专利名称：一种快速培育蓖麻温敏型隐性核不育单雌系的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物细胞工程及作物杂交育种技术领域，具体地说是一种利用花粉雄核培养技术加速温敏型隐性核不育雌性系的形成，并以其作为供选母本与父本进行蓖麻杂交育种的方法。
背景技术：
蓖麻是世界最重要的非粮食油料作物之一，是战略物资和再生能源的重要物质来源，不仅广泛应用于军工、医疗等行业制品，而且非替代性的应用于航空业的润滑和防护。近年来，随着石油能源的日趋匮乏，蓖麻作为生物能源的重要地位更加突出。然而，同粮食作物比较，蓖麻生产的并不乐观，呈现投入少、管理粗放、缺乏良种、种植面积较小等不足，因此蓖麻的产量和品质始终达不到应有水平，也难以满足加工业需求。为了实现蓖麻作为重要生物能源的应有价值，缓解材料供应与需求的矛盾，推动了蓖麻产业、特别是加工业的快速发展，亟待加大蓖麻良种选育力度，以期从源头解决优质蓖麻供应问题。杂种优势现象在生物界普遍存在，杂种品种可以表现明显的增产优质效应，已经被成功运用到多种作物的育种中，因此杂交育种是发展蓖麻产业的突破口。
蓖麻雌性系是实施有效杂交育种的基本材料，目前已发现4种类型的蓖麻雌性单株。第一种是N型单雌株，遗传上其雌性特征由一对隐性基因(f)控制(Claasen CE，Hoffman A.，Agron.J.，1950，4279-82)，因此，只有纯合时才表现单雌特征。第二种是S型雌性单株(Shifriss O.，Genetics，1956，41256-280)，该单雌性的最大特点是雌雄性状的不稳定性，因此，不同发育期或不同年度间经常出现雌雄混杂。两种类型雌性系实践上都曾经得到应用，主要依赖连续自交，不仅周期较长，而且在蓖麻杂交制种时需要人工间除两性植株，因此育种效率低。第三，具温敏现象的NES型雌性系(Shifriss O.，Journal of Genetics，1960，57361-388)是具有真正实践意义的雌性系，由于环境温度严格控制雄花的出现，所以其对杂交育种的贡献和潜力较大。第四种是Zimmerman等发现了兼具NES和N型的复合类型，并发展成一种新的温敏型雌性系(Zimmerman L H，Smith J D.Crop Sci，1966，6406-409)，该雌性系具32℃条件产生少量雄花、24℃条件下不形成雄花的特点，因此极有利于杂交种的选育，而由此发展起来的“两系法”杂交技术，已在巴西、美国和印度等国家成功应用。我国的蓖麻研究也取得了许多可喜成绩。Lm型雌性系是具有标志性状的标志雌性系，由永283M2品系经60Co-γ诱变获得(朱国立，中国油料，1990，323-26)。研究发现，雌性标志性状受两对连锁的隐性基因(pp11)控制，在花序现蕾时即可显现，性状出现早、易识别，是蓖麻育种的新型良好材料。然而，由于我国育种工作开展较晚，育种环节较为薄弱，育种材料依然呈现严重不足的局面，这极大地制约了蓖麻杂交育种的开展。
纯合体是杂交育种的最佳材料。蓖麻属于雌雄异花同株植物，遗传机制复杂，采用常规途径获得相对纯合的亲本，周期很长，至少需要经过5-7代亲本自交。植物花粉单倍体培养技术已在数百种植物上获得成功，花粉作为单倍有机个体，可以在1-2年时间内通过诱导培养获得纯合个体，因此开展蓖麻花粉培养有助快速获得大量单雌植株，加速蓖麻育种进程。
发明内容
