专利名称：岩藻糖基转移酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码岩藻糖基转移酶的多核苷酸。而且，本发明涉及这些多核苷酸的部分序列以及含有这些多核苷酸的载体、分别用该多核苷酸或来源于它的DNA转染的重组宿主细胞、植物和昆虫，以及这些系统中产生的糖蛋白。
糖蛋白表现出多样和复杂的碳水化合物单位，这些碳水化合物的组成和排列对于不同生物是特征性的。糖蛋白的寡糖单位肩负着多种任务，例如它们对于调节代谢是重要的、并参与传递细胞-细胞间的相互作用、决定蛋白质在循环中的循环期、而且它们对于抗原-抗体反应中的表位识别是决定性的。
糖蛋白的糖基化在内质网(ER)中开始，在此处寡糖通过N-糖苷键与天冬酰胺的侧链结合，或通过O-糖苷键与丝氨酸或苏氨酸的侧链结合。N-结合寡糖含有一个来自由三个甘露糖和两个N-乙酰葡糖胺残基组成的五糖单位的共同核心。为了进一步修饰该碳水化合物单位，蛋白质从ER运送到高尔基复合体。糖蛋白的N-结合寡糖单位的结构由糖蛋白的构象和加工糖蛋白的高尔基体区室中的糖基转移酶的组成来决定。
已经显示，在一些植物和昆虫细胞的高尔基复合体中该核心五糖单位被木糖和α1，3-结合的岩藻糖取代(P.Lerouge等，1998，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)3831-48；Rayon等，1998，L.Exp.Bot.49，1463-1472)。形成的七糖“MMXF3”构成了植物中主要的寡糖类型(Kurosaka等，1991，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)266，4168-4172)。因此，例如，辣根过氧化物酶、胡萝卜β-果糖苷酶和鸡冠刺桐(Erythrinacristagalli)所含凝集素，以及蜜蜂毒液磷脂酶A2或来自昆虫胚的神经元膜糖蛋白含有与该聚糖核心结合的α1，3-岩藻糖残基。这些结构分别又称为复合N-聚糖基，或缺少甘露糖的或截短的N-聚糖。可以进一步将α-甘露糖基(mannosyl)残基替换为结合了半乳糖和岩藻糖的GlcNAc，从而制成相应于人路易斯α表位的结构(Melo等，1997，FEBS Lett 415，186-91；Fitchette-Laine等，1997，植物杂志(Plant J.)12，1411-1471)。
在哺乳动物的糖蛋白中既不存在木糖也不存在α1，3-结合的岩藻糖。已经发现该核心-α1，3-岩藻糖在抗植物和昆虫N-结合寡糖的抗体的表位识别中起着重要作用(I.B.H.Wilson等，糖生物学(Glycobiology)第8卷，第7期，第651-661页，1998)，并且籍此引发人类或动物体中对这些寡糖的免疫反应。而且该α1，3-岩藻糖残基似乎是各种植物和昆虫变态反应原之间广泛存在变态交叉反应性的主要原因之一(Tretter等，Int.Arch.Allerge Immunol.1993；102259-266)，因而又称作“交叉反应性碳水化合物决定簇”(CCD)。在西红柿和草类花粉的表位研究中，还发现α1，3-结合的岩藻糖残基是一种共同决定簇，其似乎是患者中常常一起出现西红柿和草类花粉变态反应的原因(Petersen等，1996，变态反应临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Immunol.)第98卷，4805-814)。由于免疫学交叉反应的频繁发生，该CCD还掩盖了变态反应的诊断。
在人体中由植物蛋白引起的免疫学反应是植物中制备的重组人蛋白质在医学应用中的主要问题。为了避免该问题，必须防止α1，3-核心-岩藻糖基化。研究表明，含有L-半乳糖而不是L-岩藻糖(6-脱氧-L-半乳糖)的寡糖尽管如此还是具有完全的生物学活性的(E.Zablackis等，1996，科学(Science)，第272卷)。根据另一个研究，分离了其中N-乙酰氨基葡糖基转移酶I(复合聚糖生物合成中的第一个酶)缺失的拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)植物突变体。该突变体中复合糖蛋白的生物合成由此被打乱。然而，这些突变植物能够在某些条件下正常发育(A.Schaewen等，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102；1109-1118)。
为了有目的地阻断寡糖中该核心-α1，3-岩藻糖的结合而又不干扰其它的糖基化步骤，仅必须失活直接负责该特异糖基化的酶，即核心-α1，3-岩藻糖基转移酶。已首次从绿豆中分离了该酶和对其进行了特征分析，发现该酶的活性依赖于非还原GlcNAc末端的存在(Staudacher等，1995，糖结合物杂志(Glycoconjugate J.)12，780-786)。该转移酶仅出现在植物和昆虫中，而在人或其它脊椎动物中均未发现，必须有目的地对该酶进行失活或抑制以便分别在植物或植物细胞或者昆虫或昆虫细胞中制备的人类蛋白质不再含有该引发免疫反应的表位，参见本案例。
John M.Burke的论文“为核酶清除道路(Clearing the way forribozymes)”(自然生物技术(Nature Biotechnology)15414-415；1997)涉及核酶作用的一般模式。
Pooga等的论文“细胞渗透性PNA结构体内调节galanin受体水平并改变疼痛的传递(Cell Penetrating PNA constructs regulate galaninreceptor levels and modify pain transmission in vivo)”(自然生物技术16857-861；1998)一般地涉及PNA分子并具体涉及与人I型galanin受体mRNA互补的PNA分子。
美国专利5,272,066 A涉及改变真核和原核蛋白质以延长其在体内的循环的方法。在此发明中，在各种酶，其中也包括GlcNAc-α1→3(4)-岩藻糖基转移酶的帮助下改变了结合的寡糖。
EP 0 643 132 A1涉及分离自人类细胞(THP-1)的α1，3-岩藻糖基转移酶的克隆。在该公开文本中描述的碳水化合物链相应于人的唾液酸路易斯x-和唾液酸路易斯a-寡糖。来自人类细胞的该酶的特异性与来自植物细胞的岩藻糖基转移酶的特异性是极为不同的。
本发明的目的是克隆并测序编码植物岩藻糖基转移酶的基因，以及制备含有该基因、该基因的DNA片段或来源于该基因的改变的DNA或DNA的载体，用这些载体之一转染植物和昆虫以及它们的细胞，产生不合有正常存在的α1，3-核心-岩藻糖的糖蛋白，以及提供用于实现这些的相应方法。
根据本发明的目的通过如下DNA分子来实现，该DNA分子含有根据SEQIN NO1(在本公开中也采用了IUPAC码，“N”代表次黄苷)的序列，其具有从第211位碱基对至第1740位碱基对的可读框；或与上述序列至少50％同源的序列；或可与上述序列在严紧条件下杂交的序列；或者该DNA分子含有由于遗传密码的原因与上述DNA序列简并的序列，其中所述序列编码具有岩藻糖基转移酶活性的植物蛋白质，或是与其互补的序列。
该序列以前从未被描述过，可以完全地应用于任何与植物岩藻糖基转移酶活性相关的实验、分析和制备方法中。该DNA序列以及由该序列编码的蛋白质是本发明所关心的。然而，尤其可以将该DNA序列用于抑制岩藻糖基转移酶活性。
SEQ ID NO1的可读框编码具有510个氨基酸和56.8 kDa的理论分子量的蛋白质，推测在Asn36和Gly54之间的区域中存在一个跨膜部分。根据SEQ ID NO1的序列的编码蛋白质的计算pI值是7.51。
通过如下方法检测并测量该植物岩藻糖基转移酶的活性，该方法是向含有标记的岩藻糖和与载体例如Sepharose结合的受体(例如糖蛋白)的样品中加入该岩藻糖基转移酶。反应时间后，洗涤该样品，并测量结合的岩藻糖的量。在此，如果活性测量值比阴性对照的活性测量值高出至少10-20％，尤其是至少30-50％，则该岩藻糖基转移酶的活性被看作是阳性的。此外还可以利用HPLC来验证该糖蛋白的结构。这些操作均是现有技术(Staudacher等，1998，分析生物化学(Anal.Biochem.)246，96-101；Staudacher等，1991，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)199，745-751)。
