微粉化方法

专利名称：：微粉化方法
技术领域：
：本发明涉及用于降低蛋白质粉末颗粒大小的方法。
背景技术：
：近些年，已经产生了制造具有受控的、窄的颗粒大小分布的微米和亚微米颗粒大小药用粉末分散物的需求。此类粉末的应用包括例如通过千粉吸入器递送的药用气雾剂(这提高水不溶性药物的生物利用度)和由浸有凝血因子冻干粉末的生物可降解复合基质构成的止血装置。将粉末研磨成微米和亚微米颗粒大小的过程称作微粉化。在已知的微粉化方法当中有涉及高剪切率和高能量输入的方法，例如喷射研磨或粉碎系统、球磨研磨、高压匀浆和微流化。此类方法通常不适用于对热降解和/或物理降解敏感的生物分子。其它已知的温和方法包括喷雾干燥、重结晶、乳化溶剂提取和使用超临界流体的方法，如超临界溶液快速膨胀(RESS)。用于研磨的涡旋室或涡流室也已知。例如，美国专利号4,502,641公开了喷射研磨原理与涡流室的组合。还已知研磨涡流室，其实现所谓的共振涡旋研磨。WO94/08719公开了配以切向流体喷嘴的涡旋室研磨装置，其实现所谓的"共振涡流研磨"。Belmvsky的美国专利号5,855,326公开了精细粉碎固体颗粒材料的涡旋研磨室，在具有基本上圆筒形状的外壳内形成具有两个端面和一个侧壁的室，室具有一个或一个以上的正切嘴用于向室内注射工作流体并且在室内产生涡流，所述室包含向其中引入待粉碎固体颗粒材料的装置、在一个或两个所述端面中提供的轴向排列排出通道、和一个或者一个以上机械元件形式的控制装置，当产生涡流时，所述机械元件适合与移动接近室内壁的板层相互作用，从而能够控制粉碎，美国专利号5,855,326的全部内容通过参考并入本文。在专利中使用砂粒例证了涡旋室运转。Beliavsky的美国专利号6,789,756公开了用于研磨基本上为固体颗粒材料的改进的涡流研磨机，其包含一个或一个以上的工作室，美国专利号6,789,756的全部内容也通过参考并入本文。研磨机还包含一个或一个以上的工作流体入口和一个或一个以上的排出口。一个或一个以上的工作流体入口和一个或一个以上的4非出口{足进了一个或一个以上工作室内的涡流流动。还有一个或一个以上的进料入口提供固体材料以研磨，研磨的固体材料从一个或一个以上的排出口排出。此外，存在一个设备，用于在工作流体在一个或一个以上的工作室内流动过程中产生受控的摄动，由此改善固体材料在涡流流动中的研磨。Hercules血纤蛋白羊毛状物是由非针织Vicryl编织入针织氧化再生纤维素(ORC,Interceed，)内的生物可降解复合基质构成的止血装置，通过悬浮于挥发性溶剂中使得基质内浸透血纤蛋白原和凝血酶的冻干粉末。
发明内容本发明的目标是提供用于将蛋白质颗粒分散物微粉化至所确定颗粒大小分布而同时基本上保留了蛋白质活性的机械化方法。散物微粉化的方法，方法包括在这样的研磨条件下将分散物引入涡流室研磨设备，所述研磨条件导致蛋白质粉末具有5至100〖im的颗粒大小分布并且保留了蛋白质的至少80%的预定水平生物学活性，其中研磨条件包括选自下列的一个或一个以上的参数1和7巴之间的输入压力；0.2和5巴之间的喷射压力；0.1和5kg/小时之间的加载速率；和30和100mV小时之间的气流。本发明方法有利地使得可以得到具有一致且受控颗粒大小分布的蛋白质粉末。在本发明的一个实施方案中，首先产生最初蛋白质颗粒分散物的颗粒物,以具有裂缝或洞或者其它结构缺陷，这些裂缝或洞或者其它结构缺陷构成了可以在研磨过程中帮助颗粒破裂的弱点。在一个实施方案中，通过冷冻干燥方法如冻干法制备蛋白质颗粒分散物。冻干法代表性地通过冷冻干燥实现并且包括通过减压下升华从细胞悬浮物中去除水。