专利名称：一种活性发酵液及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有杀线虫活性的发酵液及其应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)属线虫纲(Nematoda)、垫刃目(Tylenchida)、滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)。松材线虫(B.xylophilus)是世界松林的恶性疫病，造成松林成片枯死，被称为松树的“灭绝者”，“无烟的森林火灾”。该病发病期短、病树死亡快、易传播、难防治，造成重大的生态灾难。松材线虫病在日本、美国普遍发生，在韩国、加拿大和墨西哥等多个国家也有分布。我国于1982年在南京首次发现，目前在江苏省、广东省、浙江省、安徽省、云南省和山东等地区都有分布，发病面积7.3hm2，直接经济损失18.2亿元，造成的间接森林生态效益损失约216亿元。
现有松材线虫病的防治方法包括化学防治、抗病育种、防治传媒昆虫天牛以及病死木的处理等，但效果都不明显或有其局限性。传统的育种方法因耗时间太长而很难操作，对传媒昆虫天牛的药剂喷杀易造成林间污染，化学药剂因其对环境产生的污染而逐步被禁用。因此，从自然界中寻找防治松材线虫病的天然药剂成为松材线虫防治中关键。微生物是产生活性天然产物的主要源泉之一，从微生物的代谢产物中寻找具有对松材线虫有毒杀活性的天然产物成为研究的热点之一。
发明内容
本发明的目的是从细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中制备具有强抑制松材线虫(B.xylophilus)作用的发酵液，用于开发高效低毒杀松材线虫(B.xylophilus)的生物制剂。
本发明是这样实现的1、制备活性发酵液该活性发酵液经如下步骤得到a.生产菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C2，该菌株已于2005年2月28日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1318。
b.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C2采用牛肉膏蛋白胨培养基和葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基保存和培养，培养基配方为牛肉膏蛋白胨试管培养基为牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂18g、水1000ml，pH7.5；
牛肉膏蛋白胨液体发酵培养基为牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、水1000ml，pH7.5；葡萄糖牛肉膏蛋白胨试管培养基为葡萄糖10.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂18g、水1000ml，pH7.5；葡萄糖牛肉膏蛋白胨液体发酵培养基为葡萄糖10.0g，牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml，pH7.5；将C2菌株保存在牛肉膏蛋白胨培养基或葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基上，使用时先在液体培养基上活化36小时。
c.将活化后的C2菌种100μl接种于装有80ml-120ml液体牛肉膏蛋白胨培养基或葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的250ml三角瓶中，在温度为25℃-37℃，静置或转速为120-180rpm的条件下培养48-72小时，即可得到培养液。
d.将上述培养液在转速8500rpm下离心10分钟后，取上清放入4℃的冰箱中就得到活性发酵液。
2、制备试验用的松材线虫(B.xylophilus)将真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接种到马铃薯培养基(马铃薯200.0g，葡萄糖20g，琼脂18g，水1000ml)平板上，25℃培养至长满平板，接入一块带有松材线虫的培养基，在25℃下培养至菌丝消失，线虫长满平板后放入4℃冰箱中备用。使用时将载有线虫的培养基挑出，用无菌水将线虫洗出后，离心浓缩，制备成浓度为10000条/每毫升的线虫悬液。
3 试验方法液体浸泡法取2ml测试样品溶液、20μl含有200条线虫的悬液于直径为6cm的培养皿中，轻轻混匀后将培养皿放置于25℃的培养箱中。在解剖镜下随机选择10个视野，于定12小时、24小时、36小时和48小时分别进行观察，计数病虫数(以线虫不动作为标准，辅以机械刺激，如针尖挑刺等)和总线虫数。每个测试样品设三个重复，并以未接种菌株的培养基为对照进行校正，得到测试样品对线虫的致死率，以致死率高低评定样品对线虫的毒力。
本发明的活性发酵液具有制备方法简单，高效低毒，综合性状好，易于工业化生产等优点，可作为制备生物农药杀线剂应用。
具体实施例方式下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一将活化后的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)C2 100μl接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中(250ml三角瓶装80ml培养基)，于25℃，180rpm条件下培养72小时。将培养液8500rpm离心10分钟后，取上清作为测试样品做活性使用。结果见表1。
表1 C2菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的发酵液对松材线虫的活性
