专利名称：复合型玉米种衣剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种复合型玉米种衣剂及其制备方法，本玉米种衣剂由多种具较强抑菌活性的拮抗木霉菌和内生细菌、化学农药克百威和烯唑醇以及相关助剂复配加工而成，用于防治玉米土传病害、促进玉米生长。
背景技术：
玉米土传病害一直被视为顽疾，上世纪90年代以来又有逐年加重的趋势。一般年份发病率大约在10-30％，严重年份甚至可达60％以上，使得玉米的产量显著降低；特别是丝黑穗病在一些地区甚至造成绝收。目前玉米土传病害的防治上，主要采用化学种衣剂进行种子包衣，如多菌灵、福美双、三唑醇等，杀菌剂有效成分含量高达20％以上，易引起人畜及作物本身中毒；而生物型种衣剂仅以生防菌作为其活性成份，易受环境因素影响，药效缓慢且不稳定，推广应用面积有限。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种复合型玉米种衣剂及其制备方法，制备的复合型玉米种衣剂能在降低化学农药的残留和药害的同时，有效防治玉米主要土传病害、促进玉米生长。
为实现这样的目的，本发明利用具有较强生物防治能力的活性成分拮抗木霉菌和拮抗内生细菌菌株，分别加以培养后，与化学农药克百威和烯唑醇，相关助剂十二烷基苯磺酸钠、羧甲基纤维素钠、罗丹明B和聚乙二醇，添加剂SA(诱抗剂水扬酸)和无机离子，复配制得含重量百分比为5％的化学原药的种衣剂，可成功防治玉米茎基腐病、丝黑穗病菌、纹枯病菌等土传病害。
本发明的复合型玉米种衣剂的组分除蒸馏水外，以重量百分比计，包含化学原药烯唑醇2％，克百威3％；助剂十二烷基苯磺酸钠(助剂1)1.5％，羧甲基纤维素钠(助剂2)2％，罗丹明B(助剂3)1％，聚乙二醇(助剂4)2％，SA水杨酸0.01％；
无机离子K2HPO31％，MgSO40.1％，CaCO30.1％，ZnSO40.01％，四硼酸钾0.01％。
拮抗木霉菌孢子浓度为108个/毫升，拮抗内生细菌浓度为1010cfu/毫升。
本发明的复合型玉米种衣剂制备方法按如下步骤进行1.拮抗内生细菌的培养将拮抗内生细菌接种于改进的LB(蛋白胨-酵母膏-氯化钠)液体培养基中，25℃135rpm培养4天后，5000rpm离心5分钟，弃上清液，用无菌蒸馏水洗涤沉淀，5000rpm离心5分钟，弃上清液，洗涤3次后用少量无菌蒸馏水悬浮菌体，得到拮抗内生细菌菌悬液，用于复合型种衣剂的配制。
2.拮抗木霉菌的培养将拮抗木霉菌按常规方法接种于改良的PDA(马铃薯—葡萄糖—琼脂)(大量生产时，可采用小麦粒培养基)培养基上，于25℃下培养4-6天，菌落表面大量产生分生孢子，用无菌蒸馏水将孢子洗下(5000rpm离心10分钟)，反复洗孢子三次，配成高浓度的拮抗木霉菌孢子悬液，用于复合型种衣剂的加工。
3、以重量百分比计，将化学原药2％烯唑醇、3％克百威粉碎、研磨，并与1.5％十二烷基苯磺酸钠(助剂1)、0.01％水杨酸及无机离子K2HPO31％，MgSO40.1％，CaCO30.1％，ZnSO40.01％，四硼酸钾0.01％混合，加入蒸馏水搅拌均匀。
4、在上述混合液中依次加入重量百分比为2％的羧甲基纤维素钠(助剂2)、1％的罗丹明B(助剂3)、2％的聚乙二醇(助剂4)，搅拌成均匀的黏稠液，进行液体研磨。
5、分别将步骤1和步骤2得到的拮抗内生细菌菌悬液及拮抗木霉菌孢子悬液加入到研磨好的上述黏稠液中，振荡混合均匀，调节拮抗内生细菌终浓度为1010cfu/毫升，拮抗木霉菌孢子浓度为108个/毫升。得到复合型玉米种衣剂。
本发明中种衣剂活性成分之一拮抗木霉菌菌株系采用土壤稀释法从玉米根际土壤分离纯化获得、经平板对峙法多次筛选得到的对肿囊腐霉(Pythiuminflatum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、串珠镰孢菌(F.moniliforme)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)有较强抑制能力的菌株。