从蛋白质材料中脱水的备选脱水方法在蛋白质粉末生产领域也是众所周知的并且可以使用。在进一步的实施方案中，在研磨前将冷冻干燥的分散物机械破碎。在更进一步的本发明实施方案中，分散物机械破-淬至通过2mmSS篩的颗粒o在本发明方法中处理的蛋白质具有生物学活性，即对人身体内一种或一种以上生理过程具有影响的活性。例如，蛋白质可以是酶并且相应的生物学活性将是酶的酶催化活性。可以在本发明中使用的蛋白质的非限定性实例包括凝血级联中的任何蛋白酶以及它们的蛋白酶底物；补体级联中的蛋白质以及它们的对等物；生长因子以及它们的受体；激素以及它们的受体；免疫球蛋白；合成代谢和分解代谢酶；催化下列生物化学反应的酶磷酸化、脱磷酸化、羧化、退火、蛋白水解、转氨基作用、脱氨基作用、氧化作用、氢化作用、杂交、水解、异构化、反转、糖酵解、DNA和RNA聚合作用、酯化反应等。在一个实施方案中，蛋白质是凝血因子并且生物学活性是凝血活性。在另一个实施方案中，蛋白质是凝血酶或血纤蛋白原。蛋白质可以是一种或一种以上上述蛋白质的混合物。在本发明的一个实施方案中，蛋白质是Bac2。在本发明的另一个实施方案中，蛋白质是凝血酶。蛋白质可以是合成的、天然存在的、通过转基因或重组方法制备的，包括处理的、变性的或者修饰的蛋白质。生物学活性水平可以通过本领技术人员众所周知的标准生物学测定法预先确定。例如，如果蛋白质是酶，其生物学活性可以通过开展测定活性的一种或一种以上测定法确定。在特定实例中，为确定血纤蛋白原的凝血活性，可以使用(7"w^测定法(向维持在37°C的适宜体积和稀释度的血纤蛋白原样品种加入人凝血酶溶液[大约20IU/ml并且包含至少lmmol/1的钙];确定凝血时间并且对使用适当血纤蛋白原标准制作的校准曲线计算活性)，或者可凝血的血纤蛋白原可以通过测定280nm处的吸光度确定。在另一个特定实例中，凝血酶的凝血活性可以通过凝血方法确定(向适宜体积和稀释度中加入加热至30°C的血纤蛋白原溶液[lg/1凝血蛋白质]并且立即测定凝血时间。对使用凝血酶的参考制剂制作的校准曲线计算试验制剂的活性)。在本发明中使用的涡流室研磨设备优选包含正切流体喷嘴并且使用压力梯度实行共振涡旋研磨。据信，涡流室内的快速气压变化造成颗粒沿其薄弱面崩解。在一个实施方案中，研磨设备是如美国专利号5,855,326中公开的设备。在另一个实施方案中，研磨设备是如美国专利号6，789，756中公开的设备。此类研磨设备的一个实例是以色列Yokneam的SuperFine有限公司制造的超细涡流研磨机~(SuperFineVortexMill)(SFVM)(图解示于图6中)。研磨条件下可以包括一个或一个以上的下列参数(a)分散物进入磨的进入流压力(=输入压力)-通常为1和7巴之间的输入压力，下限在1-3巴范围内(例如1、2或3巴)并且上限在4-7巴范围内(例如5、6或6.3巴)；(b)进料喷射器处的压力(=喷射压力-在喷射器用于进料的情况下*)-通常在0.2和5巴之间。在本发明的一个实施方案中，喷射压力是2巴；(c)加载速率-通常在0.1和5kg/小时之间，下限在0.1-2kg/小时范围内(例如0.2、0.4、0.6或1.6kg/小时)并且上限在3-5kg/小时范围内(例如2.4、2.8、3.0、3.7或4.2kg/小时)；和(d)从流体注入管至排出管的气流(=气流**)-通常在30和100m3/小时之间(例如35、40、50、58、60、69、70、80或90mV小时)。*分散物的进入流通常高，并且在研磨机内形成的真空将粉末吸入室内。由于本发明方法中的进入流相对低，不足以将粉末吸入室内并且因此常常需要进料喷射器。