专利名称：苦草根茎无菌培养及工程苗快繁方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速繁殖苦草优质工程苗的方法。
背景技术：
苦草(Vallisneria natans)是属于水鳖科苦草属的一种沉水草本植物，生长在透明度大、淤泥深厚、水流缓慢的河流、湖泊等水域。该物种具有较强的水质净化能力，并且对水体污染有着较高的耐受性，在水生生态系统修复重建工程中，常作为先锋物种净化水质。该物种还含有较多的营养成分，所以也是鱼虾蟹的常用饵料，并且在养殖塘中该物种可以为上述水产品提供产卵、蜕壳和避难的场所，因此可广泛应用于鱼虾蟹的养殖。同时，该物种还是室内观赏水族箱的布景物种。
目前市场上对苦草种苗的需求量很大，在试验和养殖业中都有应用，但种源大多来自自然环境。一方面，大量打捞容易导致原产地生境的破坏；另一方面，自然生境的苦草常带有各种杂藻杂菌，容易造成移植生境的污染和有关生理生态试验的误差，同样也不利于室内的观赏。当然，目前有用苦草种子播种来弥补种源的不足，但这需要合适的水生环境和较长的时间。
发明内容
本发明需要解决的问题是利用植物组织培养方法，以苦草的繁殖体根茎为基础材料，采用不同的消毒方法和培养基质，获得并在室内大规模繁殖苦草无菌苗，然后从无菌苗进行快速扩繁。以克服该物种野外收集有限且污染严重的弊端，适应我国淡水湖泊植被恢复、野外鱼虾蟹水产养殖以及室内观赏水族布景苦草的需要。
本发明的技术方案是1.苦草无菌幼苗的获得从野外自然生境中采集苦草的根茎，于肥皂水中浸泡2h以上，用自来水冲洗于净并在流水下浸泡过夜。在超净工作室中，用0.1％的升汞浸泡一定时间，用无菌水彻底漂洗后接种于培养液①(表1)中，并置于组织培养室中培养。室内平均光照强度2000lx，每日光照10h，温度为25℃左右。期间注意观察，随时剔除仍然污染的材料，以免交叉感染。
2.苦草出芽诱导由上述步骤获得的有明显的根系的无菌幼苗，于超净工作室中，转接到固体培养基②中，并在表面加上一层培养液③。2周以后，植株开始在匍匐茎上萌芽长苗，重复上述方法，以获得足够多的无菌幼苗。上述扩增培养过程仍在组培室中进行，光照和温度不变。
表1.苦草培养液①、②、③的配方
*上述培养液按浓度配好后均用稀HCl或NaOH调整pH到5.8，分装到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于121℃、0.1MPa左右湿热灭菌20min。
3.苦草工程苗的壮苗将上述培养基中5cm以上的植株取出，移栽到底部铺有灭过菌的沙石的玻璃缸。保持水深30cm，每周换水并添加一定量Hoagland营养液以促进其生长。当室外白昼气温20℃以上时，将玻璃缸置于室外，直接利用太阳光照；否则，将玻璃缸置于温室中，昼夜温度分别保持18℃和25℃以上，并在白天适当补充人工光照。上述培养保持到植株长至30cm以上。
4.苦草工程苗的应用(1)上述通过步骤2培养后收获根系发达、植株长于5cm的健康苦草小苗，取出后用自来水将植株表面的残留培养液彻底冲洗干净，然后插在水族缸底部的泥沙中，既美观又不会带入其他不必要的杂菌杂藻。
(2)上述通过步骤2培养后收获根系发达、植株长于5cm的健康苦草小苗，取出洗净，直接应用于试验，避免杂菌杂藻的影响。
(3)上述通过步骤3培养后获得的株高30cm以上、根系发达的健康苦草植株，作为饵料投放于鱼虾蟹塘，需根据实际食用量，以免苦草剩余太多腐烂污染水质。
(4)通过上述步骤3培养后获得株高30cm以上、根系发达的健康苦草植株，移植到水生植被恢复重建的工程区。根据水体实际的退化程度，决定其栽种量和栽种密度，可采用单一物种移植或者和其他物种的混合移植。
本发明的效果在于(1)获得了苦草的无菌苗。野外采集的苦草原材料本身污染严重，而本方法先用较温和的肥皂水洗涤浸泡，然后在流水下冲洗以初步降低污染，然后通过0.1％的升汞彻底灭菌，在培养液①中培养。该灭菌方法可以保证无菌率达80％，存活率达60％以上。
