专利名称：雷公藤杀虫活性物质的提取和分离方法
技术领域：
本发明涉及植物性农药的制备领域，尤其是涉及雷公藤杀虫活性物质的提取和分离方法。
背景技术：
雷公藤Tripterygium wilfordii Hook f.为卫矛科雷公藤属植物，又名黄藤根、菜虫药，很早以前在我国就用于医学和防治各种害虫，是著名的药用和杀虫植物之一。早在1936年美国从雷公藤根部提取到萜类色素雷公藤红(tripterine)以来，至今已提取到100多种成分，主要为生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类、卫矛醇、卫矛碱、β-谷甾醇、甙及糖等。关于雷公藤杀虫活性成分的研究始于20世纪30年代，美国人Beroza等先后从雷公藤根皮中提取分离到一系列的大环内酯生物碱，并对其杀虫活性进行了测试，发现这些生物碱对欧洲玉米螟初孵幼虫有很强的毒杀活性。但真正在植物农药方面的研究在近年才得到很大的发展，因雷公藤化学成分复杂，有效成分或衍生物的提取和纯化难度颇大，如专利申请号为CN01141888.5、CN00129820.8、CN03115750.5等的专利申请主要还是应用雷公藤植物的根皮粉及其粗提物，至今还未见有完整的雷公藤杀虫活性物质的提取及分离方法的报导。
发明内容
本发明的目的是提供雷公藤杀虫活性物质的提取和分离方法。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现。
本发明雷公藤杀虫活性物质的提取和分离方法，包括如下步骤(1)雷公藤植物组织部分的准备将雷公藤的根心、根皮、茎皮、茎木质部或叶洗净，干燥，经粉碎后备用；(2)雷公藤粗提取物的制备将(1)准备好的粉状物用水或有机溶剂，采用常温或加温和常规或改进型索氏法提取，提取液直接或经浓缩后，加水或加氯化钠、氯化钾、氯化铵或硫酸铵水溶液，析出固体，过滤、烘干；(3)雷公藤粗总生物碱的提取将(2)所得的粗提取物直接或用非醇有机溶剂溶解后，用酸溶液萃取一次或一次以上，合并水层，水层用碱或盐调整pH值到6-12，析出固体，过滤后干燥；(4)雷公藤总生物碱的提取将(3)所得的粗总生物碱用非醇有机溶剂溶解后，用酸溶液萃取一次或一次以上，合并水层，水层用碱或盐调整pH值到6-12，析出固体，过滤后干燥；(5)雷公藤纯总生物碱的提取将(4)所得的总生物碱采用0.1％-99.9％丙酮和99.9％-0.1％甲醇的混合液进行重结晶得到；(6)雷公藤生物碱单体的分离将(5)所得的纯总生物碱进行柱层析分离，以硅胶、氧化铝和盐酸中的任何一种为固定相，辅以流动相进行洗脱，分步收集，经高效液相检测，挥去流动相，合并含相同组份的部份，干燥，获得5种不同雷公藤生物碱。
本发明步骤(2)所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙醚、环己酮、环己烷和正己烷之中的任何一种；
本发明步骤(3)、(4)所述非醇有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、乙醚、环己酮、环己烷和正己烷中的一种或一种以上混合剂；本发明步骤(3)、(4)所述酸溶液为0.1-40％的硫酸水溶液或0.1-20％的盐酸水溶液；本发明步骤(3)、(4)所述碱或盐为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钙或碳酸氢钙中的任何一种；本发明步骤(6)所述流动相为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙醚、环己酮、环己烷和正己烷中的一种或一种以上混合溶剂；所述一种以上混合溶剂流动相，各单组份的含量均可为0.1％-99.9％，各组份的总量为100％。
本发明有益效果，一是采用本发明提供的一套完整的雷公藤生物碱的提取和分离方法，可以有效的提取并分离到至少5种不同雷公藤生物碱单体，且纯度均可达95％以上；二是本发明跟踪测定了上述雷公藤各生物碱单体对鳞翅目害虫如菜青虫、小菜蛾和二化螟、大螟等选择性和非选择性条件下的拒食作用、胃毒作用及生长发育作用，从而明确了各生物碱单体的杀虫活性之间的差异，为雷公藤各生物碱的毒理学研究以及雷公藤作为植物性农药的进一步开发和合理利用提供了技术。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明方法作进一步描述。
实施例1取雷公藤根皮1公斤，经干燥、粉碎后，用乙酸乙酯索氏提取。提取液浓缩后，析出固体，过滤、烘干，得到雷公藤粗提取物。该粗提取物用三氯甲烷溶解后，用8％盐酸溶液萃取四次，合并水层，水层用氢氧化钠调整pH值到10，析出固体，过滤、干燥得到雷公藤粗总生物碱。再用三氯甲烷溶解该粗总生物碱，0.1％盐酸溶液萃取四次，合并水层，水层用氢氧化钠调整pH值到8，析出固体，过滤、干燥得到雷公藤总生物碱。雷公藤总生物碱经过0.1％丙酮和99.9％甲醇混合溶剂进行重结晶得到纯雷公藤生物碱。