**任何惰性气体可用于从流体注入管至排出管的气流(干燥空气、氩、氮等)。在下面的实施例中，使用空气。在本发明的另一实施方案中，所得到的蛋白质粉末具有5至100pm的颗粒大小分布，下限为5、10、15或20pm并且上限为45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100nm。在进一步的实施方案中，至少90%的颗粒、更优选至少95%的颗粒、最优选至少97。/。的颗粒的大小在颗粒大小分布之内。在本发明的一个进一步的实施方案中，蛋白质粉末保留至少80%、更优选至少90%、最优选至少95%的预定生物学活性。在更进一步的实施方案中，微粉化导致蛋白质粉末大小比原始大小减小30至400倍。技术人员容易地理解范围的公开。这意味着在该范围界限间的连续值和数字的公开，包括限定的数字和值。例如，如果给定的范围从1至7，这意味着至少1、2、3、4、5、6或7以及中间亚范围的所有组合，如1和2、1-3、1-4、1-5、1-6、或1-7以及2和3、2-4、2-5、2-6、或2-7等等。上文或下文引用的所有申请、专利和公布的全部公开内容通过参考并入本文。为了理解本发明并且了解其在实践中如何实现，现仅通过非限定实例的方式参照附图描述优选的实施方案，其中图1显示手磨与SFVM的人血纤蛋白原2粉末大小分布谱的比较；图2显示在不同研磨压力下研磨的人血纤蛋白原2的大小分布谱；图3显示在不同研磨压力下研磨的凝血酶的大小分布谱；图4显示使用同一标准操作参数在同一天研磨的两个批次(斜和#5)人血纤蛋白原2的颗粒分布语；图5显示使用同一标准操作参数在同一天相继研磨的两个批次(#6和#7)人血纤蛋白原2的颗粒分布；和图6显示SFVM的剖视图。具体实施例方式本发明的示例性实施方案将针对以色列Yokneam的SuperFine有限公司生产的SFVM描述。然而，需要理解的是，可以根据本发明使用其它类型研磨机器实现本发明。I.材料生物制品所有批次的人血纤蛋白原2和凝血酶生物制品在以色列TelHashomer的PFI冻干。人血纤蛋白原2(有时也称作BAC2)是浓缩的、病毒灭活的人血浆冷沉淀物(冷沉淀物代表性地如EP534,178中所述制备)，其主要由血纤蛋白原(大约85。/。)组成并且是纤维蛋白溶酶原耗竭的(纤维蛋白溶酶原的去除代表性地如EP1,390,485中所述开展)并且未加入抗血纤蛋白溶解剂。生物制品作为冻干块抵达，冻干块在用铝箔袋和厚聚乙烯袋双层包裹的LyoGuarcf塑料盘中。双层包裹的盘子保持在2-8°C直到研磨。运载体氬氟碳化合物(HFE)-7000用作生物制品的运载体。然而，生物材料可以悬于任何适宜的溶剂中，并且HFE仅为一个非限定性实例。II.方法生物制品在1^00肌卅@中冻干。所有LyoGuards充有1.5升人血纤蛋白原2或凝血酶。干燥的冻千制品转移至用铝箔包裹的测试设备中。在测试地点，打开箔包并且通过用铲刮压2mmSS筛将块第一次才几械性石皮石卒，然后粗颗粒粉末经由传送器进入SFVM。在加载制品之前预置喷射器和磨机的压力，并且在运转过程中微调至所期望压力。通过预先称重等分式样的制品维持加载速率；仔细定时加载每一等分式样。粉末收集于连接至旋风分离器SS漏斗末端的玻璃瓶中。开展下列试-验以确定生物学活性和物理参^::1.水含量-卡尔-费休(Karl-Fisher)滴定法2.颗粒大小分布-颗粒大小分布可以用BeckmanCoulterLS13320测量，其使用光散射原理，可以测定液体形式或者干粉形式的颗粒大小分布。在分散于HFE7000中的粉末中开展的库乐尔特颗粒计数允许测定0.3752000pm范围的颗粒大小。