色谱介质的制作方法

色谱介质的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种官能化的色谱介质，它适合于从流动相中分离生物分子。
【背景技术】
[0002] 生物技术行业在全球医药行业中增长最快，在2002年生物技术行业市场占有率为 10%，而到2012年已占据市场销售总额的20%($ 1530亿）。预计到2018年销售额将从2012 年的$ 1530亿增加到$ 2150亿，实现41%的增长。目前在市场上大约有200种单克隆抗体 (MAb)的产品和超过1000种临床试验，可见对于生物技术领域的技术进步的需要是显而易 见的。在过去十多年里，典型的生物分子的发酵效价(fermentation titres)已经从0.5 g / L增长到50 g / L，尽管下游纯化技术也获得了一些研究和发展，但该领域的进步未能 匹配上游的研发。在经济学方面，严重依赖于结合/洗脱的色谱单元操作对于生物分子(如 单克隆抗体)的下游加工的进步是关键的。色谱在生物分子的下游加工成本中占非常重要 部分，它反过来也影响生物分子本身的总成本。
[0003] 从历史上看，传统的填充床色谱法一直是一个非常强大的分离工具。然而，越来越 明显的是，从根本上说，必须采用新的系统以允许生物分子在制备后可被有效且经济地回 收。
[0004] 已经看到发展的一个领域是新配体的合成，以取代目前昂贵的亲和配体。
[0005]已经探索的另一条路线是对传统的支撑结构(如多孔珠填充床吸附剂）的改性。这 通常是为了解决与这样的吸附剂相关的缺陷，特别是与压降和驻留时间相关的问题。这些 缺陷通常导致低效的分离。开发允许不受流量约束地操作的新型吸附剂结构，具有增加生 产量的优势，但通常只在小规模上被证明是有用的。吸附剂积垢的问题很常见，这往往使色 谱分离技术要进行后期抛光操作。在考虑吸附剂孔径大小时必须权衡它的积垢和捕获能 力。具有锐穿透曲线的良好分离需要小孔隙，但它会导致积垢增加。相反，大孔隙吸附剂（10 μπι - 150+μπι)可能能够更好地处理积垢，但小的目标生物分子可能穿过这样的吸附剂而未 被结合。
[0006] 最近，有报道称，污染物捕获模式的膜色谱可作为潜在可行的替代方案。
[0007] 另一个研究焦点是整体式结构的开发，已经证明能够很好地分离大的生物分子 (例如质粒和病毒），这是由于其表面上存在相对较大的孔隙。目前行业倾向于使用一次性 系统的趋势有利于膜色谱的发展，因为一次性膜比一次性填充床柱更经济。
[0008] 另一个开发路线是进行连续处理。连续处理的开发可能使得在许多系统中实现高 效率。因此，连续操作提供了实时过程监控和自动化控制的机会，潜在的好处包括可预测产 品规格、降低劳动力成本、以及与其他连续过程的整合。然而，迄今为止很少有真正能实现 连续色谱操作的技术。
[0009] 因此，应当理解，存在多种不同的研究途径，以改进回收生物分子的方法。
[0010] 电纺聚合物纳米纤维具有的性质为解决在下游生物加工时用到的传统支撑基质 上观察到的问题提供了一种可能的解决方案。它们的性质容易导致自身结合支撑表面，从 而具有高容量和高传质速率操作的潜力，因此实现与具有高孔隙度和相对较小的表面孔径 的系统的不受流量约束的结合。
[0011]包含具有二乙氨基乙基（DEAE)官能的电纺聚合物纳米纤维的吸附剂小柱 (adsorbent cartridge)已有报道，其结合能力大约只有典型填充床系统的10%，但是流速 却是典型填充床的约50倍。这样的纳米纤维系统呈现的表面积与体积比与多孔串珠系统相 似。然而，现有的这种纳米纤维系统的结合能力稍低于典型的填充床系统。当相同的膜被多 次使用时，已知的纳米纤维系统也显示出差的重复性。这限制了它们在回收生物分子方面 的应用。
[0012] 因此，此前还不可能制备出这样的纳米纤维系统，即，它的结合能力超过传统填充 床的约10%，同时保持这类纳米纤维系统相关的孔隙率和强健的可再生操作。
[0013] 通过电纺丝生产的纳米纤维吸附剂系统的厚度在制造时受到限制，因为纳米纤维 沉积到一个接地的收集表面(earthed collector surface)，随着沉积的增加，而产生一个 较不接地的表面。因此，所沉积的纤维中的残余电荷，使得该区域难以继续沉积，导致纤维 在收集表面进一步扩散。这导致由电纺丝生产的纳米纤维垫的厚度被限制到约100-200μπι。 这些纳米纤维垫的有限厚度使得整个垫子在物理强度方面具有固有的限制，这限制了材料 在工艺应用(例如色谱)上的实用性。
