专利名称：用于处理土壤的微生物以及获得它们的方法
技术领域：
本发明涉及适于处理土壤、含有活的微生物的产品，所述微生物可在不同的气候和自然环境下繁殖，本发明还涉及用于生产该产品的方法，以及使用该产品处理土壤和植物的方法。
具体而言，本发明涉及一种从下列任何一种微生物，或其混合物制备所述产品的方法。
此外，本发明涉及一种生产所用微生物的培养物的方法。本发明的主题还有微生物本身。
更具体而言，本发明涉及一种使用一种产品处理土壤和植物的方法，该产品含有微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001291)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001301/-中的至少一种，此外，含有所列微生物的产品可在所讨论的植物环境中繁殖并生存，本发明还涉及它们的生产方法。
背景技术：
在自然环境下，土壤的天然培养基是植物和微生物的自我调节生态系统，前者的存在可决定后者的存在。当在进化过程中发展起来的平衡被人类活动(深度耕田，自然和人工施肥，使用植物-保护剂等)所改变时，其结构和功能发生不可预知的变化。在不同的土壤上和不同的气候环境下，对于优化培养给定的植物时所需的微生物群的生长而言，选择时间要持续很多年。然而，可在土壤中运送有利微生物群的决定性微生物，而且优化培养所需的环境可在1-2天内建立。这样做的结果是产率更高，不会有害地打乱自然生态系统。存在于从经济角度看较为重要的已知植物环境中的有益且占优势的微生物可通过实验室实验测定，并且可利用工业方法单独繁殖它们，并以适当的比例将它们放回到土壤中。
在土壤和微生物的生态系统中可发现重要的规律性。微生物数不同，不同的物种可在活植物的根系(rhysosphere)和发芽种子(spermatosphere)的近环境中，而不是距离它们更远的环境中确定。细菌在根环境中的繁殖受到多种因素的影响。这些因素取决于区域，土壤的质量，微生物群的组成，和气候环境。
在土壤中发现的碳源首先并且绝大多数是利用太阳能，通过光合作用形成的。
氮循环比碳循环更加复杂。在氮转化时，由生物和化学过程发挥作用。在大自然中，以被称作惰性环境的气态氮为主，固定氮(硝酸盐，亚硝酸盐，氨)则以有限的量存在。
对于氮气的矿化而言，首先涉及生物氮的结合。因为1公顷有6-7×108吨的分子氮，因此这是用于氮结合的无尽来源。专家的目标在于结合氮的生物，即可将分子氮还原成氨的活的生物，其中，有关这些微生物的知识和它们性质的适当利用可确保以利于环境的方式，结束全世界的饥荒。
某些氮结合细菌可以自由生活的方式将氮固定，而有些细菌则只能通过与其它高级植物结合而将氮固定。
与氮循环相反，事实上磷循环在自然环境中是闭式的。输入和输出相等，流失很少，而且磷不会污染空气。最后，这种元素可在水，海水中积聚，而且只有少量(例如，以鸟粪形式)回到陆地。
在土壤的活细胞中，磷以有机化合物的形式积聚，它们的矿化快速(3-8g/m2/年)发生。现有含磷化合物的溶解性，即它们进入植物的可能性有所不同，在平均每1kg的土壤中，只能检测到400-1200mg磷中的5％。某些磷化合物的循环周期是500-2000年。
通过将某些分解磷的微生物运送到土壤中，可将某些不能进入植物中的复合磷化合物引入到溶液中。如果引入到土壤中的微生物“发挥作用”，那么土壤的矿物质含量则会令人满意，从而使得含磷酸盐肥料的使用不再是必需的或可显著减少使用量。
对于生长而言，植物，特别是在农作物成熟时，需要大量的钾。植物种植者通过在肥料中加入含钾的物质而将钾引入到土壤中。这种肥料可利用释放钾离子的微生物从钾矿物质获得。
就植物而言，在土壤中繁殖的微生物可生物合成生理上的活性化合物，它们之中，最重要的化合物是植物激素，植物生长素(吲哚-3-醋酸)，乙烯，赤霉素，激动素等。某些假单胞菌可在有微量铁存在时，产生所谓的铁载体，它们可收集铁。因此，其它致植物病的细菌和真菌因为不能从铁载体利用铁，导致由于缺少铁而受到抑制，另一方面，在缺少铁的土壤中，这些铁载体可明显刺激植物的生长，这是因为通过结合铁，它们可直接为植物提供铁。
对于上述解决方法而言，已经详细描述过若干技术版本；在具体的文献中详细描述了多种微生物。
匈牙利发明者公开了粉末状硝化培养物(匈牙利专利HU143.391)，褐球固氮菌和苜蓿中华根瘤菌培养物(匈牙利专利HU188.434)，藻类培养物(匈牙利专利HU195.068)和褐球固氮菌培养物的制品，以及巨大芽孢杆菌微生物(匈牙利专利HU207.751)的制品。褐球固氮菌已经保藏，保藏号为No.00238，巨大芽孢杆菌的保藏号为No.NCAIM/P/B1140。更具体而言，在匈牙利专利HU188.434和HU207.751中，作者描述了发酵培养上述保藏微生物的混合物。按照匈牙利专利HU213 163，作者使用羧甲基纤维素完成了对HU207.751微生物的培养。在HU1671/96中，匈牙利发明者描述了含有生脂固氮螺菌，维涅兰德固氮菌，荧光假单胞菌和巨大芽孢杆菌微生物的培养物。
在上述方法中所用微生物的应用和作用会受到下列事实的限制，即在不同的培养环境下，在不同组成的土壤中，在不同的气候环境下，它们只能存活较短的时间，各种植物的环境和根系不总能创造最佳的条件。
发明详述本发明的基本目的是这种土壤微生物培养物的制品，从植物培养和经济的观点看，它可起有利的作用，且同时，可在不同土壤中和不同植物上，在不同的气候和培养环境下存活，繁殖并发挥它们的有利作用。