(2)建立了苦草工程苗快速繁殖途径。经过一段时间的驯化培养，苦草每2周在培养基②与覆盖培养液③的培养条件下芽增殖率达1∶5以上。而每个新生的小苗，可以继续进行以上的芽增殖操作。方法简单，操作方便，而且所用的试剂均为常规化工产品，成本低廉，有利于大规模的工厂化生产。而且本方法是利用苦草的营养繁殖，避免了遗传变异的可能性。
本项发明可不分季节，随时为湖泊植被恢复、鱼虾蟹塘养殖、有关利用苦草进行的生理生态实验以及室内水族观赏布景、提供足够的苦草优质工程苗。
具体实施例方式
实例1.于2003年11月从苏州东太湖采得苦草种源，剪取匍匐茎上膨大的根茎小段50个，用肥皂水浸泡2h，再用自来水洗净，流水下冲洗过夜。在超净工作台中，用0.1％的升汞经过一定时间的彻底灭菌，用无菌水洗净，接种于培养液①中。在组培室中培养。平均光照强度2000lx，每日光照10h，温度25℃左右。2周内除去剔除的染菌及死亡材料18株，其余32株均能生长。将健康的成苗转接到培养基②中并覆盖培养液③，继续在组培室中培养，苦草开始芽增殖。以后每隔20天将单株苦草转接进行芽增殖。2个月后，取出小苗20株，用自来水洗净直接应用于室内水族缸布景。
实例2.将上述的培养材料洗净移栽到铺有灭过菌的沙石的玻璃缸中，并在温室中培养。每周换水且补充Hoagland营养液以壮苗。该批材料被应用于太湖河口富营养化水体生态修复工程中，面积1,000m2。
权利要求
1.一种苦草无菌苗培养及其工程苗快速扩繁的方法，其特征为该方法由以下步骤组成(1)取用苦草的可繁殖器官根茎，经过一系列灭菌过程，在培养液①中培养获得苦草无菌苗；(2)将无菌苗接种于以Ms为基本成分并附加有一定量激素的培养基②中并覆盖一层培养液③，以诱导生芽，并每隔20天将新生无菌苗重复步骤(2)直至获得足够多的材料。(3)将步骤(2)中培养获得的小苗，待根系发达后转到大玻璃缸，补充Hoagland营养液继续壮苗，直到植株长至30cm以上。
2.根据权利要求1所述方法，其特征是培养液①为(1/2-1)×Ms的基本元素，0.00-4.00mg/L，0.00-2.00mg/L和0.00-2.00mg/L的6-BA，2，4-D和NAA；②为(1/2-1)×Ms的基本元素+0.8％琼脂，0.00-4.00mg/L，0.00-2.00mg/L和0.00-2.00mg/L的6-BA，2，4-D和NAA；③为1×Ms的基本元素，0.00-4.00mg/L，0.00-2.00mg/L和0.00-2.00mg/L的6-BA，2，4-D和NAA。
3.根据权利要求1所述方法培养的苦草工程苗在湖泊植被恢复工程中的应用。
4.根据权利要求1所述方法培养的苦草工程苗在鱼虾蟹养殖过程中的应用。
5.根据权利要求1所述方法培养的苦草工程苗在室内观赏水族养殖过程中的应用。
6.根据权利要求1所述方法培养的苦草工程苗在有关苦草生理生态实验中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。涉及一种快速繁殖苦草优质工程苗的方法，运用苦草组织培养方法，通过扩繁获得大量的优质工程苗，以克服在水生植被恢复工程中大量移植苦草对原产地产生不良影响的问题，以及自然环境中苦草种源有限并且污染严重的问题。苦草不仅为鱼虾蟹提供饵料和产卵避难的场所，而且作为先锋物种，在湖泊水生生态系统恢复和重建工程中有着重要的作用。针对目前水生生态系统退化严重的现状，本方法的出现，无疑有着重要的意义。
文档编号A01H4/00GK1623374SQ200410066029
公开日2005年6月8日 申请日期2004年12月14日 优先权日2004年12月14日
发明者安树青, 周长芳, 蒋金辉, 孙志毅, 钱程 申请人:南京大学