本项发明专利的主要目的是针对我国蓖麻育种材料严重缺乏、育种周期长、育种效率低、特定地区适种蓖麻优质品种严重不足的现实，利用花粉单倍体培养技术快速繁育隐性核不育基因控制的温敏型蓖麻单雌系，以其为母本创制高产、优质和多抗蓖麻新品种的方法。
本发明提供了一种进行蓖麻花粉单倍体植株的培育方法成熟的处于总苞开裂临界期的蓖麻雄花序，经低温、表面消毒和干燥处理后，将其中的花粉分离出来并接种到MS培养基(Murashige and Skoog，Physiol.Plant.15473-497，1962)上直接诱导形成愈伤组织，选取新鲜致密的高活性愈伤组织转接到添加了0.05～0.1毫克/升2，4-D和0.5～2.0毫克/升6-BA的MS培养基(即分化培养基)中分化形成再生苗，再生苗转接到生根培养基(1/2MS+NAA 0.05+3％蔗糖、0.7％琼脂，pH5.8)即可培育出花粉单倍体植株。
本发明提供了一种蓖麻雌性系的培养方法花粉经过诱导、分化、生根形成的候选单倍体植株，需进行染色体观察和核型分析后确认；选取生长良好的单倍体植株，利用0.1％～0.4％秋水仙素溶液处理其茎尖生长点或者全株，可以获得候选纯合二倍体植株，并进行核型分析确认，纯合二倍体植株隔离条件自交扩繁后建立纯系即可繁育出具有单雌特性的母本；单雌植株具有温度敏感效应的特点，隔离条件下，适时适地种植蓖麻雌性系，使蓖麻开花盛期的环境温度处于33℃及以上温度，能够诱导植株形成少量的雄花，使雌性系得以种质延续。
本发明还提供了一种培育杂交蓖麻品种的方法以温敏型隐性核不育雌性系为母本，配合力强的自交系或者进一步经遗传改良的自交系为父本实施杂交组合可以创制出高产、高油、多抗的蓖麻新品种。根据吉林等东北地区的气候特点，为了使父母本都同时处在盛花期，达到高效授粉的目的，通常父本提前母本7-10天播种；父母本播种比例为1∶6，每公顷保苗2万株，在苗期、花期、成熟期三次去杂，母本整枝打杈，只保留主穗和2个第一分枝穗。
本发明还提供了一套栽培方法，配合种植本发明繁育的蓖麻杂交种该杂交品种适应吉林省中西部、内蒙古、辽宁等地种植；可在四月中下旬至五月初播种，种植密度在1-1.2万株/公顷；底肥施三元素复合肥25-30kg/亩，追肥施尿素10-15kg/亩；霜前40天打顶，去掉无效花蕾；地膜覆盖种植。
以下内容将对本发明中的常用术语进行解释 “蓖麻种质资源”是制作蓖麻母本的原始材料，可以是各种来源(国内或者国外)的品种、品系或者野生种，但以适种优质品种、品系或当地中熟农家品种为首选；蓖麻父本是配合力强的自交系或者进一步经遗传改良的自交系。
“春蓖1号”蓖麻是以单雌系9901为母本，以改良181蓖麻为父本配制而成的蓖麻杂交种。父本和母本均由春莲集团种质资源库繁育和保藏，春蓖1号由春莲集团繁育生产保藏(春1-10)，也可从吉林省蓖麻种子经销公司购买。经过品种比较和多点生态试验鉴定、经济性状鉴定和配合力测定、品种分析、抗性鉴定等一系列试验分析鉴定，结果表明春蓖1号综合性状优良，具有高产、高油、多抗等特性，2006年已通过吉林省农作物品种委员会审定，准予推广，是取代以往的常规种的良种之一。春蓖1号主要特点为产量高，一般公顷产量为1350公斤，在地膜覆盖、管理及时情况下，公顷产量可达2000公斤以上；生育期适中，春蓖1号属于优质的中晚熟蓖麻，主穗出苗至成熟约120天，需有效积温2500℃左右，全株成熟需有效积温2700℃左右，东北地区可在四月下旬至五月初播种；品质佳，种子百粒重40克，粗蛋白含量为17.90％，粗脂肪含量63.21％，出仁率76.4％；缺点，虽然对土壤肥料要求不严，耐旱、耐瘠薄、耐盐碱，抗倒伏，但不抗枯萎病。