人们吃惊地发现，实验室培养的微生物的繁殖和存活取决于植物即时环境中的土壤特性，温度条件和植物，所述微生物可有利地影响植物的生长，将氮固定，使磷酸盐转移，刺激植物生长，改善土壤结构。不同的微生物可在ciernozjom土壤，腐殖质含量较低的土壤，黄土，田野或例如粘土环境中发挥它们的作用。在我们的实验过程中已经证实，然而令人吃惊的是，其它微生物可在各种植物的根系中，或接近它繁殖，并长时间在那里发挥它们的作用。
因此，进行实验分离这种微生物，它可在从经济观点看较为重要的给定植物的环境中发挥有利的作用，直到培养它。此外，进行实验分离可使钾离子转移的微生物，并制备从土壤中分离并通过突变方法在实验室中改变的这种微生物，它可在引入到土壤中时，在低温下繁殖，然而甚至令专家吃惊的是，它还可发挥它们的作用。
此外，我们已经在实验过程中说明，从农业的观点看，某些产生多糖的微生物可以令人惊奇的方式有利改变土壤结构，由此提高抗旱性。
通过总结我们的实验工作，我们的目的是分离这样的微生物，它可运送氮、磷、钾给植物，生物合成植物生长激素，生物合成可改善土壤结构的多糖，而且能够在播种期和气候比较寒冷的国家繁殖，并在不同的土壤和植物中发挥它们的作用。此外，我们的目的在于生产这种制品，在植物环境中，在根系中，或直接在植物细胞之间，它的微生物内含物通过使重要的元素固定和转移，并通过在已知植物环境中产生植物生长因子和多糖，而促进已知植物或植物家族的生长，因此我们可节省肥料的使用，从而保护环境。
本发明的主题是所列微生物的生长过程，含有它们的制品，以及含微生物制品的应用以及所述具体微生物。
本发明是以制造目标制品的认识为基础的，微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B001302/和白色链霉菌变种0003LP(NCAIM/P/B001301/是最适宜的，它们可在播种期的低温下繁殖，为植物提供氮，使磷、钾、生物合成生长激素和多糖转移，因此我们分离它们并详细描述它们的生长过程。
根据上述内容，1998-1999之间，我们在欧洲从土壤和某些植物的根环境中分离出了微生物，并在体外测试了它们固定氮、使磷和钾溶解、产生多糖并生物合成植物激素的能力，从分类学上鉴定了所选择的微生物，通过突变处理制备了这种变体，所述变体可在低于20℃的温度下密集繁殖，详细描述了用于培养它们的生长技术，并从它们的培养物制造出制品，证实了它们对植物生长和温室产率以及野外实验的作用。
分离固氮螺菌，固氮菌，慢生根瘤菌，假单胞菌，芽孢杆菌，链霉菌和微球菌物种及其亚种。
知之甚少的固氮螺菌物种是革兰氏阴性可变染色的细菌，它们生活在土壤中，在微量需氧(存在1-2％氧)的环境下，与植物的根系紧密相关，可将空气中的氮气还原成氨，然后将它运送给植物。某些种类还可生物合成植物激素。
固氮螺菌是从生长在欧洲不同耕地上、各种土壤和草田中的玉米，小麦，大麦，黑麦的根部环境分离的。将来源于土壤样品的细菌混悬液分散在随后给出组成的Nfb(II)和MM培养基中，然后在微量需氧的条件下培养。72小时后，鉴定固氮螺菌培养物。固氮螺菌培养物与其它较小的细菌和真菌培养物不同，大小达到约3mm。
当在随后给出组成的液体MM和Nb(II)软琼脂培养基中呈指数生长时，固氮螺菌物种的培养物显示出固氮螺菌细胞的形态学特征。细胞是vibroid和S-形的，大小为1-2×2-4μm。它们的增加需要生物素。在显微镜下观察，它们可迅速移动。它们的移动性可归因于它们的极性鞭毛。在它们的细胞中，聚集聚-β-羟基-丁酸盐颗粒，和胡萝卜素。微红的变色可由培养物老化解释。为了使它们增加，可使用有机酸，如苹果酸，乳酸，丙酮酸和丁二酸。空气中氮的固定在微量需氧的环境下进行。在极端环境下，如干燥，低或高pH值，缺少氮源或碳源时，细胞转化为胞囊，胞囊上没有鞭毛，但含有聚-β-羟基-丁酸盐颗粒，且四周围绕着荚膜多糖。微生物利用碳源的谱根据物种而有所不同无乳固氮螺菌葡萄糖+蔗糖+肌醇+巴西固氮螺菌葡萄糖+蔗糖和肌醇-，伊拉克固氮螺菌利用葡萄糖(+)和蔗糖(+)，但不用肌醇(-)，最后，生脂固氮螺菌仅用葡萄糖。在无氮培养基中，碳源利用谱有更大程度的不同，从而可将上述四种物种区别开来。我们分离的微生物的碳源利用谱部分不同于ATCC 29.731生脂固氮螺菌，无乳固氮螺菌，巴西固氮螺菌和伊拉克固氮螺菌的新型(Holt，J.G.及合作者，Bergeys Manual of Determinative Bacteriology，第9版，1994)。与类型相反，它们在含有3.5％氯化钠的软琼脂中(这将在后面描述)适当增加，它们在不同培养时期的显微照片也有所不同，它们在马铃薯提取物琼脂中产生的颜色更强烈。
某些分离的固氮螺菌与生脂固氮螺菌，无乳固氮螺菌，巴西固氮螺菌以及伊拉克固氮螺菌接近，我们进一步对它们进行实验，选择其中一种巴西固氮螺菌。
上述土壤样品中的固氮菌微生物是利用选择培养在Nfb(II)软琼脂上分离，然后通过分散在MM和Fjodorov培养基上分离的，并根据其固定氮的能力选择一个亚种，贮存进行进一步的实验。它们的细胞是多态性、球菌样的。在有氧存在的条件下，它们迅速移动。它们是革兰氏阴性菌。它们在没有氮的培养基上产生黄绿色的荧光，它们可适当利用rhamnoze和mezo-肌醇。
众所周知，根瘤菌在papilionaceae的根上形成根瘤，然后在植物细胞中获得，它们直接把固定氮运送给植物。不同的papilionaceae中进入不同的根瘤菌，例如大豆中进入慢生根瘤菌。因为这种根瘤菌是独有的，它在收割庄稼后死亡，即，它不会大量存留在土壤中，因此建议使用它处理土壤。7月13日，我们从靠近Szeged-Kiskundorozsma的Subasa的大豆种植园分离出了根瘤菌。从在黄土中生长的植物中，选择生长较好的植物，从其根部分离生长较好的根瘤。保藏按照实施例分离的微生物的嗜冷变体。