例如，将岩藻糖基转移酶与含有放射性标记的岩藻糖和受体例如GlcNAcβ1-2Manα1-3(GlcNAβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn的样品混合。在反应时间后，通过阴离子交换层析纯化该样品，并测量结合的岩藻糖的量。从含有受体的样品的放射性活性测量值与不含受体的阴性对照的放射性活性测量值之间的差异，能够计算出岩藻糖基转移酶活性。如果该放射性活性测量值比阴性样品的放射性活性测量值高至少30-40％，则该岩藻糖基转移酶的活性被评价为阳性。
通过选择温度和样品的离子强度，能够改变两个DNA分子的配对。根据本发明，严紧条件应理解为使得可以发生准确而严紧的结合的条件。例如，在7％十二烷基磺酸钠(SDS)、0.5M NaPO4(pH7.0)、1mM EDTA中50℃杂交这些DNA分子，并在42℃用1％SDS进行洗涤。
可以利用例如EMBL或SWISSPROT数据库的程序FastDB，确定序列是否与SEQ ID NO1有至少50％的同源性。
优选地，本发明DNA分子的序列编码具有GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶活性，尤其是具有核心-α1，3-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
正如以上描述的，α1，3-岩藻糖基转移酶的核心存在于植物和昆虫中，然而人体中没有，以致该DNA序列在岩藻糖基转移酶特异的分析、实验以及制备方法中尤其有用。
核心-α1，3-岩藻糖基转移酶应理解为尤其是GDP-L-FucAsn结合的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶。在本发明的范围中，术语α1，3-岩藻糖基转移酶一般说来尤其是指核心-α1，3岩藻糖基转移酶。对于上述的活性测量，尤其是使用具有非还原GlcNAc末端的受体。这些受体是例如GlcNAcβ1-2Manα1-3(GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn、GlcNAcβ1-2Manα1-3(GlcNAcβ1-2Manα1-6)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAcβ1-Asn和GlcNAcβ1-2Manα1-3[Manα1-3(Manα1-6)Manα1-6]Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn。可以通过质谱分析的检测测量相对于N-糖苷酶F的不敏感性，从而可以进一步确定是否结合了岩藻糖。
优选地，根据本发明的DNA分子与根据SEQ ID NO1的序列具有至少70-80％、尤其优选至少95％的同源性。该序列编码特别有活性的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶。
由于该DNA序列能够依据植物或昆虫而或多或少有所改变，因此表现出例如与根据SEQ ID NO1的序列70％同源的序列也具有足够用于上述分析、实验或制备方法的岩藻糖基转移酶活性。
根据再一有利的实施方案，该DNA分子含有2150-2250，尤其是2198个碱基对。该DNA分子在可读框起始密码子之前上游含有100-300，优选210个碱基对，并在该可读框的终止密码子之后下游含有350-440，尤其是458个碱基对，其中该DNA分子的末端优选含有一个3’-poly(A)尾。以此方式，确保了在翻译水平上的无错误调节，而且提供了尤其有效和不会出错地编码活性GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的DNA分子。
本发明还涉及如下DNA分子，该DNA分子含有根据SEQ ID NO3的序列，或含有与上面所标识的序列至少85％，尤其优选至少95％，尤其是至少99％同源的序列，或可以在严紧条件下与上述序列杂交的序列，或由于遗传密码的原因与上述DNA序列具有简并性的序列。该同源性优选采用能够识别插入和缺失并在同源性计算中不考虑这些的程序来确定。该核苷酸序列编码一个保守的肽基序，这就意味着大多数具有活性和功能的GlcNAc-α1，3-岩藻糖转移酶含有由此编码的氨基酸序列。在本发明中，该序列可以与根据SEQ ID NO3的序列有相同大小，或当然也可以更大。该序列的长度比编码该完整蛋白质的序列短，因此对于重组、缺失或任何其它突变也较不敏感。由于该保守基序和它的较高稳定性，该序列对于序列识别测试尤其有利。
SEQ ID NO3含有以下序列5’-GAAGCCCTGAAGCACTACAAATTTAGCTTAGCGTTTGAAAATTCGAATGAGGAAGA TTATGTAACTGAAAAATTCTTCCAATCCCTTGTTGCTGGAACTGTCCCT-3’在又一方面，本发明涉及如下DNA分子，该DNA分子含有上述DNA分子之一的部分序列，并具有20-200，优选30-50个碱基对的大小。该DNA分子可以例如作为探针用于和GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的互补序列结合，以便可以从样品中将这些酶筛选出来。以此方式，还可以从各种各样的植物和昆虫中筛选、分离并定性分析GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶。可以使用任何期望的一个或几个不同的部分序列，尤其是上面已描述的保守基序的部分。
这样做时，如果上述DNA分子之一与可检测的标记物质共价结合，则将是尤其有利的。任何普通的标记都可以用作该标记物质，例如荧光标记、发光标记、放射性标记、非同位素标记如生物素等。以此方式，提供了适合于通过杂交方法在固体组织样品(例如来自植物的)或在液体样品中检测、选择和定量相应DNA分子的试剂。
本发明的再一方面涉及含有上述DNA分子之一或其具有至少20个碱基对的不同长度部分的生物学上有功能的载体。为了转染宿主细胞，能够扩增的独立载体是必需的，其中依据宿主细胞、转染机制、目的和该DNA分子的大小，可以采用适合的载体。由于已知有非常多的不同载体，尤其是由于这些载体是技术人员极为熟知的(关于技术人员已知的这些载体以及在本发明说明书中采用的所有技术和术语也参见SambrookManiatis)，所以对其的列举超出了本申请的限制，故不在此进行列举。理想的是该载体具有小的分子量，并应含有选择基因以便在细胞中产生易于识别的表型，由此使得可以容易地选择含有载体的和不含载体的宿主细胞。为了获得高产量的DNA和相应的基因产物，该载体应含有强启动子，以及增强子、基因扩增信号和调节序列。而且，为了载体的自主复制，复制原点是重要的。聚腺苷酸化位点负责mRNA的正确加工，拼接信号则负责RNA转录本的加工。如果采用噬菌体、病毒或病毒颗粒作为载体，则包装信号将控制该载体DNA的包装。例如，对于植物中的转录，Ti质粒是适合的，对于昆虫细胞中的转录，杆状病毒是适合的，而在昆虫中转座子例如P因子则是适合的。
如果将上述发明的载体插入到植物或植物细胞中，则内源性α1，3-岩藻糖基转移酶基因表达的转录后抑制可以通过其同源转基因或它的部分的有义向转录来实现。而且，对于该有义技术，可以参考如下公开论文Baucombe 1996，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)9373-382；和Brigneti等，1998，EMBO J.176739-6746。该“基因沉默”策略是抑制α1，3-岩藻糖转移酶表达的一种有效方式，也参见Waterhouse等，1998，美国国家科学院院刊(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)9513959-13964。
而且，本发明涉及含有与启动子反向的根据上述实施方案之一的DNA分子，或其长度不同的部分的生物学上有功能的载体。如果用该载体转染宿主细胞，则将读出与该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的mRNA互补、并与其形成复合物的“反义mRNA”。该键合将阻碍正确的加工、转运、稳定性，或通过阻止核糖体的退火，阻碍翻译并由此阻碍该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的正常基因表达。
尽管可以将该DNA分子的完整序列插入该载体中，但对于某些目的其部分序列由于长度较小可能是有利的。例如就反义技术而言，重要的是该DNA分子足够大，以便形成可以和该转移酶mRNA结合的足够大的反义mRNA。适合的反义RNA分子含有例如50-200个核苷酸，因为许多已知的天然存在反义RNA分子含有大约100个核苷酸。
