转牙鲆生长激素基因集胞藻及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：转牙鲆生长激素基因集胞藻及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学技术和生物工程
技术领域：
，具体地说，是一种转牙鲆生长激素基因集胞藻及其制备方法和应用。技术背景自80年代起我国开始鲆鲽鱼类的商品养殖以来，因其市场{介值高、经济效益好，其在水产养殖中比重越来越大，其中，牙鲆和大菱鲆是目前我国鲽科水产养殖中最重要的种类，近年来又引进了大西洋夏鲆、漠斑牙鲆、塞内加尔鳎等。但是在鲆鲽鱼类较长的养殖过程中，由于温度、水质等原因的影响，容易导致其生病死亡，造成经济损失。因此通过现代化生物技术手段改善鲆鲽鱼的生长速度，降低养殖成本及风险，成为业内人士共同关注的焦点。鱼类生长激素(GH)是由鱼的脑垂体前叶细胞合成分泌的一种单链多肽类激素，它在鱼体内的多层次上的调节功能，可以有效地促进鱼体的生长、发育。但是正常鱼体内生长激素含量甚微，每升鱼血仅含20吗，从鱼体中提取是不可能的。为满足海水鱼养殖业的需要，运用基因工程技术获得廉价鱼生长激素成为一条有效途径。许多研究证实，基因工程方法获得的生长激素具有代偿内源生长激素的功能，肌肉注射外源生长激素，可促进鱼体生长；何料中添加的生长激素可通过鱼体消化it^肠上皮细胞的胞饮作用吸收，提高鱼体的生长速度。而且由于大多数海水鱼类的生长激素有较高的同源性，一种海水鱼的生长激素对其它海水鱼也有促进生长的作用，所以其应用范围较广。现有技术中，有两类方法推动着鱼类生长激素基因体外表达向应用发展其一是大肠杆菌表达效率的提高，然而大肠杆菌的表达产物往往形成包涵体，对其处理耗时、繁瑣，同时表ii^且提物中含有内毒素，必须对目的产物进行严格的分离纯化才可应用。因此人们又转而尝试可作为何料的表达系统。鲤鱼、f卢鱼、草鱼等的生长激素相继在毕赤酵母中表达。中山大学研制基因重组的草鱼生长激素，成功的通过杆状病毒在家蚕幼体高度表达，并具有很高生物活性。藻类是鱼类非常好的天然辨料，在海洋生态系统中，藻类就作为初级生产力在食物链中起着重要的作用，利用藻类作为表达宿主不仅免去了纯化等繁瑣的步骤，而且其本身的营养成分又可以被鱼类所利用。加之集胞藻之类单细胞蓝藻增殖快，易培养，基因4喿作简^更，具有简单而稳定的同源重组系统，可以实现外源基因在集胞藻中的长期稳定表达，已经有多种药物一如解毒酶、超氧化物歧化酶、金属硫蛋白等在集胞藻中得到了表达。最重要的是集胞藻安全无毒，细胞壁易被消化，在水产养殖中曾被用来强化轮虫，作为真鲷仔鱼和牙鲆仔鱼何料。因此集胞藻是表达鱼类生长激素的上佳选择，目前尚没有将其应用到牙鲆生长激素的体外表达上。
发明内容本发明提供了一种转牙鲆生长激素基因集胞藻及其制备方法和应用，可以加快鲆鲽鱼类的生M度，解决目前鲆鲽鱼类较长的养殖过程中，由于温度、水质等原因的影响而生病死亡的问题。本发明的目的是由以下技术方案实现的一种转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于所述的转基因集胞藻是将牙鲆的生长激素基因转入集胞藻中获得的。所述的转基因集胞藻表达牙鲆的生长激素，该转基因集胞藻已由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.2479。所述的集胞藻为5)7^c力ocj^"、sp.PCC6803。所述的牙鲆生长激素基因为牙鲆生长i敫素成熟肽cDNA,含有525bp的核苦酸片段，与序列表第1号序列所示核苷酸序列具有100%的同源性。所述牙鲆生长激素为牙鲆生长激素成熟肽，编码174个氨基酸残基，其分子量为19KDa，其M酸序列与序列表第2号序列所示的M酸序列具有100%的同源性。所述的牙鲆生长激素基因转入集胞藻中是通过将牙鲆的生长激素基因构建载体pZGH,转化集胞藻，获得转基因集胞藻分/ec加c"/ASynGH。