在我们收集的土壤样品中，我们寻找使磷酸盐转移的微生物，并从分类学的角度试验所选择的微生物。经证实，其中一部分微生物是假单胞菌，另一部分是芽孢杆菌物种。
假单胞菌是革兰氏阴性、细棒形式的需氧细胞，它们在绝大多数培养基上产生荧光色素，它们是腐生物。没有观察到胡萝卜素的产生，它们不能在高于40℃的温度生长。在胶状琼脂上见到液化。假单胞菌利用葡萄糖，而不用淀粉。虽然荧光假单胞菌的变体在分类学上紧密关联，但在我们的微生物和类型组之间可以观察到某些分类学异源性我们的微生物假单胞菌的特征在于适当地利用葡萄糖，半乳糖，醋酸，麦芽糖，甘油，和丙酮酸。它不利用果糖，D-阿拉伯糖，麦芽糖，乳糖，淀粉和菊粉。然而与类型相反，它们能够在木糖，蔗糖上生长，且在一定程度上，可在山梨糖醇上生长。作为独有的碳源，它们可利用甘氨酸。
以上述为基础，我们将其中一种微生物鉴定为荧光假单胞菌，并发现它近似属于生物变种III组的变体。我们称该组为荧光假单胞菌。
以分类学特征为基础，在可溶解不溶性磷酸盐的芽孢杆菌中，经证实一些是多粘芽孢杆菌，一些是巨大芽孢杆菌。选择其中一些组进行进一步的实验。
为了分离能够使钾离子转移的微生物，从含钾的矿物质，长石，白云母表面分离微生物，然后按照实施例，在固体、没有钾的培养基上进行试验，证实钾的转移。使用实施例给出的过程，利用突变处理，生产并保藏被鉴定为Streptomyces psychrophilic的微生物。
我们分离出这种微生物，在分类学，形态学及核糖体DNS试验后，经证实为玫瑰色微球菌，它在植物试验中显示特别有利的作用。保藏这种微生物的其中一组，这组已经在实验室中被转化。
本发明还是以下列事实为基础的，即种植在土壤中的有利作用的微生物可尽可能快地，在种子和植物最初发育的时候，在秋季和早春的气候条件下，在气候较寒冷的国家繁殖。因此，按照实施例4处理、分离并维持该微生物。通过已知的过程，分离在低温时增加的突变体和变体，然后保藏在国立农业和工业微生物和细胞保藏中心。
本发明涉及这种制品及其生产方法，通过施用它们可增加植物培养物的产率。所述生产还伴有培养分离的微生物，并在不同的耕地、不同的植物环境中测试它们，这些微生物可长时间存在于已知植物家族的环境中，可在低温和各种土壤中繁殖，并将含有培养物的制品引入到相关植物、种子上，或它们的耕地中。根据本发明，所述制品可用于处理土壤、植物或植物的种子，它含有下列微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B0012../和白色链霉菌变种0003LP(NCAIM/P/B0012../中的至少一种。
处理的结果是促进了植物的发育，而且它们更耐病原体，可为土壤结构和植物提供更多水分，甚至在减少肥料或根本不使用任何肥料的情况下也可提供较高的产率。
本发明方法其中一个最重要的优点是其实施，在植物培养过程中，以氮-，磷-和钾-为基础的肥料的施用不再是必需的，或可大量减少。肥料对环境的污染作用很明显。在微生物细胞中生物合成、促进植物发育的化合物可加速已处理植物的发育，根的发育，同时增加供给植物的水分，而所施用的微生物可抑制致植物病微生物的发育，在某些微生物细胞中生物合成的多糖可改善土壤结构，平衡水分，对土壤寿命特别有利。与已知制品和相同目的及应用的制备方法相反，本发明的制品的制备和应用是以从各种土壤中分离出来、具有不同作用的各种微生物的使用为基础的，这些微生物可对已知在经济上较为重要的栽培植物发挥特殊作用，而且它们可在秋天和早春的低温下，以及气候寒冷的地区繁殖。
本发明的微生物还可在这种培养基上培养，即所述培养基含有葡萄糖，淀粉，蔗糖，或糖蜜作为碳源，玉米浆，酪蛋白，酵母提取物或铵盐作为氮源，以及其它无机盐和能够离解微量元素离子的盐，但是，因为这对于专家而言是显而易见的，因此可使用任何可同化的碳源和氮源，无机盐，只要它们能使本发明的细菌繁殖。
可在培养基中将含有本发明的微生物的培养物直接加入到所要处理的土壤或植物中用于培养，但是在保持微生物的生物有效性的制品之中，还可制备含有载体的制品，该载体可利用粘附力将细菌固定在种子中。引入到土壤中的细菌量为每公顷5×1011-5×1015个细胞，优选的细胞量为1012-1013。
根据布达佩斯条约，我们将从各种植物环境分离鉴定、并且可在低温下繁殖的微生物保藏在国立农业和工业微生物和细胞保藏中心，它们登记的保藏号是巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，
大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B001302/白色链霉菌变种0003LP(NCAIM/P/B001301/。
保护范围还扩展至保藏的物种及其人工和天然突变体，变体或以任何已知方式获得的上述微生物系。
下面，我们用实施例举例说明，但这些实施例不是对保护范围的限制。
除非另有说明，实施例中的百分比是重量百分比。
发明的最佳实施方式实施例1从各种土壤和各种植物环境分离可固定空气中氮的微生物并证实它们固定氮的能力固氮螺菌物种是革兰氏阴性可变染色的细菌，它能够在微量需氧(有1-2％的氧)的环境下，将空气中的氮还原成氨，并将它们用于植物中。
从各种土壤样品(腐殖土，黄土，钠质土，褐色及黑色的土等)，各种植物(谷类，向日葵，玉米，草等)的根环境中分离固氮螺菌。化学吸引剂，如有机酸和糖可利用趋化性吸引固氮螺菌。在它们鞭毛的帮助下，细菌向根部移动，到达那里，并在那里集群。