3.血纤蛋白原凝血活性-Clauss测定法[上述]。4.通过280nm处的吸光度测定凝血血纤蛋白原-为了定量测定凝血血纤蛋白原，所测试样品与凝血酶混合并且形成凝块。钠-EDTA用作反应辅因子(^3++)的螯合剂并且抑制FX1II被凝血酶活化成FXIlla(血浆转谷氨酰胺酶)，由此阻止非凝血蛋白质与血纤蛋白间，谷氨酰基-s-赖氨酸桥的形成。不与血纤蛋白网络交联的这些非凝血蛋白质通过首先在滤纸上干燥凝块，然后用盐水连续洗涤而去除。随后，凝块溶解于尿素/NaOH溶液中并且通过在280nm处(在减少320nm处光散射之后)针对已知内标测定对可凝血血纤蛋白原定量。5.对于血纤蛋白原和凝血酶冻千和/或研磨样品中总蛋白质测定、可凝血血纤蛋白原测定、通过Clauss法对血纤蛋白原测定以及通过凝血时间对凝血酶效力的测定，粉末应再悬浮于适宜緩冲溶液中。6.通过凝血方法[上述]测定凝血酶活性。III.结果SFVM利用涡流室内的快速气压变化以沿着材料颗粒的结构弱点将材料颗粒断裂，并且由此产生超细粉末。本质上，研磨机已经被设计成能够使用相对低能量提供高效的、节能的细磨粉末，即研磨一千克粉末所消耗的能量远远低于通过常规喷射研磨机或者机械(叶片研磨或球研磨)研磨相同数量粉末达到相同颗粒大小所使用的能量(见表1)。表1:喷射研磨机和SFVM间的比较(注意能量消耗之间的不同)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>SFVM的设计允许通过变动下列参数灵活调整颗粒大小和大小分布施加于主研磨室入口的的压力即输入压力的增加将增加施加于每单位粉末的能量，因此增加颗粒崩解，这会导致减小颗粒大小和缩小分布。然而高能量会导致最终研磨产物的生物学活性降低。存在控制制剂向研磨机加载速率的两个附加参数(1)制剂倾入研磨机接收漏斗的速率，(2)喷射压力。高加载速率将降低每千克制剂的能量，因此颗粒所吸收的能量将较低，导致较少数量的颗粒崩解，将产生较大的颗粒。在大多数下列试验中，喷射压力恒定地设定至2巴，在任何所研究的进料速率下这足以推动制剂进入涡流室。然而，对于上述规刚有一个例外，当主输入压力高时(〉3巴)，注入主SFVM内的气体产生真空，将大的冻干粉末颗粒吸入研磨机内。因此当在低于3巴下工作时需要辅助的注射入口。研磨参数的影响在非受控温度或湿度下，使用在40°C的露点下的压缩空气开展这些实验。将人血纤蛋白原2和凝血酶粉末在铝箔包裹的LyoGuards中船运至试验地点。使用大的伊将冻干块破碎成通过2mmSS筛的小的颗粒。50克的每一样品加载在SFVM漏斗上。在低的空气压力下，将辅助的压力表加至漏斗口，因为漏斗口处的吸力太低以至于不能维持恒定加载。l.研磨参数对人血纤蛋白原2的影响表2显示冻千人血纤蛋白原2在不同空气压力和不同加载速率下研磨所得到的结果。表2不同空气压力下研磨冻干人血纤蛋白原2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*ND=未做^使用干燥至40。C露点的空气的气流。所有颗粒大小分布曲线(见图l)表现为双相峰曲线，小峰在0.5至1pim处,主峰在10-30)im附近。从表2可以注意到，只有试验2中运行编号1和2具有与手磨人血纤蛋白原2相似的大小分布(参见表2和图1)。此外，如表3所示(试验编号2，运行编号1和2),当主参数设定成2巴的压力和3至4.2Kg/小时的加载速率时，通过Clauss法或者可凝血血纤蛋白原(A，)法测定均达到了最高的血纤蛋白原回收。