 100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro 150mg/L，phytagel 0.275％或琼脂0.8％(A-4800，Sigma)，在121℃高压灭菌后pH5.8，蔗糖30g/L的MS基本培养基中培养。60天后，获得一些具有叶状柄的不定芽(图5B)。将有叶状柄的诱导的不定芽在AM-41上传代培养，AM-41为具有6-BA 2mg/L，CH100mg/L，Vc 100mg/L，Gln 150mg/L，Asn 150mg/L，Pro 150mg/L，phytagel 0.275％或琼脂0.8％(A-4800，Sigma)，在121℃高压灭菌后pH5.8，蔗糖30g/L的MS基本培养基。具有叶状柄的不定芽在大约两个月中传代培养两次之后，具有羽状叶的不定枝得以复壮(图5C)。不定芽可用作外植体进行转化(图6A)。实施例6Acacia mangium的遗传转化A.活化根癌农杆菌菌株LBA4404/pBI121含有双向载体质粒pBI121(载体大小13.0kb，Clontech，图4)的根癌农杆菌菌株LBA4404(Ooms等，1981)用于此试验。pBI121衍生自pBI101，具有长度为800bp的，含有克隆在GUS基因上游的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的HindIII-BamHI片段。从贮存在-70℃的永久甘油贮存物中，将根癌农杆菌pBI121/LBA4404在含有链霉素100mg/L(Str100)和卡那霉素50mg/L(K50)的固体LB(pH7.0)培养平板上划线培养。将平板在28℃培养2-3天。将新鲜的pBI121/LBA4404在含有链霉素100mg/L(Str100)和卡那霉素50mg/L(K50)的固体LB(pH7.0)培养平板上划线，在28℃在黑暗中培养过夜或24小时。挑取一些pBI121/LBA4404菌落，并将pBI121/LBA4404接种于含有链霉素100mg/L(Str100)和卡那霉素50mg/L(K50)的50ml液体LB培养基中，并在28℃在黑暗中，以250rpm培养10小时，直至OD600＝0.70-1.10。将其在3500rpm离心30分钟，或在5000rpm离心10分钟，并重悬浮于4-5体积的含有链霉素100mg/L(Str100)和卡那霉素50mg/L(K50)的YEP培养基(pH7.0)中，OD600＝0.1.-0.20，在28℃在黑暗中，在250rpm培养8-10小时，OD600＝0.70-1.20。将其在3500rpm离心30分钟并重悬浮于相同体积的无菌0.9％NaCl中。之后在3500rpm离心30分钟并重悬浮于2-3.5体积的诱导培养基中，OD600＝0.2-0.3，并在28℃在黑暗中在120rpm下培养8-15小时，OD600＝0.70-1.20，以感染外植体或愈伤组织或细胞悬浮液。B.茎片的预培养将茎片(stem pieces)在AM-265上，在光周期16/8小时(光/暗)，1800-2000lux，28℃的条件下培养3天。C.共培养在预培养后，将茎片在0.5M甘露糖醇中浸泡20-25分钟，然后移至活化的pBI121/LBA4404悬浮液中15分钟。将感染的幼茎片冲洗一次，并在无菌Whatman纸上干燥，之后在含有100μM乙酰丁香酮pH5.2的AM-265培养基上，在22℃在黑暗中培养3天。D.选择转化的不定芽和转化的愈伤组织在共培养3天之后，将茎片用无菌ddH2O冲洗10次，并在无菌Whatman纸上干燥。将茎片在含有Timentin 250mg/L和G41812mg/L，phytagel 0.275％的AM-265培养基上，在光周期16/8小时(光/暗)和28℃条件下培养，以选择转化的愈伤组织或转化的不定芽。接着，将茎片在具有G418 12mg/L的培养基上培养25天，在具有G418 20mg/L的培养基上培养60天，在具有G418 30mg/L的培养基上培养25天，然后在具有G418 12mg/L的培养基上培养。在用抗生素连续选择4个月后，33.75％的茎片形成不定芽，将2.5-5mg/L的GA3加入相同培养基中，促进不定芽伸长(图7)。在选择5个月后，将Timentin不再用于培养基中，并将一些不定芽用于GUS染色。GUS染色示出在不定芽出现阳性蓝色反应(图8，图9，和