[0014] 一种已知的纳米纤维吸附剂系统的描述参见Ma, et al, Journal of Membrane Science 265 (2005) 115-123。这篇文献描述了一种用于生产纤维素纳米纤维膜的方法， 它涉及热处理由醋酸纤维素纳米纤维构成的单层非织造纤维网；使用NaOH处理加热的醋酸 纤维素网；以及使用汽巴蓝(Cibacron Blue)官能化所产生的纤维素纤维。多个膜可被堆叠 在一起，边缘被胶粘在一起，并将该堆叠体放在一个过滤支架中。
[0015] 发明概述 从最广泛的意义上说，本发明提供了制备官能化的色谱介质的方法，该方法包括通过 物理的和化学的加工步骤的结合来处理一个或多个聚合物纳米纤维，从而产生适合于在色 谱法中作为色谱介质的官能化产品。
[0016] 现已发现，一个特定系列的物理和化学加工步骤大大增加了纳米纤维吸附剂系统 的结合能力，在常规的操作条件下，通常增加所述结合能力超过250%。还已发现，某些特定 的物理加工步骤可提高纳米纤维吸附剂系统的化学抵抗性(chemical resistivity)。这意 味着本发明的吸附剂系统可以在更苛刻的条件下使用，而且该吸附剂系统可以使用多次而 不损失性能。
[0017] 因此，本发明提供了一种制备官能化的聚合物色谱介质的方法，该方法包括 (I) 提供两个或更多的非织造片材，一个堆叠在另一个之上，每个所述片材包括一个或 多个聚合物纳米纤维； (II) 同时加热和压制该堆叠的片材，使相邻片材的纳米纤维之间的接触点熔合;以及 (III) 将所压制和加热的产品与试剂接触，所述试剂使步骤(Π )的产品官能化成为色 谱介质。
[0018] 更具体地，相邻片材的纳米纤维之间的接触点熔合包括一个片材的聚合物纳米纤 维的部分与相邻片材的聚合物纳米纤维的部分之间的接触点的熔合。通常情况下，这也包 括一个片材的聚合物纳米纤维的部分与相同纳米纤维的多个其他部分之间的接触点的熔 合。 本发明还提供了： -通过本发明方法可得到的官能化的色谱介质。
[0019] --种制备色谱分析小柱的方法，该方法包括实施本发明的方法和将所获得的产 品加入小柱中。
[0020] --种色谱分析小柱，其(a)可由所述方法获得，或(b)包括本发明的一种或多种 官能化的色谱介质。
[0021] -本发明的一种官能化的色谱介质或本发明的一种色谱分析小柱在色谱法中的 应用。
[0022] -种从流动相中分离一种或多种生物分子的方法，包括将流动相中的一种或多种 生物分子与本发明的一种官能化的色谱介质或色谱分析小柱接触。
[0023] 本发明还提供了一种制备聚合物介质的方法，该方法包括:如本发明所定义的，提 供两个或更多个非织造片材，一个堆叠在另一个之上;如本发明所定义的，每个所述片材包 括一个或多个聚合物纳米纤维，；以及，如本文所定义的，同时加热和压制堆叠的片材，以使 相邻片材的纳米纤维之间的接触点熔合。本发明还提供可由该方法获得的聚合物介质。
【附图说明】
[0024] 图1示出本发明的一种官能化的色谱介质在阴离子交换色层析中的性能。
[0025] 图2示出本发明的一种官能化的色谱介质在阴离子交换色层析中的性能。
[0026] 图3示出用于确定色谱分析膜的化学稳定性的实验设置。
[0027] 图4示出非本发明的膜以及本发明的膜暴露于氢氧化钠后的的照片。
[0028] 图5示出非本发明膜的以及本发明膜的厚度和密度。
[0029]图6示出不非本发明膜的和本发明膜的流动性质。
[0030]图7示出压力对本发明的膜的厚度和密度的影响。
[0031]图8示出压力对本发明的膜的流动性质的影响。
[0032]图9示出压力对本发明的膜的动态结合能力的影响。
[0033]图10示出官能化循环次数对本发明的膜的流动性质的影响。
[0034] 图11示出官能化循环次数对本发明的膜的动态结合能力的影响。
[0035] 图12示出了本发明的SP-官能化的膜的结合洗脱特性。
[0036] 图13示出了本发明的CM-官能化的膜的结合洗脱特性。