所述的载体pZGH中，牙鲆生长激素cDNA的前端为集胞藻的isiAB(铁缺乏i秀导蛋白)的启动子，由isiAB启动子来启动生长激素的表达，isiAB启动子长397bp,与序列表第3号序列所示的核香酸序列具有100%的同源性。所述的载体pZGH中，生长激素基因表达框的两侧为集胞藻的groESL基因，以groESL基因作为与集胞藻的基因组DNA发生同源重组的位点，groESL基因长2880bp,与序列表第4号序列所示的核苦S臾序列具有100%的同源性。一种转牙鲆生长激素基因集胞藻的制备方法，其特征在于具有如下步骤[1]牙鲆生长激素cDNA的制备提取牙鲆脑垂体总RNA，设计含有酶切位点BamHI和NotI的引物pingl和ping2,pingl引物序列与序列表第5号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，ping2引物序列与序列表第6号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，采用逆转录聚合HI连式^^应(RT-PCR)方法,扩增出牙鲆生长激素cDNA,测序确定其与预期的序列一致；[2]构建集胞藻转化载体将牙鲆生长激素成熟肽cDNA，经BamHI和NotI双酶切后连入大肠杆菌质粒pUC-沐，构建中间载体pUC-沐GH;大肠杆菌质粒pUC-沐是以pUC18为原始载体，在其多克隆位点中连入isiAB启动子序列和卡那霉素抗性基因序列构建而成的，其中isiAB启动子序列是以集胞藻基因组DNA为模板，以prol和pro2为引物，prol引物序列与序列表第7号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，pro2引物序列与序列表第8号序列所示的核苷酸序列具有100°/。的同源性，并在序列两端分别设计了EcoRI和BamHI酶切位点，PCR扩增后经EcoRI和BamHI酶切连入，此夕卜prol引物上还设计了一个ApaI酶切位点，卡那霉素抗性基因的末端具有一个XhoI酶切位点，为连入同源重组片段groESL基因内部做准备；与此同时，以集胞藻的基因组DNA为才莫板，以groESLl和groESL2为引物，groESLl引物序列与序列表第9号序列所示的核苦酸序列具有100°/。的同源性，groESL2引物序列与序列表第10号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，PCR扩增groESL基因,连入pMD18-simpleT载体中，得到载体pT-gro;采用ApaI和XhoI分别酶切载体pUC-pKGH和pT-gro,连接得到集胞藻同源重组载体pZGH，测序确定生长激素cDNA序列、isiAB启动子序列和groESL序列均与预期的序列一致；[3]牙鲆生长激素基因转化到集胞藻中(1)培养集胞藻至对数生长中期，收集藻细胞，用新鲜培养基洗涤；(2)加入质粒pZGH,将藻细胞与质粒的混合物培养2-10小时；(3)将藻细胞涂布在不含抗生素的BG-11固体培养基上，恢复培养12-24小时；(4)转移藻细胞到含卡那霉素(5-50^g/ml)的BG-ll固体培养基上，10-14天，转化子长出；(5)将转化子进行PCR鉴定，挑选生长速度快的阳性克隆进行大M^莫培养。[4]转牙鲆生长激素基因集胞藻的培养转牙鲆生长激素基因集胞藻于20-30°C下在BG-ll液体培养基培养，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，光照强度为25-120(imol.m—2.s—\BG-ll培养基配方如下:组分mg/L硝酸钠(NaN03)1500磷酸氢二钾(K2HP04)40硫酸镁(MgS04.7H20)75氯化4丐(CaCl2.2H20)36片宁檬酸(Citricacid)6种樣酸铁4妄(Ferricammoniumcitrate)6乙二胺四乙酸二钠(EDTA)1石灰酸钠(Na2C03)20A5solution0.1.