使用无菌蒸馏水将给定土壤样品稀释10-，100-，1,000-和10,000-倍，然后将100-100μl混悬液在含有MM和Nfb(II)软琼脂的陪体氏培养皿上扩散。MM培养基的组成如下K2HPO41.65g/lKH2PO40.87g/lMgSO4×7H2O 0.29g/lNaCl0.18g/lCaCl2×2H2O 0.07g/lFeCl3×6H2O 0.01g/lNaMoO4×2H2O 0.005g/lMnSO4×H2O 0.00014g/lZnSO4×7H2O 0.007g/lCuSO4×5H2O 0.000125g/l
CoSO4×7H2O0.00014g/lH3BO30.00003g/l葡萄糖5.0g/l蔗糖 5.0g/lBacto琼脂 20.0g/l葡萄糖是使用高压灭菌器，与MM培养基的其它成分分开灭菌的(121℃，30分钟)，然后在冷却至60℃后再与其它成分混合。使用无菌的1N NaOH溶液将无菌培养基调节至pH7.4。
Nfb(II)培养基的组成如下L-苹果酸 5.0g磷酸氢二钾 0.5g硫酸镁×7水 0.2g氯化钠 0.1g氯化钙 0.02g微量元素溶液*2.0ml溴麝香草蓝(溶解在0.2N KOH中的物质的0.5％水溶液)2.0mlFe-EDTA的1.564％的溶液 4.0ml维生素溶液**1.0ml琼脂 1.75g使用1N KOH水溶液调节培养基至pH6.8。
*微量元素溶液的组成如下硫酸亚铁II×7H2O200mg氯化铁III×6H2O 10mg硫酸镁×H2O 1mg硫酸铜×5H2O2mgNaMoO4×2H2O 1mg氯化钴×6H2O2mg硫酸锌×7H2O2mg四硼酸钠×10H2O 1mgP2O5×24WO3×H2O0.5mg
硝酸铋×5H2O 0.1mg氯化锡 0.01mg氯化硒 0.01mg碘化钾 1mg柠檬酸 100mg蒸馏水 1000ml**维生素溶液的组成如下维生素C 50mg维生素B15mg维生素E 2mg维生素A 2mg生物素 4mg蒸馏水 100ml。
将引入到培养基中、在MM平板上找到的细菌放在厌氧菌恒温箱中，把恒温箱气腔中交换为氮气，然后利用令人满意量的空气回流将氧气浓度定为1.6％。32℃温育平板，72小时后，鉴定固氮螺菌。与稀释线相应，在使用10倍稀释的混悬液扩散的平板上，生长出了连续的细菌区域，而10,000倍稀释的混悬液通常生长出30-50个培养物。固氮螺菌培养物与其它较小的细菌和真菌培养物不同，其大小可达到约3mm。培养物中，有若干种在形态学上与固氮螺菌培养物相似。我们将进一步研究它们之中的一些。
在上述培养基中和上述培养环境下，将Nfb(II)软琼脂培养物放在需氧菌恒温箱中，首先，从特征形态学方面观察到固氮螺菌繁殖。
从MM和Nfb(II)培养基获得的各种固氮螺菌是按照微生物学实践生长的，以这种方式，将原代细菌培养物在完全Tag培养基中的一种培养物上扩散两次。固氮螺菌是通过在液体Tag培养基中的一种培养物上扩散两次而纯化的，并贮存在培养物中。将-80℃的细菌混悬液作为培养物，所有实验都从该培养物开始。
Tag培养基的组成如下Bacto胰蛋白胨(Difco) 1.0％酵母提取物(Difco) 0.1％
NaCl 0.5％琼脂 2.5％灭菌后，加入下列终浓度的化合物水溶液0.1％ 0.1M CaCl2×6H2O0.1％ 0.1M MgCl2×6H2O0.2％ 葡萄糖(单独灭菌)灭菌后，将培养基调节至pH7.0-7.2。
在根的集群可通过简单的实验来检测。根据显微镜计数可知，与对照组相比，可在播种于贫瘠珍珠岩(15cm直径的盆)中、细胞数相等(每盆1×1010个细胞)、且用固氮螺菌处理过的玉米和小麦的根上，检测到明显更多的固氮螺菌细胞。根集群可按照特殊的识别机理进行。在定居过程中，固氮螺菌细胞穿透根基质中，在根基质中，它们通过固定活性氮可满足主要植物所需的一部分氮(结合氮固定)。这是由实验室实验过程中，接种了固氮螺菌的玉米和小麦的绿色物质生长得更高而证实的，其结果在后面详细描述。固氮螺菌还可产生植物激素和促进生长的物质。这些物质的出现和它们对主要植物的有利作用可由在不同实验环境下进行的实验中，发芽率的增加和植物生长越来越密集来表现。
分离的固氮螺菌物种的形态学特征可在下面的一般性描述部分中找到。
在Nfb(II)软琼脂上进行选择性培养，然后在没有氮的MM培养基中进行选择性培养时，固氮螺菌微生物是从耕地的土壤样品分离的。根据分类学特征和碳源利用谱的不同，以及可在很大程度上用SW5-01-07固定空气中的分子氮，我们认为这些微生物是巴西固氮螺菌，然后，如后面所述，分离在低温繁殖、并生物合成多糖的变体，将其中之一保藏。
对于固氮菌的分离而言，除了使用上述组成的Nfb(II)和MM培养基之外，还可将土壤样品在Fjodorov培养基中培养，固氮菌在其中显示出特征形态学性质。Fjodorov培养基的组成如下磷酸二氢钾 0.03％磷酸氢钙0.02％硫酸钾 0.02％
硫酸镁×7水0.03％碳酸钙 0.5％氯化钠 0.05％氯化铁III 0.02％钼酸钠 0.0002％甘露糖醇 2.0％Bacto琼脂 2.0％灭菌前，使用1N氢氧化钠溶液调节培养基至pH7.0。
在Nfb(II)软琼脂上进行选择性培养，然后在没有氮的MM和Fjodorov培养基上进行选择性培养时，固氮菌微生物是从耕地的土壤样品分离的。根据分类学特征和碳源利用谱的不同，以及可在很大程度上用标记M65-01-34固定空气中的分子氮，我们认为这些微生物是维涅兰德固氮菌，然后，按照下面所述，分离在低温繁殖的变体，并由我们将其中之一保藏。