上述得到纯生物总碱进行柱层析分离。色谱柱固定相为硅胶，流动相为甲醇和乙醚(1∶1)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相。其中第19-22管合并，再进行柱层析分离，固定相为硅胶，流动相为乙酸乙酯和三氯甲烷(11∶1)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相，合并第11-13管，干燥，获得雷公藤碱(wilfordine)480mg。经测定对小菜蛾的选择性条件AFC50(拒食中浓度)为82.7mg/L，非选择性条件AFC50为170.1mg/L，96h时致死中浓度LC50为122mg/L，生长发育抑制中浓度为161.4mg/L；选择性条件下，对二化螟幼虫的AFC50为46.1mg/L，在非选择性条件下，对二化螟幼虫的AFC50为188.3mg/L，LC50为326.5mg/L，发育抑制率为88.79％以上。
实施例2取根皮1公斤，经干燥、粉碎后，用乙醇索氏提取。提取液浓缩后，加水，析出固体，过滤、烘干，得到雷公藤粗提取物。该粗提取物用三氯甲烷溶解后，用20％盐酸溶液萃取四次，合并水层，水层用碳酸氢钠溶液调整pH值到10，析出固体，过滤、干燥得到雷公藤粗总生物碱。再用三氯甲烷溶解该粗总碱，0.5％盐酸溶液萃取四次，合并水层，水层用氢氧化钠调整pH值到8，析出固体，过滤、干燥得到雷公藤总生物碱。雷公藤总生物碱经过99.9％丙酮和0.1％甲醇混合溶剂进行重结晶得到纯雷公藤生物碱。
上述得到纯生物总碱进行柱层析分离。色谱柱固定相为硅胶，流动相为甲醇和乙醚(1∶1)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相。其中第25-28管合并，再进行柱层析分离，固定相为硅胶，流动相为乙酸乙酯和三氯甲烷(1∶19)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相，合并第15-16管，干燥，获得雷公藤次碱(wilforine)220mg。经测定对小菜蛾的选择性条件AFC50(拒食中浓度)为483.6mg/L，非选择性条件AFC50为670.5mg/L，96h时致死中浓度LC50为570.7 mg/L，生长发育抑制中浓度为612.5mg/L；选择性条件下，对二化螟幼虫的AFC50为146.1mg/L，在非选择性条件下，对二化螟幼虫的AFC50为388.3mg/L，LC50为826.5mg/L，发育抑制率为60.79％以上。
实施例3取根皮1公斤，经干燥、粉碎后，用乙醚提取。提取液浓缩后，析出固体，过滤、烘干，得到雷公藤粗提取物。该粗提取物用三氯甲烷溶解后，用10％硫酸溶液萃取四次，合并水层，水层用氨水调整pH值到10，析出固体，过滤、干燥得到雷公藤粗总生物碱。再用三氯甲烷溶解该粗总碱，1％盐酸溶液萃取四次，合并水层，水层用氢氧化钠调整pH值到8，析出固体，过滤、干燥得到雷公藤总生物碱。雷公藤总生物碱经过30％丙酮和70％甲醇混合溶剂进行重结晶得到纯雷公藤生物碱。
上述得到纯生物总碱进行柱层析分离。色谱柱固定相为硅胶，流动相为甲醇和乙醚(1∶1)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相。其中第35-37管合并，再进行柱层析分离，固定相为硅胶，流动相为乙酸乙酯和三氯甲烷(2∶15)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相，合并第22-23管，干燥，获得雷公藤宁碱(wilfornine)280mg。经测定对小菜蛾的选择性条件AFC50(拒食中浓度)为117.6mg/L，非选择性条件AFC50为234.2mg/L，96h时致死中浓度LC50为211.4mg/L，生长发育抑制中浓度为285.0mg/L；选择性条件下，对二化螟幼虫的AFC50为95.7mg/L，在非选择性条件下，对二化螟幼虫的AFC50为266.5mg/L，LC50为402.3mg/L，发育抑制率为74.5％以上。
实施例4取雷公藤叶1公斤，经干燥、粉碎后，用甲醇提取。提取液浓缩后步骤同实例1，其中第26-29管合并，再进行柱层析分离，固定相为氧化铝，流动相为乙酸乙酯和三氯甲烷(5∶1)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相，合并第28-30管，干燥，获得雷公藤辛碱(wilforzine)46mg。经测定对菜青虫具有麻醉和胃毒作用，少量取食后，虫体不动并慢慢开始发黑；小菜蛾的选择性条件AFC50(拒食中浓度)为286.3mg/L，非选择性条件AFC50为321.6mg/L，96h时致死中浓度LC50为482.7mg/L，发育抑制率为86％以上。