种衣剂另一活性成分拮抗内生细菌系采用平板稀释法分离自玉米根部、并经平板抑菌试验筛选获得的对上述四种病原真菌(肿囊腐霉、禾谷镰孢菌、串珠镰孢菌和立枯丝核菌)具有明显抑制作用的细菌菌株。
本发明为避免木霉菌菌株间的抑制、更好地发挥其协同拮抗病原菌的作用，同时为了避免内生细菌菌株间相互抑制而降低内生定殖能力，分别测定拮抗木霉菌菌株相互间及拮抗内生细菌相互间的亲和性，筛选出亲和性好的拮抗木霉菌和亲和性好的内生细菌菌株作为复合型种衣剂生产使用的菌株。木霉菌菌株包括TS2、TB9和T21；拮抗内生细菌菌株有B20-006和B21-070。
本发明为玉米土传病害的可持续生态化防治提供一种新的方法，可成功防治玉米丝黑穗病、玉米茎基腐病、玉米纹枯病等土传病害。其中对玉米丝黑穗病的防效与化学型种衣剂20％黑穗净相当。
本发明所得的复合型玉米种衣剂，能有效防治玉米主要土传病害、促进玉米生长，克服单一使用化学种衣剂易引起药害和农药残留、以及单一使用生物型种衣剂防病效果不理想等方面的不足，既具有与常规种衣剂相当的防治效果，又降低了化学农药的用量，适合于玉米病害的持续生态化控制。
具体实施例方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例11.拮抗内生细菌的培养将拮抗内生细菌B20-006接种于改进的LB液体培养基中，25℃135rpm培养4天，5000rpm离心5分钟，弃上清液，用无菌水洗涤沉淀，再5000rpm离心5分钟，弃上清液，洗涤3次后用少量无菌蒸馏水悬浮菌体备用。
2.拮抗木霉菌的培养将拮抗木霉菌T21接种于改良的PDA固体培养基上(大量生产时，可采用小麦粒培养基)，25℃下培养6天后，菌落表面产生大量分生孢子，用无菌蒸馏水将孢子洗下，5000rpm离心10分钟，弃上清，重洗沉淀，反复3次，然后配成高浓度的孢子悬液备用。
3.以重量百分比计，将化学原药2％烯唑醇、3％克百威粉碎、研磨，并与1.5％十二烷基苯磺酸钠(助剂1)、0.01％水杨酸及无机离子K2HPO31％，MgSO40.1％，CaCO30.1％，ZnSO40.01％，四硼酸钾0.01％混合，加入300毫升蒸馏水搅拌均匀。
4.在上述混合液中依次加入重量百分比为2％的羧甲基纤维素钠(助剂2)、1％的罗丹明B(助剂3)、2％的聚乙二醇(助剂4)，搅拌成均匀的黏稠液，进行液体研磨。
5.分别将步骤1和步骤2得到的拮抗内生细菌菌悬液及拮抗木霉菌孢子悬液加入到研磨好的上述黏稠液中，振荡混合均匀，调节拮抗内生细菌终浓度为1010cfu/毫升，拮抗木霉菌孢子浓度为108个/毫升，加蒸馏水补足500毫升，即得到复合型玉米种衣剂。田间对丝黑穗病防效可达80.0％实施例21.拮抗内生细菌的培养将拮抗内生细菌B21-070接种于改进的LB液体培养基中，25℃135rpm培养4天，5000rpm离心5分钟，弃上清液，用无菌蒸馏水洗涤沉淀，再5000rpm离心5分钟，弃上清液，洗涤3次后用少量无菌蒸馏水悬浮菌体备用。
2.拮抗木霉菌的培养将拮抗木霉菌TS2接种于改良的PDA固体培养基上(同上)，25℃下培养6天后，菌落表面产生大量分生孢子，用适量无菌蒸馏水将分生孢子洗下，5000rpm离心10分钟，弃上清，重洗沉淀，反复3次，然后配成高浓度的孢子悬液备用。
3.以重量百分比计，将化学原药2％烯唑醇、3％克百威粉碎、研磨，并与1.5％十二烷基苯磺酸钠(助剂1)、0.01％水杨酸及无机离子K2HPO31％，MgSO40.1％，CaCO30.1％，ZnSO40.01％，四硼酸钾0.01％混合，加入500毫升蒸馏水搅拌成均匀的黏稠状液体。