[0037] 图14示出了本发明的Q-官能化的膜的结合洗脱特性。
[0038]图15示出了本发明的蛋白A-官能化的膜的结合洗脱特性。
[0039] 图16示出本发明的苯基-官能化的膜的结合洗脱特性。
[0040] 图17示出非本发明的膜暴露于氢氧化钠后的照片。
[0041]图18示出非本发明的膜以及本发明的膜的厚度和密度。
[0042]图19示出非本发明的膜以及本发明的膜的流动性质。
[0043]图20示出非本发明的膜以及本发明的膜的动态结合能力。
[0044]图21示出本发明的膜在多次官能化循环后的照片(顶部图片）和非本发明的膜在 多次官能化循环后的照片(底部图片）。
[0045]发明详述 聚合物纳米纤维 本发明官能化的色谱介质由一个或多个聚合物纳米纤维形成。该聚合物纳米纤维通常 是电纺聚合物纳米纤维。这种电纺聚合物纳米纤维是本领域技术人员熟知的，它们的优化 的生产条件可参见，例如，〇· Hardick, et al, J.Mater. Sci. 46 (2011) 3890,其全部 内容通过引用并入本文。本发明的方法通常包括电纺聚合物的初始步骤，以产生一个或多 个聚合物纳米纤维。这可包括电纺聚合物，以产生一个或多个非织造片材，每个所述片材包 括一个或多个聚合物纳米纤维。
[0046] 本发明中使用的聚合物纳米纤维的平均直径通常为IOnm至1000 nm。对于某些应 用，合适的聚合物纳米纤维的平均直径为200nm至800nm。对于某些应用，合适的聚合物纳米 纤维的平均直径可为200nm至400nm〇
[0047] 本发明对所用的聚合物纳米纤维的长度没有特别限定。因此，常规的电纺方法可 生产出长度为几百米或甚至是几公里的纳米纤维聚合物。但是，通常该一个或多个聚合物 纳米纤维的长度可达10 km，优选为10 m至10 km。
[0048] 通常情况下，该一个或多个聚合物纳米纤维以一个或多个非织造片材形式提供， 每个片材包括一个或多个聚合物纳米纤维。包含一个或多个聚合物纳米纤维的非织造片材 是一个或多个聚合物纳米纤维的垫，其中每个纳米纤维的取向基本上是随机的，即，纳米纤 维并未采用特定的模式。包含聚合物纳米纤维的非织造片材通常通过公知技术提供，参见， 例如，〇· Hardick, et al, J.Mater. Sci. 46 (2011) 3890公开的技术。在某些情况下， 非织造片材可能由单个聚合物纳米纤维构成。作为选择，非织造片材可包含两个或更多个 聚合物纳米纤维，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个聚合物纳米纤维。
[0049]通常情况下，非织造片材的面密度为1~40 g/m2,优选为5~25 g/m2,某些情况下为1 ~20或5~15 g/m2。
[0050]通常情况下，非织造片材具有的厚度为5~120μηι，优选为10~100μπι，某些情况下为 50~90μπι，其他情况下为5~40、10~30或15~25μπι。
[0051]用于生产用于本发明的纳米纤维的聚合物并没有特别的限制，只要该聚合物是适 合于在色谱应用中使用即可。因此，通常情况下，该聚合物是适用作色谱法中的色谱介质 (即吸附剂）的聚合物。合适的聚合物包括聚酰胺(如尼龙）、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙 烯腈、聚苯乙烯、聚砜、聚己内酯、胶原、壳聚糖、聚环氧乙烷、琼脂糖、乙酸琼脂糖、纤维素、 醋酸纤维素以及它们的组合。优选的是纤维素和醋酸纤维素。
[0052]通常情况下，本发明的方法是用于制备官能化的纤维素色谱介质，该方法包括提 供一种或多种醋酸纤维素纳米纤维。优选地，该方法包括提供一个或多个非织造片材，每一 个片材包括一个或多个醋酸纤维素纳米纤维。醋酸纤维素易于电纺并且电纺后容易被转化 成纤维素。因此，该方法优选包括提供一个或多个非织造片材，每一个包括一个或多个电纺 醋酸纤维素纳米纤维。
[0053] 纳米纤维的物理改性 本发明的方法包括对非织造片材中的聚合物纳米纤维的物理改性，即在化学改性之 前，先进行加热和压制。这些步骤提高了材料的结构稳定性。压制和加热条件也可被改变， 从而改变所得材料的厚度和/或孔隙率。
