用去离子水多次漂洗，并在使用前干燥。
[0182] 实施例4 进行的实验如上述实施例1，但是使用的醋酸纤维素纳米纤维圆片的厚度为0.376mm， 总体积为0.2mL。
[0183] 实施例5 生物分离性能的分析 分析了按照实施例1至4制备和修改的纳米纤维圆片，以比较由两种不同的方法衍生的 等质量和体积的纳米纤维膜的蛋白结合性能。这是为了确定这些纳米纤维系统呈现出的表 面积的改性程度。
[0184] 使用AKTA Basic(GE医疗生命科学，白金汉郡，英国）进行实验，在线测量紫外吸收 (280nm)、pH和电导率。
[0185] 用511^2〇11^8丨8-1^8 4!15.3洗涤缓冲液在480〇11/11的速率平衡按照实施例1至4 制备和修改的纳米纤维圆片，然后加载ImL含有lmg/ml BSA和0.25mg/ mL细胞色素 C的双组 分蛋白溶液。然后使5mL洗涤缓冲液通过吸附剂，然后引入5mL 0.4M NaCl 20mM Bis-Tris、 pH 5.3的洗脱缓冲液。然后使用Unicorn 5.0软件分析通过峰面积的积分测量的洗脱能力。
[0186] 使用BSA和细胞色素 C的混合物，以利用它们不同的等电点，并因此利用对通过离 子交换色谱的分离的适应性。在25°C的水中，细胞色素 C的pi为10.0,而BSA的pi为4.7。这 意味着，在PH5.3的Bis-Tris缓冲溶液中，细胞色素 C将具有有净正电荷，并且不会结合至 DEAE吸附剂的弱阴离子交换表面。与此相反，在该高于BSA的pi的pH下，BSA将具有净负表面 电荷，因此将结合至DEAE吸附剂。因为在洗脱期间盐浓度增加，BSA的负表面电荷和阴离子 交换器之间的相互作用被盐离子竞争击败，因此从吸附剂中移除并收集BSA。
[0187] 在若干运行周期中分析吸附剂的性能，以确定关于吸附剂的寿命的再生性。下表 列出了所测试的圆片的平均结合能力。
[0188] 对于纳米纤维圆片的两个厚度，对流改性方法比扩散改性方法给出了更高的结合 能力。这种效果对较厚圆片更显著。
[0189] 还观察到化学试剂到达聚合物系统的官能化表面的能力取决于纳米纤维膜的厚 度。因此，对于所测试的较厚的纳米纤维膜，对通过对流衍生的DEAE纳米纤维吸附剂观察到 显著提高的结合能力。这表明，对于所研究的方案，扩散不足以使化学试剂到达所有的结合 表面区域。
[0190] 实施例6 重复的扩散的化学改性 如上述实施例4所述进行纤维素纳米纤维圆片的阴离子交换表面衍生，即使用的醋酸 纤维素纳米纤维圆片具有的厚度为〇. 376mm和总体积为O . 2mL。然后从DEACH的引入点到方 案的末尾重复进行化学改性。 因此，将实施例4中得到的圆片置于具有20 mL温(40°C)的15% 2-氯-N，N-二乙基乙胺 盐酸盐99%(DEACH)的水溶液的样品管中10分钟。移除吸附剂并让其滴干30秒后，放置到振 动台上新的样品管中的20 mL热(80°C )的0.5M的NaOH中10分钟，然后用去离子水多次漂洗。
[0191] 实施例7 如实施例6地进行实验，但是再重复一次化学改性。
[0192] 因此，将在实施例6中得到的圆片置于具有20 mL温(40°C)的15% 2-氯-N，N-二乙 基乙胺盐酸盐99% (DEACH)的水溶液的样品管中10分钟。移除吸附剂并让其滴干30秒后，放 置到振动台上新的样品管中的20 mL热（80 °C )的0.5M的NaOH中10分钟，然后用去离子水多 次漂洗。
[0193] 实施例8 如实施例7地进行实验，但是再重复一次化学改性。
[0194] 因此，将在实施例7中得到的圆片置于具有20 mL温(40°C)的15% 2-氯-N，N-二乙 基乙胺盐酸盐99% (DEACH)的水溶液的样品管中10分钟。移除吸附剂并让其滴干30秒后，放 置到振动台上新的样品管中的20 mL热（80 °C )的0.5M的NaOH中10分钟，然后用去离子水多 次漂洗。
[0195] 实施例9 使用在实施例5中所述的方案，对在实施例4和6至8中制造的圆片进行结合能力的分 析。也确定了每个圆片的压降。
[0196] 下表列出了所测试的圆片的平均结合能力和压降