为了特别有效地抑制活性α1，3-岩藻糖基转基因的表达，将有义技术和反义技术结合在一起是适合的(Waterhouse等，1998，美国国家科学院院刊9513959-13964)。
有利的是采用快速杂交的RNA分子。大小超过50个核苷酸的反义RNA分子的有效性将取决于体外的退火动力学。因此，例如快速退火反义RNA分子比慢杂交RNA分子表现出对蛋白表达的更大抑制(Wagner等，1994，Annu.Rev.Microbiol. 48713-742；Rittner等，1993，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)211381-1387)。这些快速杂交反义RNA分子尤其含有大量的外来碱基(external bases)(游离末端和连接序列)、大量的亚结构域(组件)以及低程度的环(Patzel等，1998；自然生物技术1664-68)。可以例如借助计算机程序来确定该反义RNA分子的假拟二级结构，籍此选择适合的反义RNA的DNA序列。
可以将该DNA分子的不同序列区域插入载体中。一种可能性是例如仅将负责核糖体退火的部分插入载体中。在该区域中封闭mRNA将足以终止整个翻译。针对该基因的5’-和3’-非翻译区也可以产生尤其高效的反义分子。
优选地，根据本发明的DNA分子包括含有缺失、插入和/或替代突变的序列。突变核苷酸的数目是可变的，并且变化范围从一个至几个缺失、插入或替代核苷酸。通过该突变使阅读框发生移码也是可能的。在这种“敲除基因”中，唯一重要的是破坏GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的表达，以及阻止形成具有功能的活性酶。这样做时，只要可以阻止酶活性蛋白质的表达，突变的位置是可变的。优选位于C端区域的酶催化区域中的突变。在DNA序列中插入突变的方法是本领域技术人员所熟知的，因此在此无需详细讨论诱变的各种可能性。随机诱变(coincidentalmutageneses)以及尤其是定向诱变例如定点诱变、寡核苷酸控制的诱变、或借助限制性酶的诱变均可以用于本发明中。
本发明还提供编码如下核酶的DNA分子，该核酶含有与上述本发明DNA分子的序列部分相互补的两个至少各长10-15个碱基对的序列部分，这样该核酶可以和从天然GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶DNA分子转录的mRNA形成复合物并切割之。该核酶通过与GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶mRNA的互补碱基配对识别该mRNA。之后，该核酶将在该酶被翻译之前以序列特异性方式切割并破坏该RNA。在与该切割底物解离后，该核酶将重复地与RNA分子杂交并作为特异性内切核酸酶起作用。一般地，即使不知道编码某种蛋白质的完整DNA序列，也可以特异制备用于失活其mRNA的核酶。如果核糖体沿着mRNA缓慢移动，则该核酶将尤其有效。假使那样，该核酶将更为容易发现mRNA上没有核糖体的位置。由于这个原因，缓慢的核糖体突变体也适合作为使用核酶的系统(J.Burke，1997，自然生物技术15，414-415)。对于植物GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶表达的下调和抑制，该DNA分子都是尤其有利的。
还有一种可能的方式是利用一种改变形式的核酶，即微型酶(minizyme)。微型酶对于切割更大的mRNA分子尤其有效。微型酶是具有一个替代茎/环II的短寡核苷酸接头的锤头核酶。二聚体微型酶尤其有效(Kuwabara等，1998，自然生物技术，16961-965)。因此，本发明还涉及含有刚提及的两种DNA分子(突变或核酶-DNA分子)之一的生物学上有功能的载体。以上关于载体的描述也适用于此。该载体可以例如被插入微生物中，并可用于产生高浓度的上述DNA分子。而且，该载体尤其适宜于将特异DNA分子插入植物或昆虫生物体中以便下调或完全抑制该生物体中GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生。
根据本发明，提供制备含有本发明DNA分子的cDNA的方法，其中从昆虫或植物细胞，尤其是从下胚轴(hypocotyl)细胞中分离RNA，籍此在与逆转录酶和引物混合后进行逆转录。该方法的各个步骤均根据本来已知的操作程序进行。一方面，对于逆转录，可以在oligo(dT)引物的帮助下产生完整mRNA的cDNA，仅在此时才利用选择的引物进行PCR，以制备含有该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶基因的DNA分子。另一方面，可以直接采用选择的引物进行逆转录以便获得短的特异cDNA。适合的引物可以例如根据该转移酶的cDNA序列型式通过合成来制备。利用这种方法，可以以一种简单的方式而且是几乎没有错误地快速产生大量的本发明cDNA分子。
本发明还涉及克隆GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的方法，其特征在于将本发明的DNA分子克隆至载体中，随后用该载体分别转染宿主细胞或宿主，其中通过对转染宿主细胞的选择和扩增，获得表达该活性GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的细胞系。例如，可以借助限制性内切核酸酶将该DNA插入载体中。对于载体，可以应用以上的描述。在该方法中重要的是选择有效的宿主-载体系统。真核宿主细胞尤其适合于获得活性酶。一种可能的途径是用载体转染昆虫细胞。在这样作时，将必须采用尤其是昆虫病毒例如杆状病毒等作为载体。
当然，也可以转染人或其它脊椎动物的细胞，在这种情况下后者将表达对于它们而言外来的酶。
优选地，提供分别制备GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全停止的重组宿主细胞，尤其是植物或昆虫细胞，或植物或昆虫的方法，其特征在于将根据本发明的至少一种载体，即含有本发明DNA分子、突变的DNA分子或编码核酶的DNA分子的载体，或含有方向与启动子相反的DNA分子的载体，插入宿主细胞或植物中，或插入昆虫中。以上关于转染的描述在此也适用。
例如，植物细胞可以用作宿主细胞，其中例如农杆菌系统和Ti质粒是适合的。用该农杆菌系统可以直接转染植物农杆菌在植物中引起根茎菌瘿。如果农杆菌感染受伤的植物，则细菌本身并不进入植物，而是将染色体外诱导肿瘤的环状Ti质粒的重组DNA部分(又称T-DNA)插入植物细胞中。该T-DNA，因此也是插入其中的DNA分子，以一种稳定的方式被置于细胞的染色体DNA中，以致T-DNA的这些基因可以在植物中表达。
针对不同的宿主系统存在许多已知的有效转染机制。一些例子是电穿孔、磷酸钙方法、显微注射、脂质体方法。
随后，例如以载体所包含基因赋予的抗生素抗性或其它标记基因为基础，选择转染细胞。然后小量地(例如在培养皿中)或大量地(例如在发酵罐中)扩增该转染细胞系。而且，植物具有一种特殊的性质，即它们能够分别从一个(转染)细胞或从原生质体再生出能够生长的完整植株。
根据所用的载体，在宿主中将会发生不同的过程，以致抑制或完全阻断该酶的表达如果用含有带缺失、插入或替代突变的DNA分子的载体进行转染，则会发生同源重组；尽管带有突变，但该突变DNA分子将识别宿主细胞基因组中的一致序列，并准确地插在该位置上以致形成“敲除基因”。以此方式，将能够抑制该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶无误表达的突变引入该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的基因中。正如以上阐述的，使用该技术重要的是该突变应足以阻断该活性蛋白质的表达。在选择和扩增后，作为额外的检查可以对该基因进行测序以便确定同源重组是否成功或突变的程度。
如果用含有编码核酶的DNA分子的载体进行转染，则在宿主细胞中将会表达该活性核酶。该核酶会在至少某一个位点与互补的该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶mRNA序列形成复合物，并切割该位点，以此方式它能够抑制该酶的翻译。在该宿主细胞、以及细胞系或任选的来源于它们的植物中，将不表达GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶。在载体含有方向与启动子相同或相反的本发明DNA分子的情况下，在转染细胞(或植物)中将表达有义或反义mRNA。该反义mRNA至少与该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶mRNA序列的一部分互补，并且可以同样地抑制该酶的翻译。作为通过反义技术抑制基因表达的方法的例子，参考Smith等的公开论文(1990，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)224477-481)，其中在该公开论文中参与西红柿成熟过程的基因的表达受到抑制。
