专利名称：细胞贮藏介质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特殊的贮藏人类细胞的方法、 一种用于细胞贮藏的细胞 介质以及这种细胞介质在细胞贮藏中的应用。本发明可使细胞在贮藏过程中 保持活性。
背景技术：
低温贮藏是一种常用的长时期贮藏活细胞的方法。近十年来，低温贮藏 技术不断地得到发展和进步。有时，也有短时期贮藏细胞的需要，如细胞刚 刚从器官中被分离出之后，冷冻之前或者在低温贮藏后的解冻过程中或解冻 后。经这样的短期贮藏后，细胞通常又需重新植入受试对象内，尤其是人体 内。细胞植入可以通过诸如静脉注射植入细胞来完成。将贮藏后的细胞，尤 其是低温保藏后的细胞植入人体可专门用于临床应用，特别是用于治疗性应 用。例如，已有经静脉给药进行人体肝细胞移植用于治疗的例子。然而，在 冷冻过程、解冻过程以及在这之前或之后的生物体外贮藏过程中，保持贮藏 细胞的细胞活性以及活细胞的数量仍然是一个难题，尤其在临床应用中。发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞介质，该细胞介质易于制 备，成本低廉，可用于贮藏动物细胞，尤其适用于人类细胞，特别是肝细胞 或用于移植的肝细胞。这些细胞最好在相关低温贮藏的冷冻前和/或解冻后进 行贮藏。因此，本发明的目的就是提供一种细胞介质，其可用于短期贮藏动 物细胞，尤其适用于人类细胞，特别是肝细胞或用于移植的肝细胞，并且该 细胞介质可将细胞活力的降低和细胞中活细胞数量的减少降低到尽可能低的程度，从而为现有的细胞介质提供另一种选择。目前，已有多种与低温贮藏结合使用的用于贮藏和再解冻的细胞介质。 但它们含有一些被法律禁止使用或不适宜注入人体，尤其不适宜静脉注射的成分，如5% 20%胎牛血清(FCS)。因此，本发明的另一个要解决的技术问题是提供一种细胞介质，其可无风险的用于细胞植入动物体，尤其是人体， 并且同时可将细胞活力的降低和细胞中活细胞数量的减少降低到尽可能低 的程度，尤其适用于人类细胞，特别是肝细胞和用于移植的肝细胞。例如，库司托啶(Custodiof)被成功地作为细胞介质使用，如贮藏经低温贮藏后解冻的细胞，如肝细胞。它还被开发作为整体器官移植中的一种 保存液。然而，法律规定库司托啶不能用于人体静脉注射。因此，本发明的 另一个要解决的技术问题是提供一种用于短期贮藏细胞的细胞介质，其尤其 可与低温贮藏相结合使用，允许经静脉注射入人体，因而在该细胞介质中， 解冻后的细胞无需复杂的会减少活细胞数量的清洗步骤，就可直接经静脉注 射植入人体中。根据权利要求书，本发明所要解决的的技术问题主要是提供一种短期贮 藏动物或人类细胞的方法。在优选实例中，细胞贮藏于一种含有盐溶液的液 体细胞介质中，所述的盐溶液较佳的选自含有氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、 氯化钾、氯化镁，以及柠檬酸钠的盐溶液，和/或含有乳酸林格氏液的盐溶液， 和/或磷酸盐缓冲盐水，和/或高分子糖的水溶液，特别是羟乙基淀粉和葡萄 糖以及血清蛋白和/或血浆。在优选实施例中，动物细胞是哺乳动物细胞，如猪细胞、牛细胞或鼠细 胞，优选人类细胞。本发明中，术语"细胞"还包括细胞悬浮液和用于移植 的细胞。细胞可以全部是一种类型的细胞，也可以是一种细胞组合物和/或不 同细胞类型的共培养物。本发明中的动物细胞优选的用于治疗性给药。在另一优选实施例中，这 些动物细胞用于体外培养，如肝(实质)细胞、郎格罕氏岛(胰岛)、关节 软骨细胞、软骨细胞、神经细胞、角化细胞或淋巴细胞。这些用于在细胞介质中贮藏的细胞最佳的为肝细胞，尤其是肝(实质)细胞。本发明中，术语"肝细胞"指主要由肝(实质)细胞组成的混合物，也 可包含不同数量的淋巴细胞。内皮细胞和其它的非薄壁细胞群也可包含于其 中。本发明不包括解冻和/或贮藏凝血细胞(也称血小板)。