图10)。将不定芽移至含有GA32.5mg/L的AM-41培养基中，以促进羽状叶形成。E.根形成将转化的不定芽移至有或无G418(10mg/L)的AM-357或AM-451培养基上，在光周期16/8小时(光/暗)在28℃培养。
在此专利申请中，参考本发明优选的实施方案已揭示了本发明，应知此揭示只是举例说明而无限制之意，且在本发明精神和所附权利要求范围内，本领域技术人员对本发明可加以修改。
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权利要求
1.一种再生Acacia mangium的方法，包括a)从外植体诱导愈伤组织形成；b)培养所述愈伤组织以产生不定芽；c)培养所述不定芽以伸长并产生羽状叶；和d)培养c)步中伸长的芽，由此产生根及成为小植物。
2.权利要求1的方法，其中培养种子以产生所述外植体。
3.权利要求1的方法，其中所述外植体选自由下胚轴，子叶，叶，叶柄和茎组成的一组。
4.权利要求1的方法，其中所述外植体在包含MS培养基并补加生长素和细胞分裂素的培养基上培养。
5.权利要求4的方法，其中所述生长素为0.5-2.0mg/L，所述细胞分裂素为0.5-3.0mg/L。
6.权利要求4的方法，其中所述生长素选自2，4-D和α-萘乙酸，所述细胞分裂素选自激动素和6-苄基氨基嘌呤。
7.权利要求1的方法，其中所述愈伤组织在包含MS基本培养基并补加以下物质的培养基上培养，所述物质为a)脱叶灵，b)吲哚乙酸，c)酪蛋白酶水解物，d)L-抗坏血酸，e)L-谷氨酰胺，f)L-天冬酰胺，g)L-脯氨酸，h)蔗糖和i)琼脂或phytagel。
8.权利要求1的方法，其中所述不定芽在包含补加以下物质的MS培养基的培养基上培养a)脱叶灵，b)酪蛋白酶水解物，c)L-抗坏血酸，d)L-谷氨酰胺，e)L-天冬酰胺，f)L-脯氨酸，g)蔗糖和h)琼脂或phytagel。
9.权利要求1的方法，其中所述伸长的芽在包含1/2MS基本培养基并补加以下物质的培养基上培养，所述物质为a)α-萘乙酸，b)激动素，c)酪蛋白酶水解物，d)L-抗坏血酸，e)L-谷氨酰胺，f)L-天冬酰胺，g)L-脯氨酸，h)蔗糖和i)phytagel。
10.权利要求1的方法，其中所述外植体已被转化。
11.一种再生Acacia mangium的方法，包括a)培养来自Acacia mangium树的辅助芽，以产生包含叶状柄的不定芽；b)传代培养所述包含叶状柄的不定芽，以产生不定枝；c)培养所述不定枝。
12.权利要求11的方法，其中所述辅助芽的培养是在包含MS基本培养基并补加以下物质的培养基上进行的，所述物质为a)α-萘乙酸，b)6-苄基氨基嘌呤，c)酪蛋白酶水解物，d)L-抗坏血酸，e)L-谷氨酰胺，f)L-天冬酰胺，g)L-脯氨酸，h)蔗糖和i)phytagel或琼脂。
13.权利要求11的方法，其中所述包含叶状柄的不定芽的传代培养是在包含MS基本培养基并补加以下物质的培养基上进行的，所述物质为a)6-苄基氨基嘌呤，b)酪蛋白酶水解物，c)L-抗坏血酸，d)L-谷氨酰胺，e)L-天冬酰胺，f)L-脯氨酸，g)蔗糖和h)phytagel或琼脂。
14.一种用感兴趣基因转化Acacia mangium的方法，包括如下步骤a)激活包含所述感兴趣基因的根癌农杆菌，以形成活化的根癌农杆菌；b)预培养Acacia mangium的外植体，以产生预培养的外植体；c)共培养所述活化的根癌农杆菌和所述预培养的外植体以产生感染的外植体；d)培养所述感染的外植体以诱导愈伤组织和不定芽；及e)在选择性培养基上培养所述愈伤组织或不定芽。
15.权利要求14的方法，其中所述外植体的预培养是在包含MS基本培养基并补加以下物质的培养基上进行的，所述物质为a)脱叶灵，b)吲哚-3-乙酸，c)酪蛋白酶水解物，d)L-抗坏血酸，e)L-谷氨酰胺，f)L-天冬酰胺，g)L-脯氨酸，h)蔗糖和i)phytagel或琼脂。
16.权利要求14的方法，其中所述外植体在共培养之前在0.5M甘露糖醇中浸泡。