实施例 以下只是作为事例说明发明人实施本发明的过程，并不限制本发明的其它实施范围，也不排除使用者可使用其它更加有效的方案。
1、单雌系的快繁技术 以“春蓖1号”为原始种质材料，当雄花总苞处于开裂临界期(似开未开)之时，此时雄花已经成熟；小心摘取雄花序立即放在黑暗干燥的容器中，并在-15℃冰箱中进行10-30天的低温处理，优选的处理时间为15天。选择完整未破裂的花蕾，用75％的酒精浸泡0.5分钟，然后用20％的次氯酸钠溶液消毒5min，并用无菌水冲洗3次，放在超净台上风吹30分钟至干。用镊子夹住花苞基部，用解剖针剥开花苞，然后敲打镊子使花药均匀散落在含有MS培养基的培养皿中，并用封口膜封好。整个过程要注意杂菌污染。
花粉在MS培养基首先置于4℃低温处理24h，然后放在25-28℃、光照时间14h/d、光照强度1500lx的培养室进行诱导培养，直至形成愈伤组织，选取新鲜致密的高活性愈伤组织转接到添加了0.05～0.1毫克/升2，4-D和0.5～2.0毫克/升6-BA的MS培养基中继续培养，其中以0.3毫克/升2，4-D和1毫克/升6-BA为优选用量，直至形成花粉单倍体植株。此过程中，要经常观察污染情况、培养基失水情况等，并及时处理污染，或者更换新鲜的培养基。
单倍体植株的核型分析取花粉植株的根尖，采用染色体常规切片和压片技术，以8-羟基喹啉(或者二氯苯)饱和溶液进行预处理3-5小时，然后用卡诺固定液固定2-24小时，经50％乙醇浸泡，蒸馏水冲洗，以及1摩尔浓度的盐酸溶液解离7-8分钟后，洗去盐酸，进行卡宝品红染色3-5分钟制片，显微镜检查，并以染色体数目确认单倍体。
选择确认为单倍体的生长良好的植株，然后用0.1％～0.4％秋水仙素溶液处理其茎尖生长点或者用棉球进行全株涂抹，即可以获得纯合二倍体植株；秋水仙素优选的浓度为0.25％。处理后进行定期核型分析，以确认二倍体植株。
单雌植株具有温度敏感效应的特点，隔离条件下，适时适地种植蓖麻雌性系，使蓖麻开花盛期的环境温度处于33℃及以上环境温度，可以诱导植株形成少量的雄花，从而繁育出具有单雌特性的母本，使雌性系得以种质延续。
2、蓖麻杂交种的选育 父本改良181自交系的获得技术父本是利用花粉管注射技术，将国外优异种质资源CS-RD181中的抗性基因导入到当地优质品种中，然后通过连续回交六代改良、再经过多代自交成系而得到。
单雌母本的繁育与选择标准花粉培育并二倍化的纯合蓖麻植株，繁育单雌母本的优选地区是蓖麻盛花期环境温度超过33℃的地区(如海南等地)，在此种地区进行隔离种植，选取结实率和种子含油量双高的单雌植株为供试母本。
按照蓖麻两系杂交制种技术规程，利用蓖麻单雌系为母本、改良181作父本进行远缘杂交，可以生产出高产、高油、多抗的优质蓖麻杂交品系，命名为“春花1号”。
3、杂交制种模式和配套栽培措施 母本是利用单雌系开花期持续高温能分化少量雄花的特点，在海南隔离条件下自交繁殖；父本在隔离条件下自交繁殖。杂交制种方式为父母本错开播种期，父本提前7-10天；父母本播种比例为一行父本六行母本(即1∶6的比例)，每公顷保苗2万株。在苗期、花期、成熟期三次去杂，母本整枝打杈，只保留主穗和2个第一分枝穗；霜前50天打顶处理。
4、春花1号配套栽培方法 该杂交品种适应吉林省中西部、内蒙古、辽宁等地种植；可在四月中下旬至五月初播种，种植密度在1-1.2万株/公顷；底肥施三元素复合肥25-30kg/亩，追肥施尿素10-15kg/亩；霜前40天打顶，去掉无效花蕾；首选种植方式为地膜覆盖种植。