4.在上述混合液中依次加入重量百分比为2％的羧甲基纤维素钠(助剂2)、1％的罗丹明B(助剂3)、2％的聚乙二醇(助剂4)，搅拌成均匀的黏稠液，进行液体研磨。
5.分别将步骤1和步骤2得到的拮抗内生细菌菌悬液及拮抗木霉菌孢子悬液加入到研磨好的上述黏稠液中，振荡混合均匀，调节拮抗内生细菌终浓度为1010cfu/毫升，拮抗木霉菌孢子浓度为108个/毫升，加无菌蒸馏水补足1000毫升，即得到复合型玉米种衣剂，田间对丝黑穗病的防效可达90.0％。
权利要求
1.一种复合型玉米种衣剂，其特征在于种衣剂的组分除蒸馏水外，以重量百分比计，包含烯唑醇2％，克百威3％，十二烷基苯磺酸钠1.5％，羧甲基纤维素钠2％，罗丹明B 1％，聚乙二醇2％，水杨酸0.01％，K2HPO31％，MgSO40.1％，CaCO30.1％，ZnSO40.01％，四硼酸钾0.01％，拮抗木霉菌孢子浓度为108个/毫升，拮抗内生细菌浓度为1010cfu/毫升。
2.一种复合型玉米种衣剂的制备方法，其特征在于按如下步骤进行1)拮抗内生细菌的培养将拮抗内生细菌接种于蛋白胨—酵母膏—氯化钠液体培养基中，25℃ 135rpm培养4天后，5000rpm离心5分钟，弃上清液，用无菌蒸馏水洗涤沉淀，5000rpm离心5分钟，弃上清液，洗涤3次后用无菌蒸馏水悬浮菌体，得到拮抗内生细菌菌悬液；2)拮抗木霉菌的培养将拮抗木霉菌接种于马铃薯—葡萄糖—琼脂PDA培养基上，于25℃下培养4-6天，菌落表面大量产生分生孢子，用无菌蒸馏水将孢子洗下，配成高浓度的拮抗木霉菌孢子悬液；3)以重量百分比计，将化学原药2％烯唑醇、3％克百威粉碎、研磨，并与1.5％十二烷基苯磺酸钠、0.01％水杨酸及K2HPO31％、MgSO40.1％、CaCO30.1％、ZnSO40.01％、四硼酸钾0.01％混合，加入蒸馏水搅拌均匀；4)在上述混合液中依次加入重量百分比为2％的羧甲基纤维素钠、1％的罗丹明B、2％的聚乙二醇，搅拌成均匀的黏稠液，进行液体研磨；5)分别将步骤1和步骤2得到的拮抗内生细菌菌悬液及拮抗木霉菌孢子悬液依次加入到研磨好的上述黏稠液中，振荡混合均匀，调节拮抗内生细菌终浓度为1010cfu/毫升，拮抗木霉菌孢子浓度为108个/毫升，得到复合型玉米种衣剂。
3.根据权利要求2的复合型玉米种衣剂的制备方法，其特征在于所述木霉菌菌株包括TS2、TB9和T21，系采用土壤稀释法从玉米根际土壤分离所得、采用平板对峙法筛选出的对肿囊腐霉、禾谷镰孢菌、串珠镰孢菌以及立枯丝核菌具有明显抑菌活性的菌株，并经过亲和性测定最终选定的菌株。
4.根据权利要求2的复合型玉米种衣剂的制备方法，其特征在于所述拮抗内生细菌菌株包括B20-006和B21-070，系采用平板稀释法分离自玉米根部、并经平板抑菌试验筛选获得的对肿囊腐霉、禾谷镰孢菌、串珠镰孢菌以及立枯丝核菌具有明显抑制作用的细菌菌株，并经过亲和性测定最终选定的菌株。
全文摘要
本发明涉及一种复合型玉米种衣剂及其制备方法，将化学农药烯唑醇、克百威以及十二烷基苯磺酸钠、水杨酸及无机离子，四硼酸钾混合，加入蒸馏水搅拌均匀后，再加入助剂羧甲基纤维素钠、罗丹明B、聚乙二醇，搅拌成均匀的黏稠液，进行液体研磨，然后加入分别经培养后得到的拮抗内生细菌菌悬液及拮抗木霉菌孢子悬液，振荡混合均匀，调节拮抗内生细菌终浓度和拮抗木霉菌孢子浓度，复配制得含重量百分比为5％的化学原药的复合型玉米种衣剂。本发明所得的种衣剂既具有与常规种衣剂相当的防治效果，又降低了化学农药的用量，适合于玉米病害的持续生态化控治，可防治玉米丝黑穗病、茎基腐病、纹枯病等土传病害。
文档编号A01C1/06GK1718000SQ20051002869
公开日2006年1月11日 申请日期2005年8月11日 优先权日2005年8月11日
发明者陈捷, 郑俊强, 徐书法, 高增贵, 程根武 申请人:上海交通大学