在所有这些系统中，GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的表达至少受到抑制，优选甚至被完全阻断。基因表达的破坏程度将取决于复合物形成的程度、同源重组的程度、随后可能的随机突变以及该基因组区域中的其它加工。检查转染细胞的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶活性并进行选择。
而且，通过在插入上述载体外，向宿主中引入含有编码哺乳动物蛋白质例如β1，4-半乳糖基转移酶的基因的载体，还可以进一步地增加上述对α1，3-岩藻糖基转移酶的抑制。岩藻糖基化可以通过其它哺乳动物酶的作用来降低，利用本发明的载体和利用哺乳动物酶载体相结合来抑制活性α1，3-岩藻糖基转移酶的表达是尤其有效的。
可以采用任何类型的植物来进行转染，例如绿豆、烟草植物、西红柿和/或马铃薯植物。制备重组宿主细胞、尤其是植物或昆虫细胞，或植物或昆虫的另一有利方法是，分别将含有突变的DNA分子在非突变的同源序列位置插入宿主细胞、或植物或昆虫的基因组中(Schaefer等，1997，植物杂志(Plant J.)；11(6)1195-1206)。因此该方法不是利用载体来进行的，而是利用纯DNA分子来进行的。仅提及三个例子，例如可以通过基因轰击、显微注射或电穿孔将该DNA分子插入宿主中。正如已阐明的，该DNA分子与宿主基因组中的同源序列结合，以致在基因组中出现同源重组和由此引起的对缺失、插入或替代突变的接受从而能够抑制或完全地阻断该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的表达。
本发明的又一方面涉及如下植物或植物细胞，和昆虫或昆虫细胞，它们的G1cNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶活性分别是天然的植物或植物细胞，和昆虫或昆虫细胞中存在的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶活性的不到50％、尤其是不到20％、尤其优选0％。这些植物或植物细胞的优点是它们产生的糖蛋白不含有或几乎不含有任何α1，3-结合的岩藻糖。如果这些植物或昆虫的产品被人或脊椎动物机体所摄取，将不会出现针对该α1，3-岩藻糖表位的免疫反应。
优选地，提供通过上述方法之一制备的、其GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全阻断的重组植物或植物细胞。
本发明还涉及通过上述方法之一制备的、其GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全阻断的重组昆虫或昆虫细胞。在此，由于不产生具有α1，3-结合的岩藻糖残基的糖蛋白，所以同样不会发生针对该α1，3-岩藻糖表位的免疫反应。
本发明还涉及含有与本发明DNA分子序列互补的碱基序列的PNA分子及其部分序列。PNA(肽核酸)是一种核酸碱基(nuleobases)与假肽主链连接的DNA样序列。通常PNA与互补的DNA、RNA或PNA寡聚物通过Watson-Crick碱基配对和螺旋的形成来杂交。该肽主链确保了对酶降解的更大抗性。因此，PNA分子是一种改良的反义剂。无论核酸酶还是蛋白酶均不能攻击PNA分子。如果与互补序列结合，该PNA分子的稳定性对DNA和RNA聚合酶、逆转录酶、端粒酶和核糖体构成了足够的空间阻碍。如果该PNA分子含有上述序列，则将与编码GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的DNA或DNA的一个位点结合，以此方式该PNA分子能够抑制该酶的转录。由于PNA分子既不能转录也不能翻译，故通过人工合成的方式例如利用t-Boc技术来制备。有利的是提供含有相应于本发明DNA分子序列的碱基序列的PNA分子及其部分序列。该PNA分子将与GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的mRNA或mRNA的一个位点形成复合物，以致抑制该酶的翻译。所提及的关于反义RNA的类似讨论适用于本情况。因此，例如，尤其有效的复合物形成区域是mRNA的翻译起始区域或5’-非翻译区。
本发明的又一方面涉及分别制备GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的表达在转录或翻译水平上被阻断的植物或昆虫或细胞(尤其是植物或昆虫细胞)的方法，其特征在于将本发明的PNA分子插入这些细胞中。为了在细胞中插入一个PNA分子或多个PNA分子，可以使用常规方法例如电穿孔或显微注射等。如果该PNA寡聚物与细胞的穿透肽(penetrationpeptides)例如运输蛋白(transportan)或pAntp(Pooga等，1998，自然生物技术16857-861)结合，则插入尤其有效。
本发明提供制备重组糖蛋白的方法，其特征在于分别用表达该糖蛋白的基因转染GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全阻断的本发明重组植物或植物细胞、以及重组昆虫或昆虫细胞，或转染其中根据本发明的方法插入了所述PNA分子的植物或昆虫、或细胞，以致该重组糖蛋白被表达。在这样做时，正如上面已描述的，按上面已经描述的方法分别将含有编码目的蛋白质的基因的载体转染至宿主或宿主细胞中。该转染的植物或昆虫细胞将表达该目的蛋白质，并且这些蛋白质不含或几乎不含α1，3-结合的岩藻糖。因此，它们不会在人体或脊椎动物体内引发上面所提及的免疫反应。任何蛋白质均可以在这些系统中产生。
有利的是提供制备重组人糖蛋白的方法，其特征在于分别用表达该糖蛋白的基因转染GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全阻断的重组植物或植物细胞、以及重组昆虫或昆虫细胞，或转染其中根据本发明的方法插入了PNA分子的植物或昆虫、或细胞，以致该重组糖蛋白被表达。通过这种方法，可以在植物(植物细胞)中制备如果被人体摄取不会引发任何对抗α1，3-结合的岩藻糖残基的免疫反应的人类蛋白质。这样，就可以利用植物类型例如香蕉、马铃薯和/或西红柿来生产作为食物的重组糖蛋白。该植物的组织含有该重组糖蛋白，以致例如通过从该组织中提取出该重组糖蛋白，并随后进行施用，或直接通过食用该植物组织，可以将该重组糖蛋白摄取入人体内。
优选地，提供制备医用重组人糖蛋白的方法，其中分别用表达该糖蛋白的基因转染GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全阻断的本发明重组植物或植物细胞、以及重组昆虫或昆虫细胞，或转染其中根据本发明的方法插入了所述PNA分子的植物或昆虫、或细胞，以致该重组糖蛋白被表达。在这种情况下，可以采用任何具有医学价值的蛋白质。
本发明还涉及根据上述方法的重组糖蛋白，其中它们是在植物或昆虫系统中制备的，并且其中它们的肽序列含有在无岩藻糖基转移酶减少的植物或昆虫系统中表达的蛋白质所具有的α1，3-结合岩藻糖残基的不到50％、尤其是不到20％、尤其优选0％。自然地，不含有α1，3-结合的岩藻糖残基的糖蛋白是优选的。α1，3-结合的岩藻糖的量将取决于上述GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶抑制的程度。
优选地，本发明涉及根据上述方法在植物或昆虫系统中制备的重组人糖蛋白，其肽序列含有在无岩藻糖基转移酶减少的植物或昆虫系统中表达的蛋白质所具有的α1，3-结合岩藻糖残基的不到50％、尤其是不到20％、尤其优选0％。
一个尤其优选的实施方案涉及根据上述方法在植物或昆虫系统中制备的医用重组人糖蛋白，其肽序列含有在无岩藻糖基转移酶减少的植物或昆虫系统中表达的蛋白质所具有的α1，3-结合岩藻糖残基的不到50％、尤其是不到20％、尤其优选0％。
根据本发明的糖蛋白可以包括植物或昆虫特异性的其它结合寡糖单位，籍此—就人类糖蛋白而言—使它们与这些天然糖蛋白不同。然而，根据本发明的糖蛋白在人体中仅会引起更轻微的免疫反应，或根本不引起免疫反应，这是因为正如在本发明说明书的前言部分已阐明的，α1，3-结合的岩藻糖残基是针对植物和昆虫糖蛋白的免疫反应或交叉免疫反应的主要原因。