在本发明中，血 小板被认为不是动物细胞。本发明中，短期贮藏指在发明的介质中体外贮藏至多24小时，较佳的为10小时，更佳的为5小时，最佳的为3小时。低温贮藏通常指在O匸以下，尤其是-2(TC -20(TC之间长期贮藏细胞。 冷冻速率通常是TC/min。本发明中所述的细胞介质，也被称为介质、解冻介质或培养介质，特指 一种液体水溶液。细胞介质能体外贮藏活细胞，同时尽可能高的保持活细胞 数量，即细胞最低可能的死亡率和最高可能的活力(对所属领域的技术人员 来说也可称为活性)。本发明的细胞介质中的成分经法律允许可用于动物体，尤其是人体的给 药，特别是静脉注射。本发明中，细胞在本发明的介质中贮藏后可用于临床 应用，尤其是治疗性应用，或者体外实验。本发明中，术语"盐溶液"指含有一种或多种盐的水溶液。本发明中， 盐溶液优选为含有氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁和柠檬酸 钠的盐溶液。这些盐溶解在水中。使用的水为无菌水，优选的为注射用去离 子水。本发明中，盐溶液优选Composo严和/或含Composol⑧组合物的溶液。 Composo严是一种含氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠，氯化钾、六水合氯化镁 和柠檬酸钠的水溶液。本发明优选其含有173mmo/L钠，5mmol/L钾，1.5 mmol/L镁，98mmol/L氯化物，10.9 mmol/L拧檬酸盐，27 mmol/L醋酸盐 初23 mmol/L葡萄酸盐的溶液。本发明中的盐溶液的优选组成含0.45 0.60 wt% (wtV。为重量百分比)，更优选0.53 wt。/。的氯化钠；0.45 0.55 wt%，更优选0.50 wt%葡萄糖酸钠； 0.20 0.25 wt%，更优选0.22 wt%醋酸钠；0.03 0.04 wt%，更优选0.037 wt% 氯化钾；0.025 0.035 wt%，更优选0.031 wt%六水合氯化镁和0.31 0.33 wt%，更优选0.32 wt%柠檬酸钠。盐溶液pH值优选为7.0 7.4，更优选7.2。在另一实施例中盐溶液为乳酸林格氏液。本领域技术人员熟悉乳酸林格 氏液的常规组成。乳酸林格氏液是含有氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠的 水溶液。本发明中使用的乳酸林格氏液的pH值为7.0 7.4，优选7.2。在另一实施例中盐溶液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。本领域的技术人员熟 悉PBS的通常组成。本发明中使用的PBS其pH值为7.0 7.4，优选7.2。在另一实施例中，介质的一种成分是含至少一种高分子糖的水溶液。本 发明中的高分子糖可包含如右旋糖酐，还可包含右旋糖酐溶液，如Perfadex、 羟乙基淀粉(HES)及其衍生物。本发明中，羟乙基淀粉为优选的高分子糖。本发明中，葡萄糖以固体或水溶液的形式加入细胞介质中。本发明中，血清蛋白以溶解的或液体的形式加入细胞介质中。血清蛋白 可为胎牛血清(FCS)，牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HAS)。根据本 发明，优选人血清蛋白，因为它经法律允许可静脉注射入人体中。在另一实施例中，血清蛋白被血浆补充或替代。本发明中，优选人血浆， 尤其是自体同源的。血浆和/或HSA特别的作为冷冻防护剂使用，较佳的可 单独使用或与其它已知的冷冻防护剂，尤其是DMSO结合使用。在另一实施例中，本发明的介质包含至少一种选自下述的额外成分氨 基酸、荷尔蒙、维生素、维他命原和抗凋亡的活性物质。在本发明提供的技术内容的指导下，本领域技术人员可根据他们的技术 知识和使用领域，选择合适的组分及组分的浓度。