表3:不同研磨条件对人血纤蛋白原水含量和血纤蛋白原活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*通过A280nm方法测定的可凝血血纤蛋白原。2.研磨参数对凝血酶粉末的影响如先前使用常规喷射研磨机的试验所发现，凝血酶活性对机械剪切相对不敏感，因此发现凝血酶对使用SFVM时的研磨参数不敏感。因此，主要目标是找到使得凝血酶颗粒大小分布与人血纤蛋白原2的颗粒大小分布相似的条件。还考虑得到与手磨凝血酶相似的颗粒大小分布的条件。在早期试验过程中，很明显凝血酶粉末是高吸湿性的。凝血酶细磨粉末具有吸收水分的极高倾向。因此，颗粒大小越小，凝血酶粉末水含量增加越快。所有上述情况支持设计一种将取得大颗粒大小凝血酶的方法。然而，这种颗粒大小不应超过人血纤蛋白原2的颗粒大小，以使得两种制剂在HFE-7000中具有相同的悬浮特性。表4:研磨参数对凝血酶颗粒大小分布的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*未使用喷射器。从表4中可以注意到，使用低压力得到的凝血酶大小分布表明产生大的颗粒大小和与人血纤蛋白原2(见图l)极其相似的大小分布。从该阶段开始，使用SFVM样才几1对人血纤蛋白原2和凝血酶进行的常规大规模研磨均使用相同的参数2巴的主研磨入口压力、2巴的喷射器压力和2kg/小时的加载速率。在实际的生产厂使用氮气对样机重新进行再检验并且在层流罩中操作。3.人血纤蛋白原2的研磨试验在人血纤蛋白原2研磨过程中，层流罩下的湿度为22%，温度为22°C。全部生产过程在无菌条件下进行，加载速率固定为2kg/小时并且喷射器压力设定为2巴。研磨的人血纤蛋白原2于2-8。C储存于玻璃容器中直至试验。研磨两个批次批次#1在2巴下研磨，研磨前的最初活性为0.30-0.31mg血纤蛋白原/mg固体(血纤蛋白原已经通过Clauss法测定)，批次#2,在1巴和3巴的压力下进行研磨试验，估计最初活性为0.35mg/mg(血纤蛋白原/固体)。一旦粉末破碎至2mm颗粒，平均水含量为9.31±0.59%(在批次#1中测定)。结果总结于表5中。表5:在生产地点使用氮气研磨压力对所研磨人血纤蛋白原2的可凝血血纤蛋白原(通过Clauss法)和颗粒大小分布的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>研磨后，水含量明显较低(6.66±0.57%),表明研磨过程也干燥粉末。颗粒分布谱随着压力明显改变(见表5-颗粒大小D50，和图2)，然而，在1巴下研磨仍然产生类似于手研磨的窄的分布曲线(比较图l和2)。此外，如可以在表5中注意到，压力在1和3巴之间时，通过Clauss法测定的可凝血血纤蛋白原没有明显改变。4.凝血酶研磨试验在凝血酶研磨过程中，层流下的湿度和温度分别为26。/。和21。C。所有的生产过程在无菌条件下进行。2mm颗粒的进料速率固定为2kg/小时并且喷射器压力设定为2巴。所研磨的凝血酶于2-8°C储存于玻璃容器中直至试验。研磨两个批次批次#3用于在2巴下研磨。其研磨前的最初凝血酶活性为25.85±0.211U/mg固体。在2mm的破碎颗粒中测得的平均水含量是6.08±0.42%。批次#2用于在1巴和4巴压力下的研磨试验。一旦使用干氮气将粉末研磨后，不管压力如何，水含量降低。结果表明，直到4巴的压力没有改变凝血酶活性。表6:在生产地点氮研磨压力对所研磨凝血酶的凝血酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>还应当注意到，压力从2巴增加至4巴仅轻微影响颗粒大小分布(见表6和图3)。