量元素，其配方如下(g/L)組分g/L辟L酸锌(ZnS04.7H20)0.222硫酸铜(CuS04.5H20)0.079氧化钼(Mo03)0.015硼酸(H3B03)2.86氯化锰(MnCh.4H20)1.81[5]牙鲆生长激素在转基因集胞藻中的诱导表达-.转牙鲆生长激素基因集胞藻于20-30°C下在BG-11液体培养基培养，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，光照强度为25-120|umol.nT2.s—\接种密度OD73。=0.2左右，待其生长进入平台期，转到不含4失的BG-11培养基中继续培养14-20天。转牙鲆生长激素基因集胞藻在养殖鲆鲽鱼类的詞津牛添加剂或饲料中的应用。转牙鲆生长激素基因集胞藻的鉴定提取转牙鲆生长激素基因集胞藻的基因组DNA，经EcoRI和BamHI双酶切后，以牙鲆生长激素cDNA探针进行Southern杂交，证实牙鲆生长激素基因重组整合到集胞藻基因组DNA中。牙鲆生长激素在集胞藻中表达的Western杂交4企测收集诱导的转基因集胞藻，破碎细胞后离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将聚丙烯酰胺;io交转膜后与兔抗鱼生长激素抗血清进^亍杂交，i正实牙鲆生长激素已经在集胞藻中表达。表达牙鲆生长激素集胞藻的冷冻干燥:表达牙鲆生长激素集胞藻在冷冻离心才几中以4。C，10000-20000g，5-30min的务f牛离心收集，收集的样品以1。C/min的速率冷冻到-4(TC，然后转入事先预冷的冷冻干燥才几中冷冻干燥，在冷冻干燥的最后两小时内，加热样品到23。C以减少残留水份。与现有技术相比，本发明的优点在于得到了表达牙鲆生长激素的集胞藻，该集胞藻在促进鲆鲽鱼类生长、提高辨料转化率方面具有显著的作用。而且集胞藻本身可以作为鲆鲽鱼类的饲料，因此得到的表达牙鲆生长激素的集胞藻不需要纯化，生产容易，成本较低，可以直接用于制备鲆鲽鱼类(含亲鱼和苗种)的生长剂和飼津牛添加剂。本发明制备的转牙鲆生长激素基因集胞藻，是在集胞藻的groESL基因位点，以同源重组的方式将牙鲆的生长激素基因整合到集胞藻的基因组上，因此它可以随着细胞的传代而稳定存在。在实验室进行的IO代的传代过程中，在没有抗生素的选择压力下，生长激素基因依然稳定存在，没有发生丟失现象，这为将来生产和应用的安全性问题提供了保障。本发明制备的转牙鲆生长激素基因集胞藻，采用铁缺乏诱导蛋白(isiAB)启动子来启动生长激素的表达。isiAB启动子是一种在4失缺乏条件下诱导表达的启动子，这样即使转基因集胞藻流失到自然界中，在正常条件下，生长激素的表达不会纟皮启动，不会对生态平衡造成破坏。经优化诱导条件，得到用集胞藻表达的生长激素的量为223ngGH/mg藻，表达量为0.2%。。本发明制备的转牙鲆生长激素基因集胞藻对鱼细胞生长具有促进作用而且无毒副作用。以牙鲆和舌鳎的原代培养肝细胞评价转基因集胞藻对鱼类细胞的促生长作用和安全性，发现转牙鲆生长激素基因集胞藻能够提高两种细胞的活力，对MTS的代谢；转基因集胞藻不会破坏肝细胞膜的完整性，对细胞形态结构没有不良影响；对细胞凋亡不具诱导作用。本发明制备的转牙鲆生长激素基因集胞藻在促进牙鲆生长、提高何料转化率方面具有显著的作用。以转牙鲆生长激素基因集胞藻作为饲料添加剂投喂牙鲆7周的实验结果表明，转基因集胞藻在0.5%和2.0%添加量即能显著促进牙鲆生长，二者体重分别比对照提高32.09%和49.04%，何料转化率比对照组提高20.75%和35.85%;0.5%和2.0%添加量转基因集胞藻组鱼的血液溶菌酶活性也比对照组明显提高(P<0.05);转基因集胞藻对牙鲆肌肉的水分、蛋白质、脂肪及M酸含量没有影响(P>0.05);对牙鲆脏体比和组织结构没有不良作用。证明了转牙鲆生长激素基因集胞藻对牙鲆具有明显的促生长作用，对牙鲆没有不良影响。本发明制备的转牙鲆生长激素基因集胞藻在促进其他鱼类生长、提高辨料转化率方面也有显著的作用。