本发明的方法中，优选使用上述定义的pH值为6.4 8的细胞介质来完 成，更加优选pH为7.0 7.4的细胞介质，最佳优选pH为7.2的细胞介质。在本发明的细胞介质中从低温贮藏解冻后，较佳的将细胞进行清洗，从 保藏介质和本发明的细胞介质中分离，然后置于新鲜的本发明的细胞介质中贮藏。优选使用离心法分离细胞。本方法优选在2 4(TC下进行。细胞介质的温度优选为2 40°C。本方 法尤其优选在4"C下进行和/或使用的细胞介质的温度为4°C。在另一优选实 例中，本方法在1(TC下进行和/或使用的细胞介质的温度为l(TC。在另一更 加优选的实例中，本方法在25"C下进行和/或使用的细胞介质的温度为25°C。 在另一对更加优选实例中，本方法在37"C下进行和/或使用的介质的温度为 37°C。本发明涉及一种特殊的，用于短期贮藏动物或人类细胞，尤其是低温贮 藏后解冻的细胞的细胞介质，具体的涉及一种液体细胞介质，其含有氯化钠、 葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁、柠檬酸钠和葡萄糖，以及血清蛋白 和/或血浆。上述组分都溶于水中。一种优选的细胞介质含有氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、六水 合氯化镁、柠檬酸钠和葡萄糖，以及血清蛋白和/或血浆组成，上述组分都溶 于水中。 一种更优选的细胞介质含有0.45 0.60 wt。/o氯化钠，0.45 0.55 wt% 葡萄糖酸钠，0.20 0.25 wt。/o醋酸钠，0.03 0.04 wt。/。氯化钾，0.025 0.035 wt。/。六水合氯化镁和0.31 0.33 wt。/。柠檬酸钠，以及葡萄糖，和血清蛋白和/ 或血浆，后者溶于水中。细胞介质优选含有0.01 0.5 wt。/。葡萄糖，更优选0.1 0.2 wt。/。葡萄糖。本发明的细胞介质优选含有人血清蛋白。本发明中，人血清蛋白可用人 血衆替代，尤其是自体同源的血浆。在一优选实例中，细胞介质含有0.5 50wt。/。血清蛋白，尤其优选3 5 wt。/。血清蛋白。在另一优选实施例中，细 胞介质含有0.5 50wt。/o血浆，尤其优选3 5 wt。/。血浆。本发明的细胞介质pH值优选为6.0 8，更优选7.0 7.4，最优选7.2。本发明的细胞介质优选法律允许应用的成分，尤其是可经静脉注入动物 体内，尤其是人体内的成分。本发明的发明方法和/或发明的细胞介质的具体实施例的组合同样是优 选的。本发明还涉及本发明的细胞介质在短期贮藏低温贮藏后解冻的动物细 胞中的应用，尤其是采用本发明的方法。
图1:贮藏细胞(低温贮藏后)的活性随贮藏时间、使用的贮藏介质和 贮藏温度的变化；图例HH142:单批细胞制备的数量(一批)；温贮藏温度为18°C; 冷贮藏温度为4°C ; HES:介质2; PBS:介质5; CllStodiol :介质1; Composol : 介质4;乳酸林格氏液介质3;人血浆介质6;图2:贮藏细胞(低温贮藏前)的复苏率随贮藏时间、使用的贮藏介质 和贮藏温度的变化；图例参见图h图3:贮藏细胞(低温贮藏后)的活性随贮藏时间、使用的贮藏介质和 贮藏温度的变化；图例参见图l;图4:贮藏细胞(低温贮藏后)的活细胞数(VCC)随贮藏时间和使用 的贮藏介质的变化；图例参见图l;图5:贮藏细胞(低温贮藏前)的活细胞数(VCC)随贮藏时间和使用 的贮藏介质的变化；取3次单批细胞制备(3批)的中值；图例参见图1;图6:贮藏细胞(低温贮藏前)的活细胞数(VCC)随贮藏时间和使用 的贮藏介质的变化；取4次单批细胞制备(4批)的中值；图例参见图h图7A 7C:贮藏细胞(低温贮藏前)的复苏率和活细胞数(VCC)随贮 藏时间和使用的贮藏介质的变化；取3次单批细胞制备(3批)的中值；图 7C:与Custodiol(^100。/。)进行比较，取4个贮藏时间的平均值和3次单批细 胞制备(3批)的中值；图例参见图l。