本发明再一方面包括含有根据本发明的糖蛋白的药物组合物。除了本发明的糖蛋白外，该药物组合物还含有通常用于这种组合物的添加物。这些是例如具有各种缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐、pH和离子强度)的适合稀释剂、添加剂如表面活性剂和增溶剂(例如Tween80、多乙氧基醚(polysorbate 80))、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)、辅药、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、乳化剂、填料(例如乳糖、甘露醇)，该蛋白质与聚合物例如聚乙二醇的共价结合，将该物质掺入多聚化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒组合物中，或置于脂质体中，适合于各种处理的助剂和/或载体物质。这些组合物将影响本发明糖蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速度和体内排泄速度。
本发明还提供筛选样品中编码GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的DNA分子的方法，其中将可以和编码GlcNAc-1，3-岩藻糖基转移酶的DNA分子结合的本发明标记DNA分子与样品混合。可以对该杂交DNA分子进行检测、定量和选择。对于含有可以和该标记DNA分子杂交的单链DNA的样品，通过例如加热来变性该样品。一种可能的方式是可以在加入内切核酸酶之后通过在琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳分离待分析的DNA。将该DNA转移至硝酸纤维素膜上后，与可以和相应的同源DNA分子杂交的根据本发明的标记DNA分子混合(“Southern印迹”)。
另一种可能的方式是通过依赖于PCR的方法，采用来源于本发明DNA分子序列的特异和/或简并引物，从其它物种寻找同源基因。
优选地，用于以上的本发明方法的样品含有植物或昆虫生物的基因组DNA。通过该方法，可以以非常快速和有效的方式分析大量植物和昆虫是否存在该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶。这样，通过上述本发明方法，可以筛选不含有该基因的植物和昆虫、或可以在含有该基因的植物和昆虫中抑制或完全阻断该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的表达，以便随后可以将它们用于(人类)糖蛋白的转染和产生。本发明还涉及根据以上最后提及的两个方法选择并随后从样品中分离的编码GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的DNA分子。这些分子可以用于进一步的分析。可以对它们进行测序，然后可以将它们用作DNA探针以寻找GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶。这些标记的DNA分子将比本发明的DNA分子更为有效地作为探针发挥作用，以寻找和从中分离出它们的生物体相关的生物体。本发明的再一方面涉及根据本发明克隆的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的制品，该制品含有pI值从6.0至9.0，尤其是从6.8至8.2的同工型。蛋白质的pI值是其净电荷为零时的pH值，蛋白质的pI值取决于氨基酸序列、糖基化的样式以及蛋白质的空间结构。该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶含有至少7种pI值在此范围内的同工型。该转移酶具有多种同工型的原因是，例如不同的糖基化和有限的蛋白水解。实验显示绿豆不同植株的幼苗具有不同的同工酶关系。蛋白质的pI值可以通过本领域技术人员已知的等电聚焦来测定。该酶的主要同工型具有54kDa的表观分子量。
尤其是，本发明的制品含有pI值为6.8、7.1和7.6的同工型。
本发明还涉及制备人类和其它脊椎动物糖蛋白的“植物化(plantified)”碳水化合物单位，其中将岩藻糖单位以及上述DNA分子编码的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶与含有碳水化合物单位或糖蛋白的样品混合，以便岩藻糖通过该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶与碳水化合物单位或糖蛋白在α1，3-位结合。通过根据本发明用于克隆GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的方法，可以制备大量的纯化酶。为了获得具有完全活性的转移酶，提供适合的反应条件。已经显示，如果采用2-(N-吗啉代)-乙磺酸-HCl作为缓冲液，则该转移酶在pH大约7时具有尤其高的活性。在存在二价阳离子，尤其是Mn2+时，该重组转移酶的活性增强。该碳水化合物单位可以以未结合形式或结合蛋白质的形式与样品混合。该重组转移酶对于这两种形式均具有活性。本发明将通过以下实施例和附图作更为详细的阐述，当然这些实施例和附图不应是限制性的。
附图详述
图1a和1b以曲线形式显示在各个洗脱液组分中所测量到的蛋白质量和所测量到的酶活性；图2显示GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的凝胶电泳分析；图3显示等电聚焦的结果和所测量到的各种同工型的转移酶活性；图4显示4个胰蛋白酶消化产生的肽1-4的N端序列和三个引物S1、A2和A3的DNA序列；图5a和5b显示α1，3-岩藻糖基转移酶的cDNA序列；图6a和6b显示来源于该cDNA序列的α1，3-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列；图7是α1，3-岩藻糖基转移酶以及其氨基酸残基疏水性的示意图；图8显示各种岩藻糖基转移酶的保守基序比较；图9显示用α1，3-岩藻糖基转移酶基因转染的昆虫细胞的岩藻糖基转移酶活性与阴性对照的比较；
图10a和10b显示α1，3-岩藻糖基转移酶的不同接受体的结构；
图11和12显示质谱分析结果；
图13显示HPLC的结果。
实施例1核心-α1，3-岩藻糖基转移酶的分离所有步骤均在4℃进行。在混合器中匀浆绿豆幼苗，每kg绿豆使用0.75体积的提取缓冲液。之后，将匀浆物通过两层棉织物过滤，然后30000×g离心该滤液40分钟。丢弃上清液，用溶解缓冲液在连续搅拌下过夜抽提沉淀。随后30000×g离心40分钟产生表面活性剂triton的提取物。
按如下纯化该triton提取物步骤1将该triton提取物加在来自Whatman的微颗粒二乙基氨基乙基纤维素阴离子交换剂DE52纤维素柱(5×28cm)上，该柱之前用A缓冲液进行过校准。在步骤2中进一步处理未结合的组份。
步骤2将样品加在用A缓冲液校准过的Affi-Gel Blue柱(2，5×32)上。用该缓冲液洗涤柱后，用含有0.5M NaCl的A缓冲液洗脱吸附的蛋白质。
步骤3将来自步骤2的洗脱物对B缓冲液透析，之后将其施加在用同样的缓冲液校准过的S-Sepharose柱上。用具有0-0.5M NaCl线性梯度的B缓冲液洗脱结合的蛋白质。将含有GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的组分合并，并对C缓冲液进行透析。
步骤4将该透析样品施加在C缓冲液校准过的GnGn-Sepharose柱上。用含有1M NaCl而非MnCl2的C缓冲液洗脱结合的蛋白质。
步骤5之后，将该酶对D缓冲液进行透析，并施加在GDP-Hexanolamine-Sepharose柱上。用D缓冲液洗涤该柱后，通过用0.5mM GDP取代MgCl2和NaCl洗脱该转移酶。合并活性组分，对20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)透析，并冻干。
通过采用浓度各为0.5和0.25的底物GnGn肽和GDP-L-(U-14C)-岩藻糖，在存在2-(N-吗啉代)乙磺酸-HCl缓冲液、Triton X-100、MnCl2、GlcNAc和AMP时，测定该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的酶活性(根据Staudacher等，1998，糖结合物杂志(Glycoconjugate J.)15，355-360；Staudacher等，1991，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)199，745-751)。