实施例5取根皮1公斤，经干燥、粉碎后，用乙醇提取。提取液浓缩后，析出固体，过滤、烘干，得到雷公藤粗提取物。该粗提取物用三氯甲烷溶解后，用40％硫酸溶液萃取四次，合并水层，水层用氨水调整pH值到10，析出固体，过滤、干燥得到雷公藤粗总生物碱。再用乙醚溶解该粗总碱，0.1％盐酸溶液萃取四次，合并水层，水层用氢氧化钠调整pH值到8，析出固体，过滤、干燥得到雷公藤总生物碱。雷公藤总生物碱经过50％丙酮和50％甲醇混合溶剂进行重结晶得到纯雷公藤生物碱。
上述得到纯生物总碱进行柱层析分离。色谱柱固定相为氧化铝，流动相为甲醇和乙醚(1∶1)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相。其中第35-37管合并，再进行柱层析分离，固定相为硅胶，流动相为乙醚和三氯甲烷(2∶15)，经流动相洗脱，分部收集，经高效液相检测，挥去流动相，合并第27-29管，干燥，获得雷公藤特碱(wilfortrine)165mg。经测定对小菜蛾的选择性条件AFC50(拒食中浓度)为135.6mg/L，非选择性条件AFC50为220.3mg/L，96h时致死中浓度LC50为282.6mg/L，生长发育抑制中浓度为235.1mg/L；选择性条件下，对二化螟幼虫的AFC50为115.7mg/L，在非选择性条件下，对二化螟幼虫的AFC50为245.0mg/L，LC50为416.2mg/L，发育抑制率为80％以上。
权利要求
1.雷公藤杀虫活性物质的提取和分离方法，其特征是包括如下步骤及工艺(1)雷公藤植物组织部分的准备将雷公藤的根心、根皮、茎皮、茎木质部或叶洗净，干燥，经粉碎后备用；(2)雷公藤粗提取物的制备将(1)准备好的粉状物用水或有机溶剂，采用常温或加温和常规或改进型索氏法提取，提取液直接或经浓缩后，加水或加氯化钠、氯化钾、氯化铵或硫酸铵水溶液，析出固体，过滤、烘干；(3)雷公藤粗总生物碱的提取将(2)所得的粗提取物直接或用非醇有机溶剂溶解后，用酸溶液萃取一次或一次以上，合并水层，水层用碱或盐调整pH值到6-12，析出固体，过滤后干燥；(4)雷公藤总生物碱的提取将(3)所得的粗总生物碱用非醇有机溶剂溶解后，用酸溶液萃取一次或一次以上，合并水层，水层用碱或盐调整pH值到6-12，析出固体，过滤后干燥；(5)雷公藤纯总生物碱的提取将(4)所得的总生物碱采用0.1％-99.9％丙酮和99.9％-0.1％甲醇的混合液进行重结晶得到；(6)雷公藤生物碱单体的分离将(5)所得的纯总生物碱进行柱层析分离，以硅胶、氧化铝和盐酸中的任何一种为固定相，辅以流动相进行洗脱，分步收集，经高效液相检测，挥去流动相，合并含相同组份的部份，干燥，获得5种不同雷公藤生物碱。
2.根据权利要求1所述方法，其特征是步骤(2)所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙醚、环己酮、环己烷和正己烷中的任何一种；
3.根据权利要求1所述方法，其特征是步骤(3)、(4)所述非醇有机溶剂为乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、乙醚、环己酮、环己烷和正己烷中的一种或一种以上任意比例混合液；
4.根据权利要求1所述方法，其特征是步骤(3)、(4)所述酸溶液为0.1％-40％的硫酸溶液或0.1％-20％的盐酸溶液；
5.根据权利要求1所述方法，其特征是步骤(3)、(4)所述碱或盐为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钙或碳酸氢钙中的任何一种；
6.根据权利要求1所述方法，其特征是步骤(6)所述流动相为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、石油醚、丙酮、乙醚、环己酮、环己烷和正己烷中的一种或一种以上混合溶剂组成；
7.根据权利要求6所述方法，其特征是所述一种以上混合溶剂流动相，各单组份的含量均可为0.1％-99.9％，各组份的总量为100％。
全文摘要
本发明公开了一种雷公藤杀虫活性物质的提取和分离方法，利用本方法可以从雷公藤根、茎和叶等各部分组织中提取出雷公藤杀虫活性物质—纯生物碱，并进一步分离出至少5种不同雷公藤生物碱单体，纯度可达95％以上；本发明通过雷公藤组织部分的准备、粗提取物的制备、粗总生物碱的提取、纯总生物碱的提取及生物碱单体的分离等步骤得以实施；本发明并进一步跟踪测定了各生物碱单体的杀虫活性，为雷公藤的毒理学研究及进一步的开发和合理利用提供了技术。
文档编号A01N65/14GK1543804SQ20031010882
公开日2004年11月10日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年11月25日
发明者俞晓平, 吕仲贤, 陈建明, 徐红星, 陈列忠, 郑许松, 张珏锋 申请人:浙江省农业科学院