权利要求
1、一种高产、优质的蓖麻杂交种的繁育方法，其包括，利用花粉单倍体培养技术获得温敏型隐性纯合不育的单雌性植株，隔离条件下自交繁育成蓖麻雌性系，以蓖麻雌性系为母本与蓖麻父本配置实施杂交育种的方法，其特征在于，应用该方法能够快速为蓖麻选优提供多种温敏型单雌系，继而选育并生产出具有高产、高油、优质、多抗特性的高纯度蓖麻新品种。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蓖麻雌性系来源于花粉雄核的诱导发育，经过花粉单倍体诱导培养、染色体加倍获得纯合的二倍体植株，二倍体植株在隔离条件下自交成系并繁育出母本。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，蓖麻雌性系的单雌特性由纯合的细胞核隐性不育基因控制，其后代的主穗和一级分枝穗100％为雌性花且能够稳定遗传；单雌特性植株具有温度敏感效应，当蓖麻雌性系在开花盛期处于33℃及以上环境温度条件下能够形成少量的雄花，因而可以实施隔离条件下自交繁殖获得雌性系的目的。
4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述花粉单倍体诱导培养是将成熟的处于总苞开裂临界期的蓖麻雄花序，经低温、表面消毒和干燥处理后，将其中的花粉分离出来接种到MS培养基上直接诱导形成愈伤组织，愈伤组织转接到添加了0.05-0.1毫克/升2，4-D和0.5-2.0毫克/升6-BA的MS培养基中继续培养分化形成花粉单倍体植株，单倍体植株用0.1％-0.4％秋水仙素溶液处理获得纯合二倍体植株，隔离条件自交扩繁后建立纯系。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制作蓖麻母本的原始材料选自各种来源的品种、品系或者野生种，蓖麻父本是配合力强的自交系或者进一步经遗传改良的自交系。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述品种、品系或者野生种为当地农家品种或适种优质品种、品系。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，应用温敏型隐性核不育雌性系为母本，配合力强的自交系或者进一步经遗传改良的自交系为父本进行的杂交组合及创制的高产、高油、多抗蓖麻品种；在吉林等东北地区，根据父母本生育期和开花特点错开一定时期，通常父本提前母本7-10天播种，父母本播种比例为1∶6，每公顷保苗2万株，在苗期、花期、成熟期三次去杂，母本整枝打杈，只保留主穗和2个第一分枝穗。
全文摘要
本发明涉及一种高效创制蓖麻单雌系的方法及应用于蓖麻杂交育种的途径，具体地说是一种利用蓖麻花粉再生系统快速培育温敏型隐性核不育基因纯合体，并以其作为母本与自交系父本杂交繁育蓖麻新品种的方法。应用本发明的方法，不仅可以快速高效地创制出大量的温敏型核不育单雌系种质，更重要的是用作育种母本繁育高产、高油、多抗、不落果、不裂朔、籽粒饱满、出仁率高等性状的蓖麻新品种。
文档编号A01H5/00GK101347093SQ200810051129
公开日2009年1月21日 申请日期2008年8月28日 优先权日2008年8月28日
发明者张世宏, 周春莲, 毅 魏, 刘金亮, 张鑫生, 飞 闫, 潘洪玉, 王勇军 申请人:吉林大学, 吉林省春莲园艺工程(集团)有限公司