专利名称：一种快速棉花转基因的方法
技术领域：
本发明属于新植物技术领域，具体涉及棉花转基因育种技术领域。
目前棉花的遗传转化技术主要有以下几类方法一是利用根癌农杆菌介导棉花的下胚轴(1987，Umbek，et al)，二是利用花粉管通道法(1981黄骏麒等)转化棉花，三是基因枪轰击愈伤组织转化棉花(1990，Finer，et al)。利用根癌农杆菌介导棉花下胚轴主要存在的问题有一是从下胚轴到植株再生需要的时间较长，一般要8个月以上，二是利用农杆菌侵染下胚轴，会影响愈伤的获得，同时获得的转化块也较少。利用花粉管通道法转化棉花则存在转化频率低重复性不好，并且转化体也有限。利用基因枪轰击愈伤组织则嵌合体较多，且转化的外源基因多拷贝居多易导致基因沉默，遗传稳定性差，而且实验成本高。
本发明的目的在于克服已有技术的不足，利用根癌农杆菌介导胚性愈伤转化棉花，既结合了农杆菌转化的优点，又克服了周期长，转化体少的缺点，因而可以提高棉花转基因育种的效率。本发明通过以下技术方案实现棉花转基因的方法，利用组织培养诱导棉花下胚轴获得愈伤组织，经继代培养得到胚性愈伤组织，以所得到的胚性愈伤组织作为根癌农杆菌感染受体，通过选择培养基筛选获得抗性愈伤，然后再生植株，经分子检测，获得抗衰老转基因棉花。
所述的农杆菌和胚性愈伤组织的共培养温度为16-26℃。
利用0.01％的HgCl2对农杆菌感染的胚性愈伤组织处理5-10min，可一次性脱除农杆菌，而胚性愈伤组织的生长不会受到影响。
附图及其说明附
图1，是本发明的愈伤组织生长状态图；附图2，是本发明的转基因愈伤PCR检测结果；图中，1Marker(GenrulerTM 100BP DNAladder)；2～11转化愈伤克隆；12阴性对照；13质粒附图3，是本发明的转基因材料Southern杂交结果，图中DNA经Xab I酶切，以SAG12基因-扩增片段560bp作标记探针。泳道1Mark(λDNA/HindIII)；2阴性对照；3阳性对照；4～7转化植株以下结合说明书及附图对本发明作进一步描述1、农杆菌活化菌株经菌落筛选后，在LB液体培养基活化12小时，然后接种LB固体培养基上，在28℃暗培养两天，然后将其刮入加有20mg/L的乙酰丁香酮(AS)MGL(每升含5g胰化蛋白胨，5gNaCl，0.1gMgSO4.7H2O，0.25g KH2PO4，5g甘露醇，1.16g甘氨酸钠)培养基中，240rpm振荡培养2小时，用MSB液体培养基稀释到含菌量为108～1010个/L左右.(OD600＝0.4～0.8)2、取活性高的胚性愈伤，放入制备好的农杆菌悬浮菌液，浸泡5-10min，同时抽真空一次，过程中摇动瓶子数次，倒干菌液，用灭菌吸水纸吸干表面，然后接入共培养基中，置于16-26℃，暗培养两天，此时在培养基接触外植体的部分可见少量菌液。
3、抗性材料的筛选将共培养处理的愈伤附加500mg/L头孢霉素(或利用氯化汞脱菌，见后)和50mg/L的卡那霉素选择培养基上，继代2-3次；之后将卡那霉素抗性愈伤继代和悬浮培养。
4、植株再生，将胚状体转移入分化培养基，再生成苗后将再生苗移入成苗培养基中。
5、转基因苗的鉴定及转基因植株的获得先用卡拉霉素2％的溶液涂抹新生叶片作初步筛选，再作PCR检测，最后进行Southern分析。
利用上述方法本发明已成功地获得抗衰老转基因棉花Coker201(ipt)，鄂抗3号(ipt)和YZ1(ipt)。其中YZ1为一种超鸡脚叶陆地棉品系。
本发明的效果1、利用胚性愈伤组织作为感染受体能够大幅度提高棉花转化效率，是其他方法所不能比拟的。
2、转化的周期大大缩短，通常情况下获得转基因植株需要一年或更长时间，本发明可在6个月内获得转基因植株，转化体可大幅度增加。这样能够把T-DNA插入转化变为现实，从而能够创造大量的插入突变体为功能基因组的研究准备了技术平台。
3、利用根癌农杆菌介导胚性愈伤在半年内能够得到上千个转化体，在同样的工作量下，比介导下胚轴在一年内拿到的转化体效率高200倍左右，比基因枪法和花粉管介导法要高400倍左右。
4、利用低浓度HgCl2处理，可一次性脱除农杆菌，而胚性愈伤仍能恢复生长，这不但解决了其他抗生素多次抑制农杆菌的生长导致影响愈伤组织的后期分化，而且也节省了昂贵的抗生素，具有一定的经济价值。