固氮螺菌和固氮菌的固氮能力也是通过乙炔还原法测定的。按照该方法(Dilworth M.J.，J.Biochem.Biophys.Acta，27，285，1996)，用注射器将乙炔注射在密闭培养皿的培养物中，温育12小时后，将0.25ml的气体混合物注射在Perkin-Elmer气相色谱的PropakN柱中。气体混合物中乙炔和乙烯的浓度是用氢火焰电离检测器测定的。从乙炔和乙烯的峰高，可清楚地推断固氮酶的酶复合物活性。固氮螺菌和固氮菌可在1小时内，将15-85nmol量的乙炔还原成乙烯。
慢生根瘤菌是2000年7月13日，从靠近Szeged-Kiskundorozsma的Subasa的大豆植物中分离的。从在黄土中生长的植物中，选择发育较好的植物，除去其根部发育较好的根瘤。用无菌蒸馏水清洗根瘤，粉碎，然后将颗粒混悬在生理盐水溶液中。在无菌条件下，制备混悬液的连续稀释液，然后在完全培养基上扩散。温育48小时后，通过所谓的共生植物试验测定培养物的固氮能力将市售苜蓿(Medicagosativa)种子的表面在72℃热处理2小时，然后用20％Hypo溶液仔细清洗而灭菌，然后在含1％琼脂的蒸馏水培养基中发芽。将幼苗放在1.5％Gibson斜琼脂(见后面)上，在温室中生长1周。用各种细菌培养物的细胞接种1周龄的植物，并在温室中再培养8周。选择3株生长最好的植物(与对照植物3-5mg的重量相比，根上部分干重22-26mg)，然后从形态学和分类学的角度，我们根据它们的性质称其为大豆慢生根瘤菌变种PH-2-1-3。
实施例2分离可溶解磷-和钾-的微生物收集世界各地的土壤样品，将样品的水混悬液在Tag培养基(见上文)上扩散，然后测试假单胞菌和芽孢杆菌的分离物质和细胞形态学。
按照微生物学实践，各种假单胞菌和芽孢杆菌是通过将原代细菌培养物在完全TAg培养基的单一培养物上扩散若干次而纯化的。细菌增加，并通过在液体和固体TAg培养基中扩散而纯化贮存。
微生物溶解磷酸盐的性质是在含有1％羟基磷灰石，并补充了修饰的Pikovskaya(HP)和10％磷酸三钙及葡萄糖(0.2％)的营养琼脂(Oxoid)培养基中测试的。
实验过程中所用培养基的组成如下修饰的Pikovskaya培养基羟基磷灰石 1.0％(NH4)2SO40.05％NaCl 0.02％KCl0.02％MgSO4×7H2O 0.01％酵母提取物 0.05％琼脂 1.5％葡萄糖(单独灭菌) 1.0％灭菌后，将下列化合物的溶液加入到培养基中1％20mg/100ml FeSO4×7H2O1％40mg/100ml MnSO4×H2O灭菌前，将培养基调节至pH7.2。
Naoxg按照制造商的说明制备的营养琼脂(Oxoid)+0.2％葡萄糖。
测试在初步实验中选择的微生物在Pikovskaya(HP)培养基中溶解磷酸盐的能力的过程中，在30℃时生长3-4天的培养物产生29-38mm的溶液环。将使用1ml蒸馏水，从TAg斜琼脂获得的相同微生物的细胞混悬液滴在Naoxg平板的孔上，该平板中还补充了10％磷酸三钙(0.1ml/孔)。将培养物在30℃温育，2-3天内，观察到明显可见的溶液环。当使用假单胞菌时，溶液环的大小为24mm，当使用芽孢杆菌时，溶液环的大小为26mm，平均大小等于34mm。
每种单独的假单胞菌和某些芽孢杆菌被证实具有较强的溶解磷酸盐的性质。所述微生物携带可在溶液中检测的无机磷酸盐变体，因此它们具有极好的溶解磷酸盐的性质。
以它们的分类学特征和碳源利用谱为基础，根据试验选出的14种假单胞菌和25种芽孢杆菌是荧光假单胞菌和多粘芽孢杆菌以及巨大芽孢杆菌，它们分别被标记为SW1-1-14，SW17-1-15和M32-1-10，分离在低温下繁殖，并可生物合成大量多糖的变体，并保藏。
可使钾离子转移的微生物的分离是按照上面所述完成的，区别在于除去上述组成的Pikovskaya(HP)培养基中的氯化钾，并加入1％粉碎成细粉的长石和云母片岩代替羟基磷灰石。
在微生物培养物周围，产生完全或部分不溶于水溶液中的矿物质，形成一个透明带。
选择它们中的一些，根据分类学特征，形态学性质和碳源利用谱，我们发现它们是芽孢杆菌和链霉菌，我们将这15组微生物标记为No.1-015-0003，然后，如后面所述，分离在低温下繁殖的变体，并保藏其中之一。
实施例3.分离产生铁载体和植物激素的微生物按照实施例1和2所述分离的微生物产生铁载体和激素的能力是利用King B培养基测试的。该培养基的组成如下胨 2％甘油1％K2HPO40.15％MgSO4×7H2O 0.15％琼脂2％灭菌前，使用氢氧化钠溶液将培养基调节至pH7.2。
产生铁载体的假单胞菌可固定铁离子，然后将铁离子运送给缺铁土壤中的植物。此外，它们还可抑制某些致植物病微生物，如胡萝卜软腐欧文氏菌的繁殖，这是因为它们不能利用固定的铁。我们通过抑制大肠埃希氏菌MC1061的生长而测试贴载体的产生。用蒸馏水从琼脂培养物制备两种微生物的细胞混悬液，然后滴在不含铁及含铁(1μMFeCl3×7H2O)的King B平板(30-50μl)上，28℃培养48小时，接着将从TAg琼脂获得的大肠埃希氏菌MC1061培养物喷在平板上，28℃再培养28小时。在培养物周围可观察到各种抑制带。四次实验的平均结果在表1中给出，阴性对照组为巨大芽孢杆菌，阳性对照组为荧光假单胞菌。
表1
*抑制程度-无，+低，++和+++高和非常高在使用mob4和阳性对照组测试所产生铁载体的过程中，可观察到一个相当大的抑制带，其在有铁离子存在时停止。