1.0%转基因藻使大菱鲆体重增长比对照提高18.54%(P<0.05)，何料转化率比对照提高9.84%(P<0.05);实验鱼肌肉脂肪含量与对照没有差别，但水分含量降低(P<0.05),蛋白质比对照鱼提高12.73%(P<0.05),M酸组成及比例没有变化，各种氨基酸均衡增加；转基因藻对大菱鲆的血常规和血液生化指标没有影响，对红细胞微核及核异常也不产生诱导作用；不引起实一验鱼组织器官损伤。表明转基因藻作为异源重组生长因子对鱼类同样具有促生长作用和安全性。本发明制备的转牙鲆生长激素基因集胞藻安全无毒。以小鼠为实验对象，通过对转牙鲆生长激素基因集胞藻的经口急性毒性、传统致畸实验、骨髓微核实验以及精子畸形纟企查，发现集胞藻和转生长激素基因集胞藻的经口LD5。>10g/kg;转基因集胞藻对孕鼠生殖机能和胎鼠生长发育不会产生影响，对胎鼠没有致畸作用；对小鼠骨髓细胞微核及精子畸形没有诱导作用。本发明制备的摄食转牙鲆生长激素基因集胞藻的牙鲆也具有生物安全性。以摄食转牙鲆生长激素基因集胞藻的牙鲆鱼肉灌喂小鼠，证明了转基因集胞藻不会对小鼠的摄食、生长、血液生理生化及组织病理产生影响；摄食转基因藻的牙鲆对小鼠的生殖才几能不产生影响。本发明制备的转牙鲆生长激素基因集胞藻是一种安全有效的鲆鲽鱼类饲料或飼料添加剂，在7K产养殖业中具有较大的应用价值。图1为载体pZGH的构建流程图；图2为转牙鲆生长激素基因集胞藻的Southern杂交^企测结果图；图3为牙鲆生长激素在集胞藻中表达的Western杂交4全测结果图。转牙鲆生长激素基因集胞藻(i^ec力ocfSynGH)的保藏日期2008年4月30日；保藏单位的名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院樣i生物研究所；简称CGMCC;^呆藏编号2479。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例l:转牙鲆生长激素基因集胞藻的制备[1]牙鲆生长激素cDNA的制备_^耳又牙鲆脑垂体总RNA,设计^^有酶切^f立点BamHI和NotI的引物pingl和ping2，pingl引物序列与序列表第5号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，ping2引物序列与序列表第6号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，釆用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出牙鲆生长激素cDNA,测序确定其与预期的序列一致。[2]构建集胞藻转化载体将牙鲆生长激素成熟肽cDNA,经BamHI和NotI双酶切后连入大肠杆菌质粒pUC-沐，构建中间载体pUC-沐GH。大肠杆菌质粒pUC-pK是以pUC18为原始载体，在其多克隆位点中连入isiAB启动子序列和卡那霉素抗性基因序列构建而成的。其中isiAB启动子序列是以集胞藻基因组DNA为模板，以prol和pro2为引物，prol引物序列与序列表第7号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，pro2引物序列与序列表第8号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，并在序列两端分别设计了EcoRI和BamHI酶切位点，PCR扩增后经EcoRI和BamHI酶切连入。此外prol引物上还i殳计了一个ApaI酶切位点，卡那霉素抗性基因的末端具有一个XhoI酶切位点，为连入同源重组片段groESL基因内部做准备。与此同时，以集胞藻的基因组DNA为模板，以groESLl和groESL2为引物，groESLl引物序列与序列表第9号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，groESL2引物序列与序列表第10号序列所示的核苷酸序列具有100°/。