这些结果通过重复的衍生方案步骤，显示了在官能团取代中的清晰的改进。对使用在 衍生期间重复的方案步骤测试的吸附剂观察到结合能力整体提高270%。压降没有受到重 复改性的影响。
[0197] 重复衍生DEAE纳米纤维吸附剂的结构稳定性似乎并未受到影响，这已经在重复性 研究中证实，该研究显示了在50次典型的操作中恒定的性能。
[0198] 图1示出未结合细胞色素 C+的BSA(第一波峰)在双组份混合物的加载期间和BSA的 洗脱(第二波峰）的流动。50个相同的结合实验运行的平均结果显示出样品群体的±1标准 偏差（由围绕相同颜色的主曲线的虚曲线示出）。这些结果示出了 50个相同的结合实验运行 的再现性，并示出了对于所选择的条件，纳米纤维吸附剂可再现地进行，捕获和洗脱加载的 BSA的99%。计算标准偏差，从而表明纳米纤维吸附剂仍继续运行。
[0199] 图2示出未结合细胞色素 C+的BSA(第一波峰)在双组份混合物的加载期间和BSA的 洗脱(第二波峰)的流动。进行了多次结合实验运行，对实验绘制的曲线记录了 500次的实验 运行。对两个实验运行记录的曲线几乎完全重叠。这也表明根据本发明制备的膜获得了优 异的再生性。这与现有技术的膜所报道的多次运行后性能显著下降相反。
[0200] 制备实施例2 将0.20g/mL的醋酸纤维素溶液(相对分子质量为29000g/mol)溶解在常见的溶剂(例如 丙酮/二甲基甲酰胺/乙醇）中。使用来自〇· Hardick, et al, J.Mater. Sci. 46 (2011) 3890的最佳条件，制备具有低分布的纤维直径的电纺醋酸纤维素纳米纤维的非织造片材， 其平均厚度为20微米，平均面积密度为20g/m 2。
[0201] 在电纺之后，将10个表面积为IOOcm2的纳米纤维非织造片材一个堆叠在另一个的 顶部，然后在208°C在金属片之间放置于预热的烤箱中30分钟。金属片之间的压力被确定为 20kPa。然后将压制和加热的片材切割成多个直径为25mm的圆片。
[0202] 分析实例1-加热和压制的效果 如制备实施例2中描述地获得10个醋酸纤维素纳米纤维片材。将这些片材一个堆叠在 另一个的顶部，并经受热压机中20kPa的压力，并同时加热至207°C。在热压机中对堆叠的片 材压制和加热5min。在压制和加热之后，切割所得的膜的圆片。使用实施例3中概述的方法， 将醋酸纤维素纤维脱乙酰化成纤维素。以这种方式制备的样品在下文中称为"压制"样品， 反映了加热是在热压机中进行的。
[0203]将"压制"圆片放入50ml注射器内的橡胶0型环中，该注射器作为容器来使0形环定 位。将IOml移液管尖(重量5.81g)形式的重量置于纳米纤维圆片的中心。将IM NaOH溶液加 入到容器中，并用计时器确定失效点。在移液管尖下跌穿过圆片时确定失效点。移液管尖下 跌穿过圆片所需的时间长度表示出圆片的化学耐受性。该实验重复三次。
[0204]图3示出实验装置。
[0205] 进一步如上所述地制备纳米纤维片圆片，但是这10个纳米纤维片材首先在20kPa 的压力下在压力机(不需加热）中压制1小时，随后在烤箱中在207° C下加热(不需压制)五分 钟。以这种方式制备的样品在下文中称为"烤箱"样品，反映了加热是在烤箱中进行的。
[0206] 将"烤箱"圆片放入在橡胶0型环中，并进行上述的化学耐受性测试。同样，此实验 重复三次。
[0207] 对于"压机(压制)"和"烤箱"圆片的结果列于下表。
[0208] 从这些结果可以看出，被同时压制和加热的圆片比那些先压制（不加热)并随后加 热(不压制）的圆片具有好得多的化学耐受性。
[0209] 在暴露于IM NaOH中IOmin之内，"烤箱"圆片出现变色和点蚀。而即使暴露于IM NaOH中120小时后，"压制"圆片仍几乎不降解。图4示出各个圆片的照片。
[0210] 确定了若干"压制"和"烤箱"圆片的厚度和密度。图5示出这些圆片的厚度与平均 密度。发现"压制"圆片比"烤箱"圆片更薄和密度更大。
[0211] 通过测定在经过圆片的Tris-HCl缓冲液(pH 8)的递增的流速（2，5，10，20， 30, 40, 60 ml/min)下的三角柱压降，分析"压制"和"烤箱"圆片的流动特性。图6示出所获 得的数据。可以看出，"压制"和"烤箱"圆片具有相似的流动特性。