利用二金鸡宁酸方法(Pierce)，或在酶纯化的最后步骤通过氨基酸分析(Altmann 1992，分析生物化学(Anal.Biochem.)204，215-219)测定蛋白质的浓度。
在
图1a和1b中，以曲线的形式描述了在各个洗脱物组分中所测量到的蛋白质量和所测量到的酶活性。
图1a显示了在S-Sepharose柱上进行的上述分离，
图1b显示了在GnGn-Sepharose柱上进行的分离，圆圈代表蛋白质，全黑圈代表GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶，方形代表N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase)。一个单位(U)定义为每分钟将1mmol岩藻糖转移到受体上的酶量。
表1显示了转移酶纯化的各个步骤。
表1纯化步骤总蛋白质总活性 比活性 纯化因子产量mg mU mU/mg -倍数％Triton X-100提取物 91500 48460.05 1 100DE52 43700 47500.10 298.0Affigel Blue 180.5 4134 23 46085.3S-Sepharose8.4 3251 390780067.1GnGn-Sepharose 0.13110448030 16000021.5GDP-Hexanolamine-0.021867 43350 86700017.9Sepharose1通过氨基酸分析确定的提取缓冲液0.5mM二硫苏糖醇1mM EDTA0.5％聚乙烯聚吡咯烷酮0.25M蔗糖50mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.3溶解缓冲液0.5mM二硫苏糖醇1mM EDTA1.5％ Triton X-10050mM Tris-HCl，pH 7.3A缓冲液25mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.3，含有0.1％ Triton X-100和0.02％ NaN3B缓冲液25mM柠檬酸钠缓冲液，pH 5.3，含有0.1％Triton X-100和
0.02％ NaN3C缓冲液25mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.3，含有5mM MnCl2和0.02％NaN3D缓冲液25mM Tris-HCl，pH 7.3，含有10mM MgCl20.1M NaCl和0.02％ NaN3实施例2SDS-PAGE和等电聚焦在Biorad微型蛋白(Mini-protean)电泳槽中于含有12.5％丙烯酰胺和1％甲叉丙烯酰胺的凝胶上进行SDS-PAGE。用考马斯亮蓝R-250或银染色该凝胶。在pI范围在6-9的预制凝胶上(Servalyt precotes 6-9，Serva)，进行该岩藻糖基转移酶的等电聚焦。根据厂家的操作指南用银染色该凝胶。对于双向电泳，从该聚焦凝胶上切下泳道，用S-烷化剂和SDS进行处理，然后按上述进行SDS-PAGE。
图2显示了GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的电泳凝胶，左侧指示了双向电泳，右侧为单向SDS-PAGE。标示为A的泳道是标准品，标示为B的泳道是从GnGn-Sepharose柱获得的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶，标示为C的泳道是“纯化的”GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶，即GDPHexanolamine Sepharose柱的组分。两条54和56 kDa带是该转移酶的同工型。
图3显示等电聚焦的结果。A泳道是银染色的，B泳道上测试了该转移酶同工型的活性。该活性表示为已从GDP-岩藻糖转移到底物上的岩藻糖的百分数。实施例3肽测序为了对蛋白质进行测序，根据Gorg等(1998，电泳(Electrophoresis)9，681-692)的方法，从考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上切下条带，经羧基酰胺甲基化后用胰蛋白酶切割。利用反相HPLC在1.0×250mmVydac C18上40℃，以0.05ml/min的流速分离该胰蛋白酶消化的肽，其中采用了HP 1100装置(Hewlett-Packard)。用Hewlett-Packard G1005A蛋白质测序系统，根据厂家的操作指南，将该分离的多肽分开。并且，采用MALDI-TOF MS通过凝胶内消化(Ingel digestion)分析该肽混合物(见下)。
图4显示4个胰蛋白酶消化产生的肽1-4的N端序列(SEQ ID NO5-8)。从这头三个肽出发，制备了引物S1、A2和A3(SEQ ID NO9-11)。实施例4RT-PCR和cDNA克隆从3日龄绿豆的下胚轴中分离总RNA，其中采用了Promega的SV总RNA分离系统。为了制备第一链cDNA，将总RNA与AMV逆转录酶和oligo(dT)引物于48℃一起孵育1小时，其中采用了Promega的逆转录系统。将第一链cDNA用于PCR，其中采用了有义和反义引物的组合向10μl逆转录反应混合物中，加入下列物质各0.1mmol的引物，0.1mM dNTPs、2mM MgCl2、10mM Tris-HCl缓冲液pH 9.0、50mM KCl和0.1％Triton X-100，共50μl.
第一个变性步骤95℃2分钟之后，进行40个循环，每个循环为95℃1分钟、49℃1分钟和72℃ 2分钟。72℃8分钟完成最后的延伸步骤。采用Invitrogen的TA克隆试剂盒将PCR产物亚克隆在pCR2.1载体中，并测序。该PCR的产物是长744bp和780bp的两个DNA片段，这两个DNA片段具有相同的5’-末端(也参照图7)。
从这两个DNA片段起始，通过cDNA末端的5’和3’快速扩增(RACE)获得缺失的该cDNA 5’和3’区，其中采用了Gibco-BRL的RACE试剂盒。采用该试剂盒的通用扩增引物作为反义引物，而采用5’-CTGGAACTGTCCCTGTGGTT-3’(SEQ ID NO12)或5’-AGTGCACTAGAGGGCCAGAA-3’(SEQ ID NO13)作为有义引物。还采用了该试剂盒的缩短锚定引物作为有义引物，以及采用5’-TTCGAGCACCACAATTGGAAAT-3’(SEQ ID NO14)或5’-GAATGCAAAGACGGCACGATGAAT-3’(SEQ ID NO15)作为反义引物。
采用55℃的退火温度并在上述的条件下进行该PCR。将该5’和3’RACE产物亚克隆在pCR2.1载体中，并测序通过双脱氧核苷酸方法(ABI PRISMDye Terminator Cycle Sequencing Ready反应试剂盒和ABI PRISM 310遗传分析仪(Perkin Elmer))，对这些亚克隆片段进行测序。对于克隆在pCR2.1载体中的产物的测序采用了T7和M13正向引物。通过Vienna VBCGenomics Seguencing Service，采用红外线标记的引物(IRD700和IRD800)和LI-COR Long Read IR 4200测序仪(Lincoln，NE)对该克隆区域进行了双链测序。
图5a和5b显示长2198bp、具有一个1530bp的可读框的完整cDNA(SEQID NO1)。该可读框(起始密码子在第211-213位碱基对处，终止密码子在第1740-1743位碱基对处)编码具有510个氨基酸、56.8 kDA分子量以及7.51理论pI值的蛋白质。
图6a和6b显示来源于该cDNA的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。天门冬酰胺结合的糖基化位置是Asn346和Asn429。