[0054] 聚合物纳米纤维的多个非织造片材的使用使得能够制备出更厚的材料，该材料具 有更大的吸附能力（一次官能化）。发明人还发现，与由单片的热处理聚合物纳米纤维形成 的堆叠比较，通过加热和压制多个聚合物纳米纤维非织造片材生产的膜具有改进的性质。 因此，本发明的方法包括提供两个或更多个非织造片材，一个堆叠在另一个之上，每个所述 片材包括一个或多个聚合物纳米纤维，并同时加热和压制堆叠的片材，使相邻片材的纳米 纤维之间的接触点熔合。因此，本发明的方法包括:如本文步骤(1)所定义的，提供两个或更 多个非织造片材的堆叠体，并且本发明提供了一种用于制备官能化的聚合物色谱介质的方 法，该方法包括： (I) 提供两个或更多个非织造片材的堆叠体，每一个所述片材包括一个或多个聚合物 纳米纤维； (II) 同时进行加热和压制堆叠的片材，以使相邻片材的纳米纤维之间的接触点熔合； 和 (I II)将加热和压制的产物与试剂接触，所述试剂使步骤(I I)中产物被官能化为色谱 介质。
[0055] 通常情况下，提供两至三十个非织造片材的堆叠体。在某些情况下，可能提供五至 二十五个非织造片材的堆叠体。在某些情况下，可能提供10至20个非织造片材的堆叠体。采 用的非织造片材的数量将影响最终的色谱介质的厚度和对液体的渗透性。因此，较厚的介 质通常比较薄的介质具有较低的渗透性。因此，在需要高的渗透性时，通常采用较少数量的 片材。在需要低渗透性介质时，则可以采用较多数量的片材。
[0056] 为免生疑问，非织造片材按平行于它们最薄维度的方向压制（在加热下进行）。非 织造片材将通常具有两个比第三维度大得多的维度，将这些片材平行于该第三维压制。当 提供和压制两个或更多个非织造片材时，这两个或更多个非织造片材被一个堆叠在另一个 之上，使得它们基本上重叠，每个非织造片材的最小维度对齐。这就形成了片材的堆叠体， 其随后被加热和压制。堆叠体中的片材彼此重叠并且每个非织造片材的最小维度对齐。 [0057]通常情况下，压制聚合物纳米纤维或非织造片材的包括向它们施加0.01至5 MPa 的压力，更通常为0.05~3 MPa，例如0.1~I MPa。在本发明方法中使用的合适的压力通常大 于I kPa，优选大于5 kPa，在某些情况下大于10 kPa。通常情况下，使用的压力不大于500 kPa，优选不大于200 kPa，更优选不大于150 kPa，例如不大于100 kPa、50 kPa或30 kPa。例 如，合适的压力范围可以是1~500 kPa、5~200 kPa、5~150 kPa、5~100 kPa、5~50 kPa或10~ 30 kPa。压力可以通过任何合适的方式施加。例如，压力可利用手动压力机或液压机施加。 施加的压力可被改变，从而改变介质的物理性质。一般而言，较高的压力会产生更强健的介 质、具有较低的孔隙率和较小的厚度。较低的压力趋向于产生相对不太强健的介质、具有较 高的孔隙率和较大的厚度。当期望结合性能最大化时，可能优选较厚的色谱介质。 聚合物纳米纤维或非织造片材的压制时间没有特别限制，通常的压制时间可以由本领 域的技术人员来确定。当一个或多个聚合物纳米纤维或一个或多个非织造片材被同时加热 和压制时，压制时间通常为1~30分钟，优选1~10分钟，更优选3~7分钟，还更优选为约5分 钟。
[0058]加热所述一个或多个聚合物纳米纤维或一个或多个非织造片材可以通过常规方 法来进行，例如使用烤箱。当一个或多个聚合物纳米纤维或一个或多个非织造片材被同时 加热和压制时，加热可以通过热压机来实现，或通过将该一个或多个聚合物纳米纤维或一 个或多个非织造片材放置在加热的烤箱中的重物(如金属片)之间来实现。
[0059] 非织造片材的堆叠体被加热和压制，以使得相邻片材的纳米纤维之间的接触点熔 合。
[0060] 当两个或更多个非织造片材(每一个包括一个或多个纳米纤维)被一个堆叠在另 一个之上并经受热量和压力条件时，一个片材中的聚合物纳米纤维的部分可与相同纳米纤 维的部分接触，和/或与相同非织造片材中的其他纳米纤维的部分接触，和/或与相邻的非 织造片材中的纳米纤维的部分接触。在非织造片材中的纳米纤维的部分通常不与不相邻的 其它非织造片材中的纳米纤维的部分接触。 因此，加热和压制两个或更多个非织造片材的堆叠体，可使一个片材中的纳米纤维的 部分与相