17.权利要求14的方法，其中所述共培养在包含MS基本培养基并补加以下物质的培养基上进行，所述物质为a)脱叶灵，b)吲哚-3-乙酸，c)酪蛋白酶水解物，d)L-抗坏血酸，e)L-谷氨酰胺，f)L-天冬酰胺，g)L-脯氨酸，h)蔗糖和i)phytagel或琼脂。
18.权利要求14的方法，其中所述共培养在黑暗中进行。
19.权利要求14的方法，其中所述选择性培养基包括包含MS基本培养基并补加以下物质的培养基，所述物质为a)脱叶灵，b)吲哚-3-乙酸，c)酪蛋白酶水解物，d)L-抗坏血酸，e)L-谷氨酰胺，f)L-天冬酰胺，g)L-脯氨酸，h)蔗糖和i)琼脂或phytagel。
20.权利要求14的方法，其中所述预培养是在16小时光照/8小时黑暗的光周期下进行的。
21.权利要求14的方法，其中在选择性培养基上的培养是在16小时光照/8小时黑暗的光周期下进行的。
22.权利要求14的方法，其中所述外植体选自茎，小叶，叶柄和芽。
23.一种促进Acacia mangium的转化的不定芽伸长的方法，包括通过权利要求14的方法转化Acacia mangium外植体，并进一步包括在不定芽形成之后在培养基中加入赤霉酸。
24.一种促进Acacia mangium的转化的不定芽上羽状叶形成的方法，包括通过权利要求14的方法转化Acacia mangium外植体，并进一步包括培养在含赤霉酸的培养基上发育的不定芽。
25.一种促进转化的不定芽形成根的方法，包括在包含1/2 MS基本培养基并补加以下物质的培养基上培养转化的不定芽，所述物质为a)α-萘乙酸，b)激动素，c)酪蛋白酶水解物，d)L-抗坏血酸，e)L-谷氨酰胺，f)L-天冬酰胺，g)L-脯氨酸，h)蔗糖和i)phytagel。
26.权利要求25的方法，其中所述培养是在16小时光照/8小时黑暗的光周期下进行的。
27.权利要求25的方法，其中所述培养是在28℃进行的。
28.一种制备转基因Acacia mangium细胞的方法，包括a)在培养基中预培养Acacia mangium的茎片；和b)共培养a)步骤的所述茎片和活化的根癌农杆菌。
29.权利要求28的方法，其中所述预培养在16小时光照/8小时黑暗的光周期下进行3天。
30.权利要求29的方法，其中所述预培养用1800-2000lux的光照进行。
31.权利要求28的方法，其中所述预培养是在28℃进行的。
32.权利要求28的方法，其中所述培养基是AM-265。
33.权利要求28的方法，其中所述茎片在与根癌农杆菌共培养之前浸泡在甘露糖醇溶液中。
34.权利要求28的方法，其中所述活化的根癌农杆菌是通过将它们在诱导培养基中培养而制备的。
35.权利要求34的方法，其中所述活化的根癌农杆菌是通过将它们在黑暗中培养而制备的。
36.权利要求34的方法，其中所述活化的根癌农杆菌是通过将它们在28℃培养而制备的。
37.一种生产转基因Acacia mangium植物的方法，包括a)通过权利要求28的方法制备转基因的Acacia mangium细胞；b)在选择性培养基中培养所述细胞；c)加入生长促进剂；和d)使发育芽的形成根。
38.权利要求37的方法，其中所述选择性培养基包含抗生素。
39.权利要求37的方法，其中所述培养进行一个月以上。
40.权利要求37的方法，其中所述生长促进剂是赤霉酸。
41.一种转基因的Acacia mangium细胞。
42.一种转基因的Acacia mangium植物。
全文摘要
本发明涉及一种通过器官发生而再生Acaciamangium的方法,以及遗传转化Acacia mangium的方法。再生方法包括从作为外植体的幼苗和营养性微型繁殖的小植物的不同部分诱导愈伤组织;诱导不定芽,接着进行羽状叶和芽伸长,最后将伸长的嫩枝诱导为根。基于再生系统,将花椰菜花叶病毒启动子控制下的标记基因GUS,通过农杆菌感染导入Acaciamangium中。对再生的植物进行GUS染色和Southern印迹杂交分析证明外源基因掺入宿主基因组中,并且此外源基因得以表达。
文档编号A01H1/00GK1378599SQ00805244
公开日2002年11月6日 申请日期2000年1月19日 优先权日2000年1月19日
发明者谢德裕, 洪焰 申请人:分子农业生物学院