的同源性，PCR扩增groESL基因,连入pMD18-simpleT载体中，得到载体pT-gro。采用ApaI和XhoI分别酶切载体pUC-pKGH和pT-gro，连接得到集胞藻同源重组载体pZGH,测序确定生长激素cDNA序列、isiAB启动子序列和groESL序列均与预期的序列一致。[3]采用优化的转化条件将牙鲆生长激素基因转化到集胞藻中(1)培养集胞藻至对数生长中期，将藻细胞转移到含2mMEDTA的BG-ll培养基中继续培养2天；(2)收集藻细胞，用新鲜培养基洗涤一遍；(3)加入质粒pZGH(10(ig/ml),将藻细胞与质粒的混合物在光照条件下培养4-6小时；(4)将藻细胞涂布在不含抗生素的BG-11固体培养基上，恢复培养一天；(5)转移藻细胞到含卡那霉素(10|ug/ml)的BG-11固体培养基上。10-14天，转化子长出；(6)将阳性克隆进行PCR鉴定；(7)将筛选出的含有牙鲆生长激素基因的集胞藻在含有卡那霉素(10吗/ml)的BG-11固体培养基上连续传代3次以上；(8)湘遞单克隆转入2mlBG-ll液体培养基(含50(ig/ml卡那霉素)中；(9)待液体培养基中的藻长出后，糸选生长速度快的藻进行大规厲培养。[4]转牙鲆生长激素基因集胞藻的培养转牙鲆生长激素基因集胞藻于30。C下在BG-11液体培养基培养，光照周期为:12小时光照/12小时黑暗，光照强度为75firaol.nT2.s—5。BG-ll培养基配方如下:__mg/L硝酸钠(NaN03)1500磷酸氬二钾(K2HP04)40硫酸镁(MgS04.7H20)75氯化钙(CaCl2.2H20)36斗宁檬酸(Citricacid)6軒樣酸铁镇(Ferricammoniumcitrate)6乙二胺四乙酸二钠(EDTA)1碳酸钠(Na2C03)20A5solution0.1A5为微量元素，其配方如下(g/L)_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>[5]牙鲆生长激素在转基因集胞藻中的i秀导表达转牙鲆生长激素基因集胞藻于30°C下在BG-11液体培养基培养，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，光照强度为75|umol.m—2.s—、接种密度OD73。=0.2左右，待其生长进入平台期，转到不含4失的BG-11培养基中继续培养14-20天。实施例2:转牙鲆生长激素基因集胞藻的鉴定牙鲆生长激素基因重组整合到集胞藻基因组DNA中Southern杂交检测提取转牙鲆生长激素基因集胞藻的基因组DNA，用EcoRI和BamHI进行双酶切，将牙鲆生长激素cDNA进行地高辛标记制作探4十，然后进4亍Southern杂交。结果如图2所示，其中，M:X/EcoRI+HindIII;1-6为基因组DNA1%琼脂糖电泳结果，分别为1:转化集胞藻(未酶切)；2，3:转化集胞藻(EcoRI+BamHI双酶切)；4,5:未转化集胞藻(EcoRI+BamHI双酶切)；6:未转化集胞藻(未酶切)；7-12为基因组DNA的Southern杂交结果，分别为7:转化集胞藻(未酶切)；8，9:转化集胞藻(EcoRI+BamHI双酶切)；10,11:未转化集胞藻(EcoRI+BamHI双酶切)；12:未转化集胞藻(未酶切)。结果表明转牙鲆生长激素基因集胞藻的基因组DNA无i仑是经过酶切还是没有经过酶切，都可以与探针发生反应，显示出杂交条带；而未转化集胞藻的基因组DNA与探针不能发生反应，无杂交信号。证实牙鲆生长激素基因已经通过同源重组整合到集胞藻的基因组DNA上。实施例3:牙鲆生长激素基因在集胞藻中的稳定性检测将含有牙鲆生长激素基因的集胞藻涂布在不含抗生素的BG-11固体培养基上，待藻落长出来后，随才;Ofet2个克隆在不含抗生素的BG-11固体培养基上划线培养；待藻落长出来后，再随才;W^t2个克隆在不含抗生素的BG-11固体培养基上划线培养......这样连续传10代后，再随才/lJ!L选10个藻落进行PCR检测，均有特异性条带克隆出来，结果表明牙鲆生长激素基因在集胞藻中是稳定存在的，不会随着细胞的传代而丟失。