如上所述，某些假单胞菌可产生植物激素。测试所选择的微生物是否能够在上述组成的TAg培养基中生物合成ghibberellic酸。试验是使用ghibberellic酸A标准品(Sigma)，通过(40μg/ml)二氧化硅凝胶(Merck)薄层色谱进行的。用醋酸乙酯提取培养物，接着用双倍体积的碳酸氢钠提取，然后在pH2.5的溶液中，用醋酸乙酯再次提取。在提取物的蒸发残留物中，发现下列微生物斑点的Rf值与标准品接近
表2
选择标记为SW1-6和M32-1-9的微生物(它们产生约3-15μg激素/毫米)。
测试在一般性部分中描述的微生物，并从分类学角度鉴定。
实施例4分离产生胞外多糖的微生物4A.慢生根瘤菌的选择将慢生根瘤菌PH2-1-3在含1％葡萄糖和1％蔗糖的Tag培养基中(见上面)扩散，并测试培养物周围的多糖(粘液)量。选择可生物合成多糖的PH2-1和-2。
4B.芽孢杆菌的分离将芽孢杆菌M32-1-10和SW17-1-15在含1％葡萄糖和1％蔗糖的Tag培养基中(见上面)扩散，并测试培养物周围的多糖(粘液)量。选择可生物合成多糖的M32-1-6，8和10以及SW17-1-7，11和15。
经证实，在含葡萄糖和蔗糖的完全培养基上分离的微生物是玫瑰色微球菌，它可生物合成大量多糖，而多糖则将培养基转化成粘性物质。
按照我们的试验所选的微生物可生物合成结构已知的水溶性succionoglucone-型多糖。
实施例5耐冷微生物的分离利用致突变剂和辐射处理按照实施例1-4选择的微生物。用0.01，0.1，1.0，10和100μg/ml亚硝基胍处理使用蒸馏水制备的微生物混悬液1，3，5，10和30分钟。处理后，将细胞混悬液离心，用蒸馏水清洗2次，然后将细胞扩散在TAg培养基上。反复用蒸馏水处理含109个微生物/毫米的细胞混悬液，在相距10cm的15W UV灯下照射细胞1，3，5，10和30分钟，然后利用连续稀释将细胞混悬液在Tag培养基上扩散。
将TAg培养物在18℃温育192分钟，接着在18℃温育的TAg斜琼脂上分离最大的培养物。
控制并维持下列生长培养物。
分离并保藏下列经过分离、选择并耐冷的微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B001302/，白色链霉菌变种0003LP(NCAIM/P/B001301/。
实施例6微生物的培养6A.在完全培养基上培养从TAg培养基制备斜琼脂培养物，然后在30℃温育48小时。将固氮螺菌，固氮菌，芽孢杆菌，慢生根瘤菌，假单胞菌，链霉菌或微球菌培养物接种在标记为Tali、具有下列组成的培养基中葡萄糖(在50％水溶液中单独灭菌) 0.5％糖蜜1.5％玉米浆(50％干物质) 1.5％Gistex酵母提取物0.2％酸性酪蛋白 0.1％硫酸铵 0.1％柠檬酸铵0.1％碳酸钙 0.3％
硫酸二氢钾 0.1％氯化钠 0.1％硫酸镁×7H2O 0.1％棕榈油 0.2％将培养基的100-100ml部分填充在500ml的Erlenmeyer-烧瓶中，然后在121℃灭菌30分钟。使用在斜琼脂培养物上生长的微生物接种无菌培养基，培养物的培养是25℃时，在每分钟旋转260次的旋转工作台上进行36分钟。然后，使用5％量的接种物，利用显微镜试验观察生长，接种是在下列组成的Talf主要发酵培养基中进行的葡萄糖(在50％水溶液中单独灭菌)1.5％糖蜜 2.5％玉米浆(50％干物质)1.5％Gistex酵母提取物 0.4％酸性酪蛋白0.4％硫酸铵0.2％柠檬酸铵 0.2％碳酸钙0.3％磷酸二氢钾0.2％氯化钠0.1％硫酸镁×7H2O 0.2％微量元素溶液*0.45％棕榈油0.2％*微量元素溶液的组成与实施例1相同。
在上述环境下，将Erlenmeyer-烧瓶和10升总体积、5升净体积的实验室发酵器中的100ml培养基灭菌。
根据细菌的不同，当每毫升的细胞数达到4×108-1.3×109时，按照常规方式将放在烧瓶中和发酵器中的培养物在旋转工作台上培养，培养时进行v/v换气并运行带有2个口的涡轮混合器，每分钟旋转360次，共旋转24小时。
在制备更大量培养物时，在前述发酵条件下，在上述组成的Tali培养基上制备10升培养物，然后分别用5-5升接种100升灭菌的Tali和100升Talf培养基。培养在上述环境下持续24小时，然后将在土壤中的Talf培养基上生长的培养物，50升在Tali培养基上生长的培养物用于接种1000升灭菌的Talf培养基。培养在上述发酵环境下进行24小时，然后检验，培养物备用。在密集发泡时，常可加入0.01％聚丙二醇消泡剂。
6B.在半极限培养基上培养使用下列组成的Ta2f培养基代替Talf培养基重复实施例6的方法葡萄糖(在50％水溶液中单独灭菌)1.5％糖蜜 0.5％酸性酪蛋白0.1％硫酸铵0.7％柠檬酸铵 0.5％碳酸钙0.3％磷酸二氢钾0.3％氯化钠0.1％硫酸镁×7H2O 0.2％微量元素溶液* 0.35％棕榈油0.2％*微量元素溶液的组成与实施例1相同。
完成培养后，根据细菌的不同，培养物含有1-7×108个细胞/毫升。
实施例7土壤结构的改善和植物培养实验7A.用于改善土壤结构的实验将在靠近Somlyosziget的多瑙河采集的沙土和从Esztergom采集的粘土放在90×90cm的托盘中，层厚25cm。每盘使用10g硝酸铵和5g磷酸钙处理沙土。以104个种子/盘将玉米播种在盘中。在评估时，我们没有采纳5株最大和5株发育最不好植物的数据。用蒸馏水清洗后干燥2天，然后在45℃时测量根的重量。第1盘大量浇水，第2盘在播种时大量浇水，但之后不浇水。标记为“a”的盘是用生物合成多糖的微生物接种的，这些微生物是多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/和大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B001302/，它们保藏在国立农业和工业微生物和细胞保藏中心，这些微生物的培养物是按照实施例6制备的，每平方米接种每种细菌的108个细胞。标记为“b”的盘没有用微生物处理。