图7中，图示了GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的cDNA(上)，以及推导的该编码蛋白质的疏水指数(下)，正疏水指数意味着疏水性增加。在两个图之间，显示了上述两个PCR产物相应于该完整cDNA的大小。用宽带表示编码区，“C”代表推测的细胞质区域，T代表推测的跨膜区，而G代表在高尔基体腔内推测的转移酶的催化区。通过“TMpred”(来自EMBnet，瑞士)进行的该DNA序列的分析给出了一个位于Asn36和Gly54之间的推测跨膜区。该酶的C端区域可能含有该催化作用区域，因此应指向高尔基体腔内。据此，该转移酶似乎与迄今所分析过的所有参与糖蛋白生物合成的糖基转移酶(Joziasse，1992，糖生物学(Glycobiology)2，271-277)一样是II型跨膜蛋白质。灰色区域代表了4个胰蛋白酶消化的肽，六角形代表了潜在的N-糖基化位点。在通过NCBI可以进入的所有数据库中的BLASTP搜索显示了该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶和其它的α1，3/4-岩藻糖基转移酶例如人岩藻糖基转移酶VI之间的相似性。(通过SIM-LALN-VIEW，Expase，瑞士所测定的)18-21％的总相似性没有意义。然而，一个具有35个氨基酸的序列范围(SEQ ID NO4)表现出与其它α1，3/4-岩藻糖基转移酶惊人的高度同源性(图8)。该序列区域位于SEQ ID NO2的Glu267和Pro301之间。实施例5重组GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶在昆虫细胞中的表达用正向引物5’-CGGCGGATCCGCAATTGAATGATG-3’(SEQ ID NO16)和反向引物5’-CCGGCTGCAGTACCATTTAGCGCAT-3’(SEQ ID NO17)，通过Boehringer Mannheim的扩展高保真PCR系统，扩增包括细胞质区域和跨膜区域在内的该推测GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的编码区。用PstI和BamHI双消化该PCR产物，然后将其亚克隆在预先用PstI和BamHI消化并经碱性磷酸酶处理过的杆状病毒转移载体pVL1393中。为了确保同源重组，通过脂转染试剂，在IPL-41培养基中用Baculo Gold病毒DNA(PharMingen，Sand Diego，CA)和该转移载体一起共转染sf9昆虫细胞。27℃孵育5天后，采用不同体积的带有该重组病毒的上清液感染sf21昆虫细胞。在含有5％FCS的IPL-41培养基中27℃孵育4天后，收获该sf1细胞，并用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次。将细胞重悬在含有2％ TritonX-100的25mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中，并在冰上通过超声破碎。实施例6GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶活性的分析试验分析该匀浆物和细胞上清液中的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶。采用编码烟草GlcNAc-转移酶I的重组杆状病毒(Strasser等，1999，糖生物学，正在出版中)作为盲样。
图9显示所测量到的该重组GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶以及阴性对照的酶活性。该共转染细胞和它们的上清液中的该酶活性比阴性对照最多高30倍。在没有该重组转移酶时能够测量到的内源性活性基本来自昆虫的α1，6-岩藻糖基转移酶，仅有很低的百分数来自该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶。因此，该重组杆状病毒引起的该GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的增加远超过100倍。如果在2-(N-吗啉代)-乙磺酸-HCl缓冲液中测定活性，则该酶在pH 7.0左右表现出明显的最大活性。正如表2中显示的，二价阳离子的加入，尤其是Mn2+的加入增强了该重组转移酶的活性。表2添加物 相对活性(浓度10mM) (受体GnGn-肽)％无 21EDTA 18MnCl2100CaCl282MgCl252CdCl244CoCl235CuCl23NiCl224ZnCl20.6表3显示，在标准测试条件下，在采用的受体中，GnGn-肽表现出最高的掺入率，之后紧接是GnGnF6肽和M5Gn-Asn。未能发现向MM肽的转移，该MM肽在3-结合的甘露糖处不含有还原GlcNAc末端。该结构似乎是核心岩藻糖基转移酶所必需的。而且对于通常使用的受体，即能将岩藻糖转移到位于寡糖非还原末端的GlcNAc上的α，3/4-岩藻糖基转移酶为了测定血液组别而通常使用的受体，该重组转移酶是没有活性的。对于受体底物GnGn肽、GnGnF6肽、M5Gn-Asn，以及对于供体底物GDP-岩藻糖，所估测的表观Km值分别是0.19、0.13、0.23和0.11。这些分子的结构描述于
图10a和10b中。表3受体底物 相对活性 Km值％ mMGnGn肽100 0.19GnGnF6肽 87 0.13M5Gn-Asn 71 0.23MM-肽 0Galβ-4GlcNAc 0Galβ1-3GlcNAc0Ga1β1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc0实施例7岩藻糖基转移酶产物的质谱分析在存在非放射性GDP-L-岩藻糖(10nmol)、2-(N-吗啉代)-乙磺酸-HCl缓冲液、Triton X-100、MnCl2、GlcNAc和AMP的情况下，将DabsylatedGnGn六肽(2nmol)与含有该重组GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶(0.08mU)的昆虫细胞匀浆物一起孵育。采用盲样感染昆虫细胞的匀浆物作为阴性对照。将样品在37℃孵育16小时，并通过MALDI TOF质谱进行分析。在DYNAMO(Therrmo BioAnalysis，Santa Fe，NM)，即一种能够进行动态提取(dynamic extraction)(即时提取(late extraction)的同义词)的MALDI-TOF MS上，进行质谱分析。采用两种样品基质制备程序将肽和dabsylated糖蛋白溶解在5％的甲酸中，并将等分试样应用于该靶物质，空气干燥后用1％α-氰基-4-羟基桂酸覆盖。用水稀释吡啶基胺化的聚糖、还原的寡糖和非衍生化的糖蛋白，应用于该靶物质，并空气干燥。在加入2％ 2，5-二羟基苯甲酸后，立即通过真空干燥这些样品。
图11显示了这些样品的质谱。A是阴性对照主峰(S)显示了Dabsyl-Val-Gly-Glu-(GlcNAc4Man3)Asn-Arg-Thr底物，计算的[M+H]+值为2262.3。该底物还以通过该Dabsyl基团偶氮功能的片段化作用形成的钠加成产物和更小离子的形式出现在(S*)。一个小产物量(P，[M+H]+＝2408.4)是内源性α1，6-岩藻糖基转移酶的结果。m/z＝2424.0处的峰显示了该底物的不完全脱半乳糖基化。质谱B显示了带有重组α1，3-岩藻糖基转移酶的样品。主峰(P)代表了岩藻糖基化产物，(P*)为其片段化产生的离子。
此外，将这两个样品的等份试样彼此混合，以便获得相似浓度的底物和产物(样品A)。用含有10mU N-糖苷酶A的0.1M乙酸铵(pH 4.0)稀释该混合物(样品B)，或用含有100mU N-糖苷酶F(1U每分钟水解1mmol底物)的50mM Tris-HCl(pH 8.5)稀释该混合物(样品C)。2和20小时后，取小量的这些混合物并通过MALDI-TOF MS进行分析。
在
图12中，描述了样品A、B和C的三个质谱。未经消化的样品A显示了两个主峰2261.4m/z处的底物，和2407.7m/z处的岩藻糖基化产物。中间的曲线显示了用水解这两个糖肽的N-糖苷酶A处理过的样品B的质谱。963.32处的峰由脱糖基化的产物构成。更低的曲线显示了样品C的质谱。该N-糖苷酶F不能水解α1，3-岩藻糖基化底物，以致该质谱具有一个位于2406.7m/z处的岩藻糖基化产物峰，而经水解的底物的峰出现在963.08m/z处。实施例8吡啶基胺化的岩藻糖基转移酶产物的HPLC分析用N-糖苷酶A消化上述两个样品(岩藻糖基化产物和阴性对照)。获得的寡糖经吡啶基胺化后，利用反相HPLC进行分析(Wilson等，1998，糖生物学8，651-661；Kubelka等，1994，Arch.Biochem.Giophys.308，148-157；Hase等，1984，生物化学杂志，95，197-203)。