结果表明本发明的发酵液对松材线虫(B.xylophilus)有很好的毒杀作用，其发酵原液对线虫具有强的抑制作用，24小时对松材线虫(B.xylophilus)的致死率达78.6％，36小时达到92.5％以上，48小时达到94.3％。
实施例二基本同实施例一，不同之处是发酵时为静置培养；250ml三角瓶装100ml培养基，37℃培养60小时所得的发酵上清液作为测试样品。活性结果见表2。
表2 C2菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上静置培养的发酵液对松材线虫的活性
结果表明本发明的发酵液对松材线虫(B.xylophilus)有一定的毒杀作用，其发酵原液对线虫具有较强的抑制作用，36小时对松材线虫(B.xylophilus)的致死率达67.3％，48小时达到78.2％。
本例试验与前例采用的方法基本相同，主要是培养方式不同。本例主要是静置培养，在37℃下培养60小时后产生了不同的结果。本例试验获得的发酵液对松材线虫的活性显著低于前例，表明本活性发酵液在大规模生产时，须采用发酵罐培养。
实施例三基本同实施例一，不同之处是所用的培养基为液体葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基，培养温度为30℃，120rpm培养48小时，每250ml三角瓶装120ml培养基。活性结果见表3。
表3 C2菌株在葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基上的发酵液对松材线虫的活性
结果表明本发明的发酵液对松材线虫(B.xylophilus)有良好的毒杀作用，其发酵原液对线虫具有强的抑制作用，36小时对松材线虫(B.xylophilus)的致死率达72.4％，48小时达到80.5％。本结果与C2菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的发酵液相比，对松材线虫的活性较弱，但也具有明显的毒杀线虫的作用，说明该菌易培养产生对线虫有活性的物质。本发明的活性发酵液可作为制备生物农药杀线剂应用。
权利要求
1.一种活性发酵液，其特征在于该活性发酵液经如下步骤得到a.生产菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C2，该菌株已于2005年2月28日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1318；b.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C2采用牛肉膏蛋白胨培养基和葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基保存和培养，培养基配方为牛肉膏蛋白胨试管培养基为牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂18g、水1000ml，pH7.5；液体发酵培养基为牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、水1000ml，pH7.5；葡萄糖牛肉膏蛋白胨试管培养基为葡萄糖10.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂18g、水1000ml，pH7.5；液体发酵培养基为葡萄糖10.0g、牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、水1000ml，pH7.5；将C2菌株保存在牛肉膏蛋白胨培养基或葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基上，使用时先在液体培养基上活化36小时；c.将活化后的C2菌种100μl接种于装有80ml-120ml液体牛肉膏蛋白胨培养基或葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的250ml三角瓶中，在温度为25℃-37℃，静置或转速为120-180rpm的条件下培养48-72小时，即可得到培养液；d.将上述培养液在转速8500rpm下离心10分钟后，取上清液即得到活性发酵液。
2.权利要求1所述的活性发酵液的应用，其特征在于该活性发酵液对松材线虫(B.xylophilus)具有毒杀作用，可作为制备毒杀松材线虫制剂的应用。
全文摘要
一种活性发酵液及其应用，属生物农药技术领域。由如下步骤得到a.生产菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)C2，该菌株已于2005年2月28日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1318；b.将枯草芽孢杆菌(B.subtilis)保存在固体牛肉膏蛋白胨培养基或葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基上，使用时在液体培养基上活化36小时；c.发酵时接种100μl活化菌种于装有80ml－120ml液体牛肉膏蛋白胨培养基或葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的250ml三角瓶中，在温度为25℃－37℃、静置或转速120－180rpm的条件下培养48－72小时，即可得到培养液；d.将上述培养液在转速8500rpm下离心10分钟后，取上清放入4℃的冰箱中就得到活性发酵液。该活性发酵液对松材线虫具有毒杀作用，可作为制备毒杀松材线虫制剂的应用。
文档编号A01P5/00GK1817139SQ20061001068
公开日2006年8月16日 申请日期2006年2月14日 优先权日2006年2月14日
发明者李国红, 张克勤, 周薇 申请人:云南大学