[0212] 分析实施例2-不同压力的影响 使用分析实施例1中描述"压制"圆片的方法制备再生的纤维素圆片。以这种方式制备 的圆片在下文中称为"20kPa"圆片。
[0213]使用以上对"20kPa"圆片描述的方法制备其他圆片，但是使用的压力为200kPa，而 不是20kPa。以这种方式制备的圆片在下文中称为"200kPa"圆片。
[0214] 确定了若干"20kPa"和"200kPa"的圆片的厚度和密度。图7示出这些圆片的厚度和 平均密度。发现"200kPa"圆片比"20kPa"圆片更薄和密度更大。
[0215] 通过分析实例1中描述的方法分析"20kPa"和"200kPa"圆片的流动特性。图8示出 所获得的数据。可以看出，在"200kPa"圆片上的压降比在"20kPa"圆片上的更高。
[0216] 使用实施例3的方法，用DEAE将"20kPa"和"200kPa"的再生纤维素圆片官能化。使 用类似于实施例5中列出的方案确定这些圆片的动态结合能力(DBC)。通过IM NaCl洗脱步 骤，使用pH 8的Tris-HCl缓冲液，使用不同质量（lmg, 2mg, 4mg)的BSA，在30ml/min的流速 下确定动态结合能力(DBC)。图9示出DBC分析的结果。"20kPa"圆片的DBC比"200kPa的"圆片 的更高。
[0217] 实施例10 根据制备实施例2的方法制备纳米纤维圆片。将圆片脱乙酰化并在室温下用DEACH浸 渍，然后在室温下用〇 . 5M NaOH洗涤5次。在DEACH中的浸渍和用0.5M NaOH的洗涤被重复多 至5次，它也是下面所述的官能化的循环的次数。因此，圆片被官能化1个循环、2个循环、3个 循环、4个循环和5个循环。
[0218] 使用在分析实施例1中描述的的方法来分析1、2、3、4、5个循环的圆片的流动特性， 其中使用递增的流速(2，5，10，20，30, 40，60，80 ml/min)，并使用pH 8的Tris-HCl 缓冲液。图10示出所获得的数据。可以看出，压降随着循环次数的增加而增加。
[0219] 使用在分析实施例2中描述的方法来分析1、2、3、4、5个循环的圆片的动态结合能 力(DBC)。图11示出DBC的分析结果。从1到4个循环，DBC增加，然后到第5个循环时下降。 [0220] 实施例1l-SP官能化的圆片的制备 使用制备实施例2和实施例1的方法制备再生的纤维素圆片。
[0221] 将2ml烯丙基缩水甘油醚加入到IOml DMSO和5mL IM NaOH的溶液中，然后加入10 个再生纤维素纤维圆片。通过加入NaOH(IM)，将在30ml水中的亚硫酸氢钠（3克）调节至pH 6.5。然后用该混合物处理在上面第一步骤中得到的圆片。然后用0.1 M HCl洗涤圆片，接着 用水洗涤。
[0222] 为了确定动态结合能力，用类似于在实施例5中概述的方法来分析SP-官能化的圆 片。利用pH 5的IOmM醋酸钠缓冲液平衡AKTA纯化系统(GE Healthcare)。将lmg/ml的溶菌酶 的样品以30ml/min的速率加载到该系统中。将IM NaCKpH 5的IOmM醋酸钠缓冲剂）的溶液 用于洗脱。在280nm的在线UV追踪产生了在图12中示出的色谱图。
[0223] 实施例12-CM官能化的圆片的制备 使用制备实施例2和实施例1的方法制备再生的纤维素圆片。
[0224] 将它们加入到NaBr(24.3 mmol)和TEMP0(1.60 mmol)的水溶液中并用NaOH调节至 pH 10。向此加入NaOCl(5.0 mmol)，直到pH值没有进一步的变化。然后用EtOH洗涤圆片。
[0225] 为了确定圆片的动态结合能力，AKTA系统以30ml/min的流速运行，所使用的样品 是具有Iml的负载注入的lmg/ml浓度的溶菌酶。使用pH 5的IOmM醋酸钠缓冲液来平衡和清 洗系统。将I M NaCKpH 5的IOmM醋酸钠缓冲液）用于洗脱。在280nm的在线UV追踪产生了 在图13中示出的色谱图。
[0226] 实施例13-Q官能化的圆片的制备 使用制备实施例2和实施例1的方法制备再生的纤维素圆片。