表3给出在播种后第33天获得的结果。结果使以一种植物计算的平均值表示的。
表3土壤盆 处理植物高度根系的重量(cm)(mg)沙土No.1 A 24 945B 17 634No.2 A 18 866B 11 757粘土No.1 A 27 1095B 23 1213No.2 A 20 1012B 19 689在表4中给出没有掺水的沙土和粘土(第2盆)的粉碎和断裂程度。我们所指的粉碎程度是指分散在纸片上，而且不会在轻轻的振摇过程中碎裂的绝大部分土壤碎块大小低于2mm(-)，2-5mm(+)，或大于5mm(++)。土壤表面的断裂程度是如此标记的没有断裂标记为++，轻微断裂标记为+，出现较大裂缝，即干旱土壤的断裂特征标记为-。
表4土壤 处理粉碎程度 断裂程度沙土 A++B--或+粘土 A++ +B++ ++从表3和表4的数据可以看出，生物合成多糖的微生物的存在可增进植物的生长且有利于土壤结构。
7B.野外实验实验是2000年时，以随机区组排列的形式，在Improvement andCultivation Technological Station of MosonmagyaróvárUniversity进行的，实验重复4次，每公顷使用10升微生物混合物。
实验土壤的类型多瑙河地区，厚度120-140cm，腐殖质含量2.4％，降雨量较少。
春小麦
玉米
甜菜
实施例8本发明含微生物制品的制备8A，微生物混合物的制备将按照实施例6制备的巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B001302/和白色链霉菌变种0003LP(NCAIM/P/B001301/的培养物混合，优选等比混合，在一年之中的任何无霜冻期，优选3-10月，以5-50升，优选12升/公顷的量用于土壤中。
8B，处理单子叶植物的制品按照实施例6的方法，使用下列微生物制备不同的制品巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001291)，白色链霉菌变种0003LP(NCAIM/P/B001301/。
8C，处理双子叶植物的制品按照实施例6的方法，使用下列微生物制备不同的制品巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B001302/。
8D，制备冷冻干燥的制品按照设备的使用说明，将根据实施例6制备的2升微生物水混悬液在Gelman SP54冷冻干燥设备中进行冷冻干燥。将干燥的微生物粉末单独使用，或与碳酸钙，淀粉，葡萄糖或纤维素以1∶1-1∶100的比例混合使用，然后将制品在4-10℃贮存备用。
8E，制备含载体的制品优选将按照实施例6在培养基上制备的培养物与有机肥料，大豆粉(4目常规粒径)，甲基纤维素或马铃薯淀粉等比混合，这样所述制品应含有5×108-1010，优选5×109个微生物细胞，然后以2-20，优选5kg/公顷的量将湿制品或在低于40℃的温度干燥的制品用于所要处理的土壤中。优选在每公顷土壤中掺入至少1130个微生物细胞。
总结本发明的主题是产品和使用细菌处理土壤，从而增进植物生长，增加产率的方法，制备所述产品的方法，作为产品基础的、可低温繁殖并合成多糖的微生物的原液，以及用于生产它们的方法。可将本发明其中一种微生物细胞或它们的化合物运送到土壤中，或固定在植物的种子中。
使用本发明的方法可将产品运送到土壤中，所述产品含有至少一种土壤细菌，该土壤细菌可将空气中的氮转化成植物用的化合物，使矿化的磷-和钾-化合物溶解，并生物合成可增进植物生长的物质，产生有利影响土壤结构的多糖，它们是从各种土壤中分离并在实验室中改变的，如此可达到令人满意的产率，从而在实践中不必使用高价肥料。
权利要求
1.适于处理土壤和植物种子的制品，它含有能够在植物环境的不同土壤类型中繁殖的活的微生物，其特征在于它含有5×106-1011，优选107-1010个细胞/g量的、微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B 001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B 001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B 001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B 001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B 001294/，大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B 001302/和白色链霉菌变种0003 LP(NCAIM/P/B001301/中至少一种的培养物，以及从农业观点看为农业上可接受的、而且对微生物无毒的湿载体或干载体，所述微生物在低温，优选低于20℃，以及低pH，优选低于pH5.0的土壤中也繁殖，并保藏在国立农业和工业微生物和细胞保藏中心。
2.根据权利要求1所述的制品，它含有水和/或大豆粉和/或淀粉和/或纤维素和/或葡萄糖或它们的衍生物作为载体。