实施例4:表达牙鲆生长激素集胞藻的冷冻干燥表达牙鲆生长激素集胞藻在冷冻离心才几中以4°C，10000g，10min的条件离心收集，收集的样品以1°C/min的速率冷冻到-40°C,然后转入事先预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥，在冷冻干燥的最后两小时内，加热样品到23。C以减少残留水份。实施例5:牙鲆生长激素在集胞藻中表达的Western杂交4全测收集诱导的转基因集胞藻，95。C煮10min,离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将聚丙烯BIO交转膜后与兔抗鱼生长激素抗血清进行杂交。结果如图3所示，其中，M:蛋白分子量标准；1:转化集胞藻i秀导14天；2:未转化集胞藻诱导14天；3:转化集胞藻诱导20天；4:未转化集胞藻诱导20天；5,6:转化集胞藻不进行诱导。结果表明经过诱导的转基因集胞藻在19kD处显现出杂交条带，未经诱导的转基因集胞藻和经过诱导的未转基因集胞藻均没有此杂交条带的出现。证实牙鲆生长激素在集胞藻中经过诱导表达了。实施例6:牙鲆生长激素在集胞藻中表达量的测定采用酶联免疫吸附受体法(受体-ELISA法)，将牙鲆的肝膜受体包被ELISA板，然后依次添力。生长激素产品，一抗——兔抗鱼生长激素抗体和二抗——辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,显色后测定0D柳。lmg诱导的转基因集胞藻破碎后溶解在lmlPBS緩冲液中，然后进行受体-ELISA检测，得到0D柳值为0.916,lmg诱导的未转基因集胞藻的0D柳值为0.382,二者相减即为在集胞藻中表达的生长激素对应的0D柳值为0.534,对应以鲑鱼生长激素纯品与0D492的关系绘制的标准曲线，查出0.549对应的生长激素的量为223ng/ml。据此，得出用集胞藻表达的生长激素的量为223ngGH/lmg藻，表达量为0.2%。。实施例7:表达牙鲆生长激素的集胞藻对牙鲆和舌鳎原代培养肝细胞的作用分别收集诱导20天的转牙鲆生长激素基因的集胞藻和未转基因集胞藻，悬于O.OIMPBS中，超声破碎后，离心取上清，以L-15培养基制成所需实验浓度。在培养的牙鲆和舌鳎原代肝细胞的培养基中加入不同稀释度的未转化集胞藻(10(Vg/ml、20(^g/ml)和转基因集胞藻(lOOpg/mL20(^ig/inl)提取液，同时以细胞培养基中添加相同量的PBS作为对照。每个浓度设置3个复孔。定时在倒置显微镜下观察细胞形态、计算肝细胞存活率、测定肝细胞LDH释放以及检测细胞凋亡状况。结果表明100叫/ml和200pg/ml转牙鲆生长激素基因集胞藻对牙鲆和舌鳎的肝细胞形态未产生不良影响，藻处理组的细胞与对照组细胞呈现相似的形态结构。未转化集胞藻对两种肝细胞形态也未产生影响。以转基因集胞藻处理牙鲆肝细胞，处理浓度为20pg/ml和50叫/ml时，处理组与对照组细胞的存活率没有显著差异(P〉0.05)，然而，当处理浓度达10(Vg/ml和20(^g/ml时，转基因集胞藻显著提高了细胞活力，细胞相对存活率分别为110.50%和113.74°/。(P<0.05)。在舌鳎肝细胞存活率实验中，转基因藻蛋白浓度为100pg/ml和200|ag/ml时能明显促进舌鳎肝细胞对中性红的吸收，显著提高了细胞的相对存活率(P<0.05)。转基因集胞藻在50pg/ml、lOOpg/ml和200(ig/ml三个浓度都提高了牙鲆肝细胞对MTS的代谢活性，细胞相对存活率明显提高(P<0.05)。转基因藻在100叫/ml和200ng/ml时也明显促进舌鳎肝细胞对MTS的代谢，但在20叫/ml和5(Vg/ml浓度时对肝细胞活力没有影响。表明转牙鲆生长激素基因集胞藻对牙鲆和舌鳎肝细胞不但没有毒性作用，反而能促进细胞的生长和繁殖，增强细胞的代谢能力。