专利名称：防治温室蔬菜疫病的复合菌剂的制作方法
技术领域：
防治温室蔬菜疫病的复合菌剂(PGPR菌剂)属于农作物防病治病技术领域，专用于蔬菜疫病的无公害防治。
二、技术背景目前我国保护地蔬菜的种植面积不断扩大，由于保护地内温湿条件适宜疫霉的生长，再加上同一品种的连作，造成疫病逐年加重。目前对蔬菜疫病的药剂防治主要还是使用化学农药，如乙磷铝、甲霜灵、普力克、阿米西达等。但是，使用化学农药不仅会产生农药残留，而且随着化学农药的逐年使用疫霉菌的抗药性也在逐渐增加，如美国密歇根州已经出现了对Ridmil gold有抗性的辣椒疫霉菌株，并且研究发现当一个菌株对Ridmil gold产生抗药性同时不会丧失原有的其他特性。(M.Hausbeck R.Fulbright and R.Hammerschmidt.An integrated approachto manage phytophthora blight on Michigan′s vine crops.)。为此菜农只能加大农药的使用量，由此，农药使用和依赖程度呈现出恶性循环状态。农药的大量使用，使得蔬菜中农药残留量超标问题突出。2000年5月份农业部农药检定所组织北京、上海、重庆、山东和浙江等5省市的农药检定所，对50个蔬菜品种，1293个样品的农药残留进行抽样检测，农药残留量超标率达30％，残留浓度高者为允许残留量的几倍甚至几十倍。蔬菜中农药残留量的严重超标，导致中毒事故时有发生。据卫生部统计数字，1999年我国由于农药残留引起的食品店菜性食物中毒菜有37起，急性中毒的例子，还能引起我们的重视，而慢性中毒和蓄积性中毒的情况我们就不得而知，其实其结果会更加可怕。我国出口到日本、韩国等发达国家的蔬菜经常因为农药残留达不到他们的标准而被退回，这给许多菜农造成很大损失。为此应该大力推广种植无公害蔬菜，规范生产标准，尽量减少化学农药的用量。
无公害蔬菜早已成为世界蔬菜生产的主流。早在20世纪20年代，国外就开始发展无公害蔬菜，其主要生产方式是无土栽培。据不完全统计，世界上单用营养液膜法(NFT)栽培无公害蔬菜的国家就达76个。在新西兰，半数以上的番茄、黄瓜等果菜类蔬菜是无土栽培的。日本、荷兰、美国等发达国家，采用现代化的水培温室，常年生产无公害蔬菜。我国无公害蔬菜的研究和生产始于1982年，该年召开全国生物防治会议，江苏省率先提出用生物防治代替化学农药防治。1983年，在全国植保总站的大力支持下，全国23个省、市开展了无公害蔬菜的研究、示范与推广工作。通过几年的研究实践，探索出一套综合防治病虫害、减少农药污染的无公害蔬菜生产术。1985年全国推广无公害蔬菜生产面积4万hm2(60万亩)，至今全国各地几乎每个市都有无公害蔬菜生产基地。期间，开发了一些成功的生物杀菌剂，如农用链霉素、井岗霉素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜软腐病、青枯病，后者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜霉病。但尚未出现对疫病有较高防效的生防制剂。
发明内容
技术问题针对温室疫病没有有较高防效的生防制剂现状，提供开发一种防治蔬菜疫病的复合菌剂，专用于防治黄瓜、番茄、辣椒等温室蔬菜疫病，菌剂的防效高，并且有增产功能。
技术方案本发明一种防治温室蔬菜疫病的复合菌剂，包含的主要细菌菌株为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)菌株B130，短小芽孢杆菌(B.pumilus)菌株FH17，蜡状押宝杆菌(B.cereus)菌株BB11，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株J1，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株J2，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株J3，各菌株的混合比例为1∶0.4～0.5∶0.2～0.3∶0.2～0.3∶0.2～0.3∶0.2～0.3。
各菌的混合培养方法为1)同时将各菌接种到PDA培养液中分别培养33℃200rpm，24小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)将各菌培养至OD值均在0.1～1之间时，开始混菌取OD值最大的菌1毫升，则其他某菌的量(ml)＝最大OD值×该菌与最大OD值菌的配比值/该菌的OD值；3)将各菌混合后加到250ml PDA培养液中33℃200rpm摇36小时，然后7000rpm离心，每1000ml培养液获得13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体。
取湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1014cfu/ml，用于防治温室蔬菜疫病。其中所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.2-7.4，然后121℃灭菌20分钟。
有益效果本发明与现有蔬菜疫病防治技术相比，其优点和积极效果表现在