5.使用几个批次的人血纤蛋白原2试验研磨过程的可重复性先前的试验涉及在保持相同的主入口压力、喷射压力和加载速率的同时不间断地连续用LyoGuard⑧盘向SFVM补料。可以想象，保持相同的研磨条件将产生可比性的产物，即具有相同湿度、大小分布和凝血特性的粉末。对分别各接受几次研磨试验的两个批次人血纤蛋白原2的比较验证这一观点。来自两个批次人血纤蛋白原2的七个LyoGuard⑧盘分别在SFVM中研磨。研磨层流罩内的相对湿度为33%并且室温为22°C。预研磨的冻干块的水含量相似，批次#4和#5分别为5.48%和5.45%。冻干块的总蛋白质几乎相同在批次糾和#5中分別为0.69和0.68mg蛋白质/mg冻干固体。可凝血血纤蛋白原数值也非常相似，在批次#4和#5中通过可凝血血纤蛋白原测定法(A280nm)的测定值分别为0.4]和0.42mg/mg固体，通过Clauss测定法测定的值分別为0.35和0.32mg/mg固体。在研磨后，血纤蛋白原仅少量减少，在批次#4和#5中，通过A，nm测定的减少均为6%(减少至0.39mg/mg固体)，通过Clauss法测定的减少分别为20%和6%(分别减少至0.28和0.30mg/mg固体)(表7和图4)。在两个批次中均未观察到湿度或总蛋白质含量变化(表7)。表7:在同一天和相同研磨条件下相继研磨的两个批次伊4和#5)人血纤蛋白原2的可重复性<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*对D50的学生T检验-p=0.16**对D90的学生T检验-p=0.07虽然通过曲线D50/D90所描述的平均颗粒分布不相同，分別为16.4对19.1pm和37.3对41.2，但是这些差异没有显著的统计学意义(见表7和图4)。将来自两个批次人血纤蛋白原(#6和#7)的六个LyoGuard⑧盘相继研磨以再次评价可重复性(图5和表8)。研磨层流罩内的相对湿度和室温分别为18%和17。C。冻干块的总蛋白质几乎相同，在批次#6和#7中分别是0.65和0.69mg蛋白质/mg冻干固体。可凝血血纤蛋白原基本相同，在批次#6和#7中分别是0.39和0.4mg/mg固体。在两个批次中，通过Clauss动力学方法测定的血纤蛋白原浓度存在小的差别，分別为0.47和0.42。此种差异在用Clauss测定法测定高浓缩血纤蛋白原溶液内的血纤蛋白原时很常见。然而，通过Clauss方法得到的血纤蛋白原读数超过可凝血蛋白质(A28o)非常罕见。在研磨之后，在批次#6和#7中，可凝血血纤蛋白原(A280nm)没有变化，通过Clauss方法测定的血纤蛋白原仅少量降低，减少分别为约11%和5%。并且，在任一批次中没有观察到水含量或总蛋白质的改变。即便在两个批次中，两个D50/D90的平均值不相同，在批次#6和#7中分别为17.9和18.9|Lim以及41.5和42.3pm,但是大小分布结果在统计学上是相同的，P〉95。/。(见表8和图5)。表8:在同一天和相同研磨条件下相继研磨的两个批次(批次#6和#7)人血纤蛋白原2的可重复性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>权利要求1.用于将包含具有预定水平生物学活性的蛋白质的颗粒分散物微粉化的方法，方法包括在这样的研磨条件下将分散物引入涡流室研磨设备，所述研磨条件导致产生具有5至100μm的颗粒大小分布并保留蛋白质的至少80％的预定水平生物学活性的蛋白质粉末，其中研磨条件包括选自下列的一个或一个以上参数1和7巴之间的输入压力；0.2和5巴之间的喷射压力；0.1和5kg/小时之间的加载速率；和30和100m3/小时之间的气流。