具体实施方式
使用从特殊的冷冻袋或冷冻管中取出的低温贮藏的肝细胞为样品。 一次 细胞制备所得的冷冻管数量不够用于研究范围，所以这些冷冻管仅用于结果比较。所有的制备步骤都是在无菌环境中进行。加入细胞介质前，细胞悬浮 液已完全解冻。冷冻管解冻的时间与冷冻袋解冻时间无关。细胞介质被缓慢 地加入到取出的细胞中。为了得到可比较的结果，每个实验由至少2人，任选3人进行了平行实验。制备了以下的解冻介质 介质1: CllStodiol⑧(对比例)介质2:羟乙基淀粉(HES)+lg/L葡萄糖+4%^八(本发明实例) 介质3:乳酸林格氏液+lg/L葡萄糖+4%1 八(本发明实例) 介质4: Composol + 1 g/L葡萄糖+ 4% HSA (本发明实例) 介质5:磷酸盐缓冲盐水(PBS) +lg/L葡萄糖+4% HAS (本发明实例)介质6:人血浆(对比例)每次融化(一个解冻袋)大约需要50 ml细胞介质。人血浆在37。C温 水浴中解冻。在三个实验中，介质在37。C温水浴中至少温热15分钟(即"温"实验)。 在两个实验中，细胞介质在冰箱中冷却至少15分钟(即"冷"实验)。将6根50ml的试管根据将盛的溶液的不同分别贴上标签，然后存放于 室温下。在温实验中，细胞在18。C下以50g的速度离心5分钟；在冷实验中，细 胞在4'C下以50g的速度离心5分钟。小心地将冷冻袋从铝盒中取出。解冻采用下述方式持续摇动冷冻悬浮 液2-5分钟，直到看不见冰晶。整个过程不超过5分钟。取下冷冻袋的黄色 盖子，用Benjamix穿刺针刺破隔膜。将60ml的注射器接到冷冻袋的Benjamix 穿刺针上，然后抽取60ml细胞悬浮液。各取10ml细胞悬浮液分别加入6个准备好的试管中。再分别缓慢地加 入40ml相应的细胞介质。整个过程不超过5分钟。离心后清洗细胞。用Pasteur吸液管移去上清液。分别加入5ml相应的 细胞介质，小心摇晃，使细胞颗粒再次完全悬浮于细胞介质中。根据细胞数和活性计数细胞。每次细胞计数后进行肝细胞培养。 总贮藏时间为3小时，最后两个步骤每60分钟重复一次。 仅使用在低温贮藏前活性大于40%的肝细胞进行实验。实验至少重萆3 次，每次采用不同批次制备的细胞(多批)。每批至少解冻一袋。将每批次 的冷冻管的解冻结果进行对比。测试解冻溶液对每批细胞制备(多批)的影响。这些结果是通过测试解 冻后和在悬浮液中贮藏时细胞的活性和活细胞数(VCC)的参数得到的。对 于用于移植的肝细胞，介质温度和离心温度都设为4°C:使用HH142批次的 实验先进行一次"温"实验，然后重复进行"冷"实验(参见图1和图2)。 为了进一步分析，取两实验的平均值作为HH142批次实验的结果。 各自的结果如图3和图4所示。为保证每批样品的独立分析，对测试溶液贮藏的复苏参数和活细胞数参 数作了定义。该定义基于两个不同的出发点1、根据冷冻前的活细胞数的 复苏率(图5a); 2、根据清洗后的活细胞数的复苏率(图5b，在特殊贮藏 介质中0小时)。为比较这5种溶液，对3个批次测试的上述参数的中值进 行计算，并绘制在图5中。另外，还根据4个批次的中间值，选择两种溶液一Composo^和HES 一进行分析，分析结果绘制在图6中。为了更好地分析这些结果，采用了下述方法采用Custodiof的冷冻的 活细胞数的复苏参数定为100%。对于被测试的5批(对比例/本发明实例)， 计算了相对于Custodiof的该参数的百分偏差。(参见图7a和图7b)。清洗细胞后，三种溶液(PBS、 Composof禾n HES)立刻呈现出与 Custodio^的VCC复苏参数比较一致的结果(大于80%)。 Composol 的结 果比Custodiof更好(复苏率大于100%)。 一小时后，PBS的结果最好。但 两小时后，Composol 和人血浆的中值再次比Custodio产的中值好约10%。为了进一步比较，还做了另一种分析。计算了每种溶液四个时间点的平 均值(图7c， 0小时-3小时)。不考虑实验中流逝的时间，与Custodiof相比，HES和乳酸林格氏液损 失的活细胞数约为20%。但PBS、 Composol 和人血桨的结果与Custodiol 的结果类似(偏差小于10%)。