无论是未转化藻还是转基因集胞藻都没有促进牙鲆和舌鳎肝细胞LDH的泄漏，也即二者都不会破坏细胞膜的完整性，说明转基因集胞藻对鱼类肝细胞不具有毒性作用。通过提取牙鲆对照组肝细胞的基因组DNA,未转化集胞藻和转基因集胞藻处理48h的牙鲆肝细胞基因组DNA，舌鳎对照组肝细胞的基因组DNA以及经200pg/mL未转化集胞藻和转基因集胞藻处理48h的舌鳎肝细胞基因组DNA。除基因组DNA亮带外，200叫/mL未转化集胞藻及转基因集胞藻处理的牙鲆和舌鳎肝细胞基因组都未出现小片段DNA,没有出现作为凋亡细胞特^正之一的DNALadder,表明转基因集胞藻和未转化集胞藻不会？I起牙鲆和舌鳎肝细胞的凋亡。实施例8:表达牙鲆生长激素的集胞藻对牙鲆生长及生理生化的影响分别收集诱导20天的转牙鲆生长激素基因的集胞藻和未转基因集胞藻，冷冻干燥后按照0.5%转基因集胞藻，2%转基因集胞藻和2%未转基因集胞藻的比例加入牙鲆饲料中，同时设置不添加集胞藻的普通牙鲆饲料作为对照组。牙鲆鱼60条，随才几分为4缸，15条/缸，培养条件如下17°C，24小时通气，水24小时循环，每天将鱼缸中的水完全更换一次，每天喂食两次，喂食以不留残辨为准，每次喂食时计算摄食量。整个实验周期为7周，每周测一次体重、体长和体宽，实验结束后，进行肌肉成分测定、月几肉水分含量测定、肌肉蛋白质含量测定、肌肉M酸含量测定、月几肉粗脂肪含量测定、脏体系数计算和组织病理学^r测、血清溶菌酶活性测定。经过7周的实验，转牙鲆生长激素基因集胞藻对牙鲆体重增长的作用结果如表1所示，商品饲料对照组、集胞藻对照组、0.5%和2.0%转基因集胞藻组的生长率分别为0.58±0.05、0.59±0.05、0.69±0.04和0.74±0.07;两个对照组之间没有差异(P〉0.05),两个实验组与两个对照组比较具有显著性差异(P<0.05),表明生长率的提高是由于转基因集胞藻引起，而不是由集胞藻本身造成的，0.5%和2.0%转基因集胞藻组鱼的体重增长分别比商品伺料对照组提高了32.09%和49.04%。0.5°/。和2.0%转基因藻组的体长增长也比两个对照组有明显提高(P〈0.05)。尽管投喂转基因集胞藻的牙鲆其摄食量比对照鱼有所增加，统计分析表明二者之间不存在显著差异(P〉0.05)。两个实验组的斜料转化率均比对照组有明显提高(分别为20.75%和35.85%)(P<0.05)，且2.0%转基因集胞藻组的何料转化率显著高于0.5%转基因藻添加组的转化率。表l转牙鲆生长因子基因集胞藻对牙鲆幼鱼成活、生长和辨料转化的影响处理体重增长体长增长生长率摄食量饵料效率成活率(g)(cm)(%/天)(g/鱼)(体衝饵料)(%)商品饲料对照7.26±0.26a1.19±0.10a0.58±0.05a13.69±0.98a0.53±0.04a100±0.00'集胞藻对照7.74±0.22a1.23±0.10a0.59±0.05a14.07±0.45a0.55±0.03a100±0.00'0.5%转基因藻9.59±0.34b1.53±0.16b0.69±0.04b14.99±0.55a0.64±0.02bioo±o.oo;2.0%转基因藻10.82±0.61b1.57±0.12b0.74±0.07b15.03±0.71a0.72±0.02eioo±o.oo;分析摄食转基因集胞藻对牙鲆肌肉水分、蛋白质及脂肪含量的影响，结u明实验组与商品飼料对照组比较无显著差异(P〉0.05);饲料中添加未转化集胞藻也不会导致肌肉成分发生改变。tt酸含量分析表明，摄食未转化集胞藻和转基因集胞藻都不能改变牙鲆肌肉氨基酸的种类组成和比例。总氨基酸含量、必需氨基酸总量，4组之间没有显著性差异；对17种M酸含量分别进行比较，4组间也不存在显著性差异(P〉0.05)。对4组牙鲆的脏体系数进行研究表明，祠料中添加0.5%和2.0%转基因集胞藻对牙鲆的心、肝A^的脏体比没有影响，实验组与两个对照组比较没有显著差异。对牙鲆进行解剖和肉目W见察，摄食转基因集胞藻的牙鲆未出现肉眼可见组织病变，鳃、心、肝、脾、肾、胃、肠及盲肠呈现正常的外观形态和颜色，肝组织未见胂大。