2.用于蛋白质颗粒分散物微粉化的方法，其中蛋白质具有预定生物学活性，方法包括在这样的研磨条件下将分散物引入涡流室研磨设备，所述研磨条件导致产生表现出蛋白质颗粒分散物比其最初大小减小30至400倍并且保留蛋白质的至少80。/。预定生物学活性的蛋白质粉末，其中研磨条件包括选自下列的一个或一个以上的参数1和7巴之间的输入压力；0.2和5巴之间的喷射压力；0.1和5kg/小时之间的加载速率；和30和100m3/小时之间的气流。3.权利要求1或2的方法，其中蛋白质颗粒分散物中的颗粒具有裂缝或洞。4.权利要求1至3中任意一项的方法，其中蛋白质颗粒分散物通过冷冻干燥方法制备。5.权利要求1至4中任意一项的方法，其中分散物在研磨前机械破碎。6.权利要求1至5中任意一项的方法，其中蛋白质是酶并且生物学活性是酶的酶活性。7.权利要求1至5中任意一项的方法，其中蛋白质是凝血因子并且生物学活性是凝血活性。8.权利要求7的方法，其中蛋白质包含凝血酶或血纤蛋白原。9.权利要求1至8中任意一项的方法，其中涡流室研磨设备包含正切流体喷嘴并且使用压力梯度实现共振涡旋研磨。10.权利要求9的方法，其中研磨涡流室包含在SuperFineVortexMi評(SFVM)内。11.权利要求1至10中任意一项的方法，其中颗粒大小分布为10至100,。12.权利要求1至10中任意一项的方法，其中颗粒大小分布为10至60,。13.权利要求1至12中任意一项的方法，其中至少90%的颗粒的大小在所述颗粒大小分布内。14.权利要求1至13中任意一项的方法，其中蛋白质粉末保留至少90%的预定生物学活性。15.用于蛋白质颗粒分散物微粉化的方法，其中蛋白质具有预定生物学活性，方法包括在这样的研磨条件下将分散物引入涡流室研磨设备，所述研磨条件导致产生具有10至60pm的颗粒大小分布并保留蛋白质的至少90%的预定生物学活性的蛋白质粉末，其中研磨条件包括2巴的输入压力；2巴的喷射压力；选自2和5kg/小时之间，约1.6kg/小时、2kg/小时、2.7kg/小时、3kg/小时和4.2kg/小时的加载速率；和30和100mV小时之间的气流。16.用于蛋白质颗粒分散物微粉化的方法，其中蛋白质具有预定的生物学活性，方法包括在这样的研磨条件下将分散物引入涡流室研磨设备，所迷研磨条件导致产生表现出蛋白质颗粒分散物比其最初大小减小30至400倍并且保留蛋白质的至少90。/。预定生物学活性的蛋白质粉末，其中研磨条件包括2巴的输入压力；2巴的喷射压力；选自2和5kg/小时之间、约1.6kg/小时、2kg/小时、2.7kg/小时、3kg/小时和4.2kg/小时的加载速率；和30和100mV小时之间的气流。17.权利要求15或16的方法，其中涡流室研磨设备是SFVM。全文摘要用于将包含具有预定水平生物学活性的蛋白质的颗粒分散物微粉化的方法。方法包括在这样的研磨条件下将分散物引入涡流室研磨装置中，所述研磨条件导致蛋白质粉末具有5至100μm的颗粒大小分布和/或表现出蛋白质颗粒分散物比其最初大小降低30至400倍，并且保留了蛋白质的至少80％的预定水平生物学活性。研磨条件包括选自下列的一个或一个以上的参数1和7巴之间的输入压力；0.2和5巴之间的喷射压力；0.1和5kg/小时之间的加载速率；和30和100m³/小时之间的气流。文档编号B02C19/06GK101534952SQ200780041072公开日2009年9月16日申请日期2007年10月30日优先权日2006年11月2日发明者伊瑟烈·努尔,利里亚纳·巴尔申请人:欧姆瑞克斯生物医药有限公司