权利要求
1.一种短期贮藏动物细胞的方法，其特征在于细胞放置并且贮藏在一种液体细胞介质中，该介质包含a)一种盐溶液，其选自-一种盐溶液，尤其包含氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁和柠檬酸钠，-乳酸林格氏液和-磷酸盐缓冲盐水(PBS)，和/或一种高分子糖的水溶液，尤其是羟乙基淀粉，b)葡萄糖和c)血清蛋白和/或血浆。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述的细胞为低温贮藏的细胞，其经解 冻后在一细胞介质中清洗，然后从该细胞介质中分离，再放入一新鲜的细胞 介质中贮藏。
3. 根据上述任一权利要求的方法，其中该细胞介质的温度为2-4(TC。
4. 根据上述任一权利要求的方法，其中该细胞为肝细胞。
5. 根据权利要求4的方法，其中该细胞为肝实质细胞。
6. 根据上述任一权利要求的方法，其中该细胞为哺乳动物细胞。
7. 根据上述任一权利要求的方法，其中该细胞为人类细胞。
8. 根据上述任一权利要求的方法，其中该细胞为用于治疗性给药的细胞。
9. 根据权利要求1-7中任一权利要求的方法，其中该细胞用于体外培养。
10. —种如权利要求1所述的细胞介质的用途，其用于短期贮藏动物细 胞，尤其采用根据权利要求1-9中任一项所述的方法。
11. 一种用于短期贮藏动物细胞的细胞介质，其中该细胞介质包含溶解 在水中的a) 氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁和柠檬酸钠，b) 葡萄糖和c) 血清蛋白和/或血浆。
12. 根据权利要求11的细胞介质，其中所述的血清蛋白为人血清蛋白。
13. 根据权利要求11或12中的任一权利要求的细胞介质，其中所述的 血浆为人血浆。
14. 根据权利要求11-13中任一权利要求的细胞介质，其中该细胞介质包含0.45-0.60 wt%氯化钠 0.45-0.55 wt。/。葡萄糖酸钠 0.20-0.25 wt。/。醋酸钠 0.03-0.04 wt%氯化钾 0.025-0.035 wt°/。六水合氯化镁 和0.31-0.33 wt%柠檬酸钠。
15. 根据权利要求11-14中任一权利要求的细胞介质，其中该细胞介质 包含0.01-0.5 wt%，优选0.1-0.2 wt。/。葡萄糖。
16. 根据权利要求11-15中任一权利要求的细胞介质，其中该细胞介质 包含0.5-50 wt0/。，优选3-5 wt。/。血清蛋白。
17. 根据权利要求11-16中任一权利要求的细胞介质，其中该细胞介质 包含0.5-50 wt%，优选3-5 wt。/。血浆。
18. 根据权利要求11-17中任一权利要求的细胞介质，其中该细胞介质 的pH值为6.4-8，优选7.0-7.4。
19. 根据权利要求11-18中任一权利要求的细胞介质，其还包含至少一 种选自下述的额外成分氨基酸、荷尔蒙、维他命、维他命原和抗凋亡物质。
全文摘要
本发明特别涉及一种贮藏人类细胞的方法、一种用于贮藏细胞的细胞介质以及该细胞介质在细胞贮藏中的应用，本发明可在贮藏过程中保持细胞的活性。
文档编号A01N1/02GK101247720SQ200680030954
公开日2008年8月20日 申请日期2006年6月30日 优先权日2005年7月1日
发明者克拉斯米拉·亚历山德罗娃, 克里斯托夫·普里斯纳, 卡斯滕·格里泽尔, 卢博米尔·阿尔谢尼耶夫, 扎比内·克费尔特-卡斯汀, 汉斯·格尔德·霍伊夫特, 马克·巴托尔德 申请人:赛特耐特两合公司