利用根癌农杆菌介导胚性愈伤组织转化异戊烯基转移酶基因棉花。利用此方法把异戊烯基转移酶基因转入受体棉花Coker201、鄂抗3号和YZ1品种，获得转基因再生植株，具体步骤如下1转化受体状态的选择愈伤组织的生理状态对于高效转化非常重要。总的来说，分生组织及伴有活跃细胞分裂的外植体对农杆菌的侵染最敏感，即生长和分裂旺盛的细胞是接受外源DNA的感受态。愈伤组织日生长量一定程度上可反应细胞的分裂速度。选择生长较一致的自然分散、颜色鲜黄的胚性愈伤组织0.3g转入D1分化培养基中，共设5个处理，每一处理设3次重复，隔3天称1个处理的愈伤鲜重，愈伤生长速度(g/d)＝(愈伤生长量-愈伤初始量)/生长天数。
当继代12天时，愈伤生长速度最快(
图1)。因此继代10～12天的处于活跃分裂状态的颗粒状、淡黄色、疏松愈伤组织是转化的良好受体。试验结果也证明，继代10天的愈伤转化效率(80.3％)比20天的转化效率(62.8％)高。2菌液浓度对转化率的影响就瞬时表达效果来看，菌液浓度越高其转化效率也越高，但是菌液浓度过高在培养过程中农杆菌较难抑制，容易再度污染愈伤(表1)，而且农杆菌浓度过高容易产生大量的有毒物质而导致受体细胞的死亡，因此并不是农杆菌菌液浓度越高，则抗性愈伤率越高。实验结果(表1)也表明0.3～0.5O.D.浓度的菌液侵染愈伤组织能获得较高的抗性愈伤率(见表1所示)。
表1 菌液浓度对抗性愈伤率的影响Table 1 The effect of Agrobacterium concentrationon frequeucy of resistant-callus菌液浓度 处理 污染 抗性 抗性愈伤 共培养后瞬时(OD值) 愈伤块数 愈伤块数 愈伤块数 率(％)表达效果0.1 801 13 16.25低0.3 150 5 117 78.00高0.5 170 18136 80 高1.0 906915 16.67100％1.5 110 8319 17.27100％注污染愈伤块数指农杆菌没抑制住而再度污染愈伤组织3抗性愈伤组织的筛选共培养后，采用HgCl2处理，可以彻底消除农杆菌，从而避免了使用抗生素脱菌，见表3所示。利用HgCl2代替昂贵的头孢霉素或羧苄青霉素是可行的，并且脱菌干净，以后很少再返菌，是一种较好的脱菌剂。
表2 利用HgCl2脱菌及愈伤的恢复 抗性愈伤组织的选择是整个转化实验的关键之一，有效的筛选不但可以减少转化体的丢失，而且可以大大减轻后期分子检测时的工作量。
将愈伤组织转移到选择培养基上，每三周继代一次。愈伤组织刚转移到选择培养基上时，大多数愈伤都有点变褐，但发褐的愈伤中嵌合着少量淡黄的愈伤。因此第一轮选择一般不淘汰。在第二轮选择时，淘汰完全褐化的愈伤块。并将繁殖的克隆进行第三轮选择后，进行液体选择15天(Km为100mg/L)。在悬浮培养时每个细胞都与选择培养基中的高浓度Km充分接触，这样可以严格淘汰嵌合体。
因此前几轮筛选不宜过严。待转化愈伤繁殖成克隆时进行严格筛选后就可不加选择压，这样有利于胚状体分化成苗。4抗性愈伤组织DNA的分子检测结果图2是用启动子SAG12特异引物扩增的结果。从图可以看出，未转化对照没有扩增带，而10个转化克隆和质粒均扩增出一条大小约560bp的特异带，说明外源SAG12基因已经整合进细胞的基因组中。Southern的结果(图3)进一步证明了PCR分析的结论，4个克隆愈伤组织和质粒均有阳性信号出现，而对照没有。
权利要求
1.一种棉花转基因的方法，利用组织培养诱导棉花下胚轴获得愈伤组织，经继代培养得到胚性愈伤组织，其特征在于，利用所得到的胚性愈伤组织作为农杆菌感染受体，通过选择培养基筛选获得抗性愈伤，然后再生植株，经分子检测，获得抗衰老转基因棉花。
2.据权利要求1所述的棉花转基因的方法，其特征在于，农杆菌和胚性愈伤组织的共培养温度为16-26℃。
3.据权利要求1所述的棉花转基因的方法，其特征在于，利用0.01％的HgCl2对农杆菌感染的胚性愈伤组织处理5-10min，可一次性脱除农杆菌，而胚性愈伤组织的生长不会受到影响。
全文摘要
本发明属于棉花转基因育种技术领域。其特征是，利用组织培养诱导棉花下胚轴获得愈伤组织，经继代培养得到胚性愈伤组织，以所得到的胚性愈伤组织作为农杆菌感染受体，通过选择培养基筛选获得抗性愈伤，然后再生植株，经分子检测，获得抗衰老转基因棉花。与已有技术相比，本发明能够大幅度提高棉花转化效率，转化的周期大大缩短，可在6个月内获得转基因植株，转化体可大幅度增加。已成功获得抗衰老转基因(ipt)棉花Coker201(ipt)、鄂抗3号(ipt)和YZ
文档编号A01H4/00GK1404723SQ0113108
公开日2003年3月26日 申请日期2001年9月20日 优先权日2001年9月20日
发明者张献龙, 聂以春, 陈妹幼, 吴家和 申请人:华中农业大学