本发明是专门针对蔬菜疫病开发的生防制剂，因而在防治蔬菜疫病方面与目前其他广谱生物杀菌剂相比防治效果显著提高。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治疫病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于蔬菜的出口。同时，该菌剂还有增产功能，可为农民增加收入。
该菌剂用湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838，
公开日2002年7月17日)按1∶40(g/ml)配成菌剂，可室温保存2～3年。
该菌剂可以在温室移栽前倒入有机肥中制成堆肥，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在栽苗时灌根使用。栽苗后，其中的菌能在苗的根部定殖，有些可产生拮抗物质破坏疫霉的细胞膜、细胞器间的交流，降解细胞壁，破坏疫霉菌的厚垣孢子等；另一些则占据根围空间，并与疫霉菌争夺营养，如根的分泌物等，从而达到防治疫病的效果。
试验表明，使用该菌剂对蔬菜疫病的平均防治效果可达75％以上，增产可达45％以上。
四
具体实施例方式
本发明一种防治蔬菜疫病的复合菌剂(商品名为PGPR复合菌剂)由菌株B130(Bacillus circulans环状芽孢杆菌，Journal of Bacteriology，July1990，p.4017-4022)，FH17(B.pumilus短小芽孢杆菌，Phytopathology Vol.92，No.121329-1333，2002)，BB11(B.cereus蜡状押宝杆菌，Appl.Environ.Microbol.696208-6215；2003)，J1(B.subtilis枯草芽孢杆菌，Plant Physiology Jan2004.Vol.134，Iss.1；p.307)，J2Serratia marcescens(粘质沙雷氏菌，Annals of the phytopathological society of Japan1998，644，287-293)，J3(Pseudomonasfluorescens荧光假单胞菌，Appl.Environ.Microbol.Vol65，No.6.2429-2438；1999)等对人及动植物无致病性的已知公用菌株组成。
其中菌株B130见文献郭坚华等.1994.抗青枯生防菌拮抗物性质的初步研究.南京农业大学学报.18(2)59∽62.；其余菌株FH17、，BB11、J1、J2、J3均见文献郭坚华等.2001.辣椒青枯病拮抗菌株的筛选及田间防效的测定.中国生物防治.17(3)101∽106。
以上各菌株属公知公用常用菌株，在南京农业大学植物病理实验室(发明人所在实验室)均有保存，可保证长期向社会供应。
该菌剂采用常规细菌培养法获得，将以上各菌按1∶0.4～0.5∶0.2～0.3∶0.2～0.3∶0.2～0.3∶0.2～0.3比例混合后用PDA培养液33℃200rpm摇36小时，然后7000rpm离心，每1000ml培养液获得13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体。
取湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838)按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1014cfu/ml。
PDA培养液配制方法用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.2-7.4，然后121℃灭菌20分钟。
各菌混合方法同时将各菌接种到PDA培养液中分别培养33℃200rpm，约24小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零。当有OD值不在0.1～1之间时将各菌继续培养，每隔3小时测一次，直到各OD值均在此范围内。此时即可开始混菌，例如取OD值最大的菌1毫升，则其他某菌的量(ml)＝最大OD值×该菌与最大OD值菌的配比值/该菌的OD值。注通常认为当600nm处OD值在0.1～1之间时符合浓度＝OD值×109cfu/ml。将各菌混合后加到250ml PDA培养液中33℃200rpm摇36小时，通常每1000ml培养液可生产13～16g湿菌)。
该菌剂可以在温室移栽前倒入有机肥中制成堆肥，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在栽苗时灌根使用。栽苗后，其中的菌能在苗的根部定殖，有些可产生拮抗物质破坏疫霉的细胞膜、细胞器间的交流，降解细胞壁，破坏疫霉菌的厚垣孢子等；另一些则占据根围空间，并与疫霉菌争夺营养，如根的分泌物等，从而达到防治疫病的效果。
实施例1取由菌株B130，FH17，BB11，J1，J2，J3混合比例为1∶0.5∶0.2∶0.3∶0.3∶0.2的湿菌，每克湿菌含4×1010个菌体，加入菌体保藏液硼酸钠缓冲液，至终浓度为0.01mol/L(pH7.3)，加入Tween20至终浓度为0.001mol/L，即获得复合菌剂(商品名为PGPR复合菌剂)，可室温保存2～3年，用于辣椒疫病生防实验(表1)，结果表明，使用该菌剂对蔬菜疫病的平均防治效果可达81.3％，增产可达96.4％，明显高于对照组及以上各菌株单菌制剂。
表1 2003年江苏赣榆辣椒疫病生防实验