图13中，顶图B代表阴性对照，其中除了残余的底物(GnGn-肽)外，还可观察到α1，6-岩藻糖基化产物，A在一个实质上较短的保留时间内有一个峰，该峰是与GlcNAc-α1，3结合的还原岩藻糖所特有的。
在底图中，在N-乙酰-β氨基葡糖苷酶消化之前(曲线A)和之后(曲线B)分离的转移酶产物与MMF3蜜蜂磷脂酶A2(曲线C)进行了比较。
权利要求
1.DNA分子，其特征在于它含有一种根据SEQ ID NO 1的序列，该序列具有一个从第211位碱基对至第1740位碱基对的可读框；或一种与上述序列至少50％同源的序列；或一种在严紧条件下与上述序列杂交的序列；或含有一种由于遗传密码的原因与上述DNA序列简并的序列，其中该序列编码具有岩藻糖基转移酶活性的植物蛋白质，或是与之互补的序列。
2.根据权利要求1的DNA分子，其特征在于它编码具有GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶活性，尤其是核心-α1，3-岩藻糖基转移酶活性的蛋白质。
3.根据权利要求1或2的DNA分子，其特征在于它与根据SEQ ID NO1的序列至少70-80％，尤其优选至少95％同源。
4.根据权利要求1-3之任意一项的DNA分子，其特征在于它含有2150-2250个，尤其是2198个碱基对。
5.DNA分子，其特征在于它含有根据SEQ ID NO 3的序列；或含有与上述序列至少85％，尤其是至少95％同源的序列，或与上述序列在严紧条件下杂交的序列，或由于遗传密码的原因与上述DNA序列简并的序列。
6.DNA分子，其特征在于它含有根据权利要求1-5之任意一项的DNA分子的部分序列，并且具有20-200个，优选30-50个碱基对大小。
7.根据权利要求1-6之任意一项的DNA分子，其特征在于它与可检测的标记物质共价连接。
8.生物学上有功能的载体，其特征在于它含有根据权利要求1-7之任意一项的DNA分子，或它们的具有至少20个碱基对的长度不同的部分。
9.生物学上有功能的载体，其特征在于它含有方向与启动子相反的根据权利要求1-7之任意一项的DNA分子，或它们的长度不同的部分。
10.根据权利要求1-7之任意一项的DNA分子，其特征在于所述DNA序列含有缺失、插入和/或替代突变。
11.编码核酶的DNA分子，其特征在于它具有两个序列部分，每个部分各长至少10-15个碱基对，并与根据权利要求1-7之任意一项的DNA分子的序列部分相互补，以致所述核酶与天然GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶DNA分子转录的mRNA形成复合物并切割之。
12.生物学上有功能的载体，其特征在于它含有根据权利要求10或11的DNA分子。
13.制备含有根据权利要求1-5之任意一项的DNA分子的cDNA的方法，其特征在于从昆虫或植物细胞，尤其是从下胚轴细胞中分离RNA，并在加入逆转录酶和引物之后用所述RNA实现逆转录。
14.克隆GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的方法，其特征在于将根据权利要求1-5之任意一项的DNA分子克隆至载体中，随后转染至宿主细胞或宿主，通过选择和扩增转染的宿主细胞获得表达活性GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的细胞系。
15.分别制备其中GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全停止的重组宿主细胞，尤其是植物或昆虫细胞，或植物或昆虫的方法，其特征在于分别将至少一种根据权利要求8、9或12的载体插入至所述宿主细胞、或植物或昆虫中。
16.分别制备重组宿主细胞，尤其是植物或昆虫细胞，或植物或昆虫的方法，其特征在于将根据权利要求10的DNA分子分别插入所述宿主细胞、或植物或昆虫的基因组的非突变同源序列位置上。
17.重组植物或植物细胞，其特征在于它们是根据权利要求15或16的方法制备的，而且它们的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全停止。
18.重组昆虫或昆虫细胞，其特征在于它们是根据权利要求15或16的方法制备的，而且它们的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的产生受到抑制或完全停止。
19.PNA分子，其特征在于它含有与根据权利要求1-6之任意一项的DNA分子的序列互补的碱基序列和其部分序列。
20.PNA分子，其特征在于它含有与根据权利要求1-6之任意一项的DNA分子的序列相应的碱基序列和其部分序列。
21.分别制备在转录或翻译水平上阻断了GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶表达的植物或昆虫、或细胞尤其是植物或昆虫细胞的方法，其特征在于将根据权利要求19或20的PNA分子插入细胞中。
22.制备重组糖蛋白的方法，其特征在于用表达该糖蛋白的基因分别转染根据权利要求17或18的系统，或根据权利要求21的方法制备的植物或昆虫、或细胞，以致该重组糖蛋白被表达。
23.制备重组人糖蛋白的方法，其特征在于用表达该糖蛋白的基因分别转染根据权利要求17或18的系统，或根据权利要求21的方法制备的植物或昆虫、或细胞，以致该重组糖蛋白被表达。
24.制备医用重组人糖蛋白的方法，其特征在于用表达该糖蛋白的基因分别转染根据权利要求17或18的系统，或根据权利要求21的方法制备的植物或昆虫、或细胞，以致该重组糖蛋白被表达。
25.重组糖蛋白，其特征在于它们是根据权利要求22的方法在植物或昆虫系统中制备的，并且它们的肽序列含有在岩藻糖转移酶未降低的植物或昆虫系统中表达的蛋白质所具有的α1，3-结合岩藻糖残基的不到50％，尤其是不到20％，尤其优选0％。
26.重组人糖蛋白，其特征在于它们是根据权利要求23的方法在植物或昆虫系统中制备的，并且它们的肽序列含有在岩藻糖转移酶未降低的植物或昆虫系统中表达的蛋白质所具有的α1，3-结合岩藻糖残基的不到50％，尤其是不到20％，尤其优选0％。
27.医用重组人糖蛋白，其特征在于它们是根据权利要求24的方法在植物或昆虫系统中制备的，并且它们的肽序列含有在岩藻糖转移酶未降低的植物或昆虫系统中表达的蛋白质所具有的α1，3-结合岩藻糖残基的不到50％，尤其是不到20％，尤其优选0％。
28.药物组合物，其特征在于它含有根据权利要求25-27之任意一项的重组糖蛋白。
29.筛选样品中编码GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的DNA分子的方法，其特征在于将根据权利要求7的DNA分子加入所述样品中，该分子可以与编码GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的DNA分子结合。
30.根据权利要求29的方法，其特征在于所述样品含有植物或昆虫生物的基因组DNA。
31.编码GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的DNA分子，其特征在于它们是根据权利要求29或30的方法选择并随后从样品中分离出来的。
32.根据权利要求14的方法克隆的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶的制品，其特征在于它具有pI值在6.0-9.0之间，尤其是6.8-8.2之间的同工型。
33.根据权利要求32的制品，其特征在于它具有pI值为6.8、7.1和7.6的同工型。
34.制备人类和其它脊椎动物糖蛋白的植物化碳水化合物单位的方法，其特征在于向分别含有碳水化合物单位或糖蛋白的样品中，加入岩藻糖单位和根据权利要求1-7之任意一项的DNA分子所编码的GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶，以便通过所述GlcNAc-α1，3-岩藻糖基转移酶使岩藻糖分别与所述碳水化合物单位或所述糖蛋白在α1，3-位结合。
全文摘要
本发明提供如下DNA分子,该DNA分子含有根据SEQ ID NO:1的、具有从第211位碱基对至第1740位碱基对的可读框的序列,或与上述序列有至少50%同源性的序列,或与上述序列在严紧条件下杂交的序列,或一种由于遗传密码的原因与上述DNA序列筒并的序列,而且该序列编码具有岩藻糖基转移酶活性的植物蛋白,或是它的互补序列。
文档编号A01K67/033GK1360633SQ00805192
公开日2002年7月24日 申请日期2000年2月17日 优先权日1999年2月18日
发明者弗里德里希·阿尔特曼 申请人:弗里德里希·阿尔特曼