[0227] 将它们加入到DMSO: IM NaOH:缩水甘油基三甲基铵为2:1:0.1的溶液中。然后用 0.1 M HCl溶液和水洗涤圆片。
[0228] 为了确定动态结合能力，用pH 8的IOmM Tris-HCl缓冲液平衡AKTA纯化系统(GE Healthcare)。将lmg/ml的BSA的样品以20 mL/min加载到该系统中。将IM NaCKpH 8的IOmM 的Tris-HCl缓冲液）的溶液用于洗脱。在280nm的在线UV追踪产生了在图14中示出的色谱 图。
[0229] 实施例14-蛋白A官能化的圆片 使用制备实施例2和实施例1的方法制备再生的纤维素圆片。
[0230] 将它们加入到含有6.5g NaKk的80 mL醋酸钠缓冲液(pH 5.5)中。然后用50mL乙 二醇洗涤圆片，随后用水洗涤。然后用〇. 05 %的Tri ton X-100、pH 9.0的IOOmM的碳酸盐/碳 酸氢盐洗涤圆片。用0.05%的Triton X-100、pH 9.0的IOOmM的碳酸盐/碳酸氢盐的溶液透 析蛋白A配体，然后将其加入到圆片。然后倾析溶液，并加入0.05%的Triton X-100、pH 9.0 的IOOmM的碳酸盐/碳酸氢盐溶液。向该溶液中加入I OOmM的硼氢化钠溶液，得到最终硼浓度 为4mM的溶液。然后倾析该溶液，并加入20 %的在50mM磷酸盐和150MM氯化钠中的乙醇的pH 6.7的缓冲液。上述洗涤步骤重复9次。
[0231 ]为了确定动态结合能力，以30 ml/min的流速运行AKTA系统，所使用的样品是具有 Iml的负载注入的lmg/ml浓度的蛋白A纯化的IgG。使用pH 7.4的PBS缓冲液来平衡和清洗系 统。将pH 3.0的0.1 M柠檬酸钠缓冲溶液用于洗脱。在280nm的在线UV追踪产生了在图15中 示出的色谱图。
[0232] 实施例15-苯基官能化的圆片 使用制备实施例2和实施例1的方法制备再生的纤维素圆片。
[0233] 将它们加入到75 mL的DMSO: IM NaOH以2:1混合的溶液中。然后将氧化苯乙烯 (7.5mL)加入到反应混合物中，在室温下搅拌4小时。然后用甲醇洗涤圆片，再用水洗涤。
[0234] 为了确定动态结合能力，AKTA系统以lOml/min的流速运行，所用的样品是具有Iml 的负载注入的〇· I mg/ml溶菌酶(具有1 · 5M硫酸铵）。使用1 · 5M硫酸铵和pH 8的IOmM的Tris 来平衡和清洗系统。将pH 8的IOmM Tris用于洗脱。在280nm的在线UV追踪产生了在图16中 示出的色谱图。
[0235] 分析实施例3-加热和压制前进行堆叠的影响 如在上述分析实施例1所讨论的，按照本发明制备的再生纤维素圆片（以下简称"压制" 圆片)在化学耐受性测试(如图3所示冲耐受了>120小时。"压制"圆片甚至在暴露于NaOH中 120小时后也很少降解(如图4所示）。
[0236] 按照制备实施例2中的描述获得醋酸纤维素纳米纤维单层片材。单层片材由两个 平面PTFE片材夹持，并放置在烤箱中以208° C加热1小时，参见Ma，et al，Journal of Membrane Science 265 (2005) 115-123中描述的方法。按照实施例3中概述的方法将所得 到的片材脱乙酰化。从所得的纤维素片材上切割出十个片材并堆叠在一起，参见Ma等人的 描述。以这种方式制备的样品在下文中统称为"Ma等人"样品。这个过程重复8次以创建八个 十圆片堆叠体。
[0237] 将"Ma等人"十圆片堆叠体放置在橡胶0形圈中，并进行上面分析实施例1中描述的 化学耐受性测试，重复三次。这三个"Ma等人"圆片分别在十分钟、十分钟、两分钟后测试失 败。
[0238] 从这些结果可知，从先堆叠后同时加热和压制的多个非织造纳米纤维片材中形成 的圆片，与先加热单个纳米纤维片材，随后堆叠形成的圆片相比，具有更好的化学耐受性。
[0239] 如图17所示，"Ma等人"圆片暴露于IM NaOH中10 min内出现变色和点蚀。而"热压" 圆片暴露于IM NaOH中甚至120小时（图4)也很少降解。
[0240] 测定了多个"热压"和"Ma等人"圆片的厚度和密度。图18示出这些圆片的厚度和平 均密度。发现"热压"圆片比"Ma等人"圆片更薄更致