实施例2取由菌株B130，FH17，BB11，J1，J2，J3混合比例为1∶0.4∶0.2∶0.3∶0.3∶0.3得到的湿菌，每克湿菌含4×1015个菌体加入菌体保藏液硼酸钠缓冲液，至终浓度为0.01mol/L(pH7.3)，加入Tween20至终浓度为0.001mol/L，即获得复合菌剂(商品名为PGPR复合菌剂)，可长期室温保存，用于疫病生防实验(表2、表3)，结果表明，使用该菌剂对黄瓜疫病的平均防治效果可达95.6％，增产可达48.1％，明显高于对照组及以上各菌株单菌制剂。
表2河南省扶沟县东营村黄瓜疫病生防实验(2000年)
注方案1菌剂稀释1000倍，混匀，作为定根水在移栽时灌根，每株约50ml，以灌够定根水为宜，一周后再如此浇灌一次；以后隔30天使用一次，共使用7次。
表3河南省扶沟县东营村黄瓜疫病生防实验(2001年)
实施例3取由菌株B130，FH17，BB11，J1，J2，J3混合比例为1∶0.4∶0.3∶0.2∶0.2∶0.3得到的湿菌，每克湿菌含4×1014个菌体加入菌体保藏液硼酸钠缓冲液，至终浓度为0.01mol/L(pH7.3)，加入Tween20至终浓度为0.001mol/L，即获得复合菌剂，可长期室温保存，用于辣椒疫病生防实验(表4、表5)，结果表明，使用该菌剂对黄瓜疫病的平均防治效果可达87.8％，增产可达247.5％，明显高于对照组及以上各菌株单菌制剂。
表4河北邯郸黄瓜疫病生防实验(2000年)
表5河北邯郸黄瓜疫病生防实验(2001年)
实施例4取由菌株B130，FH17，BB11，J1，J2，J3混合比例为1∶0.5∶0.2∶0.3∶0.2∶0.2得到的湿菌，每克湿菌含4×1013个菌体，加入菌体保藏液硼酸钠缓冲液，至终浓度为0.01mol/L(pH7.3)，加入Tween20至终浓度为0.001mol/L，即获得复合菌剂，可长期室温保存，用于辣椒疫病生防实验(表6)，结果表明，使用该菌剂对番茄疫病的平均防治效果可达78.7％，增产可达48.6％，明显高于对照组及以上各菌株单菌制剂。
表6南京马群番茄疫病生防实验(1999年)
权利要求
1.一种防治温室蔬菜疫病的复合菌剂，其特征在于，包含的主要细菌菌株为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)菌株B130，短小芽孢杆菌(B.pumilus)菌株FH17，蜡状押宝杆菌(B.cereus)菌株BB11，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株J1，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株J2，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株J3，各菌株的混合比例为1∶0.4～0.5∶0.2～0.3∶0.2～0.3∶0.2～0.3∶0.2～0.3。
2.根据权利要求1所述的一种防治温室蔬菜疫病的复合菌剂，其特征在于，各菌的混合培养方法为1)同时将各菌接种到PDA培养液中分别培养33℃200rpm，24小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；2)将各菌培养至OD值均在0.1～1之间时，开始混菌取OD值最大的菌1毫升，则其他某菌的量(ml)＝最大OD值×该菌与最大OD值菌的配比值/该菌的OD值；3)将各菌混合后加到250ml PDA培养液中33℃ 200rpm摇36小时，然后7000rpm离心，每1000ml培养液获得13～16g湿菌，每克湿菌含4×1010～1015个菌体。
3.根据权利要求1或2所述的一种防治温室蔬菜疫病的复合菌剂，其特征在于，所用PDA培养液配制方法为用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值调至7.2-7.4，然后121℃灭菌20分钟。
4.根据权利要求1或2所述一种防治温室蔬菜疫病的复合菌剂，其特征在于，取湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1014cfu/ml。
5.根据权利要求3所述一种防治温室蔬菜疫病的复合菌剂，其特征在于，取湿菌与菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×109～1×1014cfu/ml。
6.权利要求1-5之一所述一种防治温室蔬菜疫病的复合菌剂的应用。
全文摘要
一种能防治温室蔬菜疫病的生防菌剂，包括环状芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，蜡状押宝杆菌，枯草芽孢杆菌，粘质沙雷氏菌，荧光假单胞菌。将以上各菌按1∶0.4～0.5∶0.2～0.3∶0.2～0.3∶0.2～0.3∶0.2～0.3比例混合后用PDA培养液33℃200rpm摇36小时，然后7000rpm离心，取湿菌与本实验室的菌体保藏液按1∶40(g/ml)配成菌剂，成品中活菌总浓度为1×10
文档编号A01N63/02GK1568709SQ200410014880
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月13日 优先权日2004年5月13日
发明者郭坚华, 蒋志强 申请人:南京农业大学