3.用于制备适于处理土壤和植物种子的产品和/或含有活的微生物的制品的方法，所述微生物能够在植物环境的不同土壤类型中繁殖，并且能够在低温，优选低于20℃，和较低pH，优选低于pH5.0时繁殖，其特征在于在含有碳源及氮源和无机盐的培养基中，单独或共同培养保藏在国立农业和工业微生物和细胞保藏中心的微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIMP/B 001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B 001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B 001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B 001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B 001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B001294/，大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B 001302/和白色链霉菌变种0003 LP(NCAIM/P/B 001301/中的至少一种，直到细胞数达到5×107-5×109/毫升，任选以规定比例混合培养物，或任选使培养物沉积在载体上或与其混合，并任选按常规方式冷冻干燥。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使用葡萄糖和/或蔗糖和/或糖蜜作为碳源，氯化铵和/或硝酸铵和/或硫酸铵和/或玉米浆和/或酪蛋白-水解产物作为氮源，碳酸钙和能够解离出钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，铁离子，硝酸根离子，氯离子，硫酸根离子，碳酸根离子，磷酸根离子，以及微量元素的盐作为无机盐。
5.优选在低于20℃的温度和pH5时也繁殖、并以以下保藏号保藏在国立农业和工业微生物和细胞保藏中心的微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B 001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B 001292)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B 001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B 001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B 001291)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B 001294/，大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B 001302/和白色链霉菌变种0003 LP(NCAIM/P/B 001301/。
6.根据权利要求5所述的用于制备微生物的方法，其特征在于从植物环境中给定土壤类型的40cm的上(顶)层采集土壤样品，鉴定所选择的微生物，使用突变剂进行处理，并分离在低温下也繁殖的变体。
7.使用权利要求1或2所述的制品处理土壤的方法，其特征在于在非霜冻期，以1010-1014，优选1011-1012/公顷的量，将运送微生物细胞施用于土壤上或土壤中。
8.使用权利要求1或2所述的制品处理植物种子的方法，其特征在于使用含有其中一种微生物或其混合物的液体产品处理种子。
9.用于改善或维持土壤结构的方法，其特征在于将微生物来源，优选微生物合成succinoglucone的微生物来源的多糖运送到土壤中。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于施用能够生物合成多糖的微生物，优选含有菌株多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B 001292)，玫瑰色微球菌A21(NCAIM/P/B 001294/或大豆慢生根瘤菌变种PH25(NCAIM/P/B 001302/的产品。
全文摘要
本发明涉及适于处理土壤的、含有活的微生物的产品，所述微生物可在不同的气候和自然环境下繁殖，本发明还涉及用于生产该产品的方法，此外还涉及使用该产品处理土壤和植物的方法。具体而言，本发明涉及一种从下列微生物的任何一种或其混合物制备所述产品的方法。此外，本发明还涉及一种生产所用微生物的培养物的方法。本发明的主题还有所述微生物本身。更具体而言，本发明涉及一种使用所述产品处理土壤和植物的方法，该产品含有微生物巴西固氮螺菌SW51(NCAIM/P/B 001293)，维涅兰德固氮菌M657(NCAIM/P/B001291)，荧光假单胞菌变种SW11(NCAIM/P/B 001296)，多粘芽孢杆菌变种SW17(NCAIM/P/B 001295/，巨大芽孢杆菌变种M326(NCAIM/P/B 001301/－中的至少一种，此外含有所列微生物的产品可在所讨论的植物环境中繁殖并生存，本发明还涉及它们的生产方法。
文档编号C05F11/08GK1568296SQ02820300
公开日2005年1月19日 申请日期2002年8月12日 优先权日2001年8月13日
发明者G·B·基斯, I·奥特 申请人:匈牙利农业－生物公司