组织病理学检查显示，摄食2.oy。转基因集胞藻的牙鲆，其胃体粘膜完整，腺体结构清晰。小肠肌肉层和粘膜层形态正常，小肠绒毛结构完好，杯状细胞清晰可见，固有层无炎性细胞浸润。商品饲料对照组、集胞藻对照组和2.(W转基因集胞藻组牙鲆的肝脏组织结构相似，肝细胞排列有序，细胞形态结构正常，无增生、坏死和纤维化发生，组织间无炎性细胞浸润。三组牙鲆的脾和肾也都没有出现病理性变化，2.0%转基因集胞藻组牙鲆的肾小球和肾小管形态正常，肾小嚢腔内无渗出物。牙鲆血清溶菌酶活性测定结果表明，詞料中添加0.5%和2.0%转基因集胞藻显著提高了牙鲆的溶菌酶活性，且0.5%添加组高于2.W添加组；两个实验组与商品饲料对照组比较具有显著差异(P〈0.05)。未转化集胞藻对牙鲆溶菌酶活性也有增强作用，集胞藻对照组的溶菌酶活性显著高于商品祠料对照组(P<0.05)。以上结果表明转牙鲆生长激素基因集胞藻能够提高牙鲆的何料转化率，增强其非特异性免疫能力，促进鱼类快速生长；对牙鲆的行为、成活及组织器官没有不良影响，是一种安全有效的促生长斜料添加剂。实施例9:表达牙鲆生长激素的集胞藻对大菱鲆幼鱼生长、血液及红细胞微核率的影响大菱鲆置实验室水族箱中饲养，体重1.4±0.3g，体长为4.8±0.3cm。随机分为5组，每组25尾。5个处理组分别为商品饲料对照组、集胞藻对照组(伺料中添加1.0°/。集胞藻)以及O.2%、0.5%、1.0%转基因集胞藻组(飼料中分别添力口0.2%、0.5°/。和1.0%转基因集胞藻)。5组养殖^f牛一致(盐度30~31%0、温度17~19。C、溶氧〉7.0mg/l、pH8.0~8.5,每天换水一次，每日饱食投喂3次)，祠养8周。实验开始和结束时，单尾称重，计算各组的平均体重。实验结束后测定血液生理指标，包括红细胞和白细胞数量，并测定血红蛋白、红细胞体积，以及平均红细月&jk红蛋白含量，测定外周血红细胞微核率。结果表明实验期间各组鱼的摄食和游泳等行为活动均表现正常，无死亡发生。摄食转基因集胞藻的鱼，其体重增长高于对照鱼，且呈现剂量一效应关系，转基因藻添加量越高，促生长作用越明显，1.0%转基因藻组鱼的体重增加量比对照组提高了12.98%(P<0.05)，0.2%和0.5%组与两个对照组比较，体重没有显著差异(P>0.05)。商品祠料对照组、未转化集胞藻对照组及三个转基因集胞藻实验组之间，所检大菱鲆幼鱼血液细胞数量、血红蛋白含量及红细胞体积等血液指标均无显著性差异(P〉0.05)。三个实验组的红血细胞数量均比商品饲料对照组略有增加；血红蛋白含量也比对照组有所增高，0.2%、0.5%和1.0。/。转基因集胞藻组的血红蛋白含量分别为49.5g/1、49.3g/1和47.5g/1,而普通饲并+对照组为42.Og/l;三个实验组的红细胞平均血红蛋白含量也略高于对照组；三个实验组的红细胞体积均小于对照鱼(P〉0.05)。三个转基因集胞藻组与两个对照组之间的微核率和核异常率比较，都没有显著性差异(P>0.05),且未表现出剂量一效应关系，表明转基因集胞藻对大菱鲆血液红细胞微核及核异常没有诱导作用。实施例10:表达牙鲆生长激素的集胞藻对大菱鲆生长及生理生化的影响大菱鲆置室内水泥池(2x2x1.6m)中饲养。鱼分为商品饲料对照组和1.0%转基因集胞藻组，每组110尾。两组养殖条件一致恒流砂滤海水、盐度31%。、温度17.0~19.0°C、溶氧〉6.5mg/1、自然光周期、每日饱食投喂2次，每天清扫一次池底粪便和残饼。实验周期为40天，实验期间，每天记录两组鱼的摄食量，每10天测量一次体重和体长。测量前禁食24h。实—险结束后，进行肌肉成分分析、脏体系数和组织病理学检测、血清溶菌酶活性测定。实验期间对两组鱼的日常活动进行了观察，实验鱼没有表现出异常行为，只是其主动摄食的欲望似乎比对照鱼有所增强，表现为纟聂食时游动增强，偶尔会发生抢食行为。两组鱼的成活率没有差别。对两组鱼的生长、摄食和辨料效率进行研究表明，摄食转基因藻的大菱鲆，其体重增长、生长率和斜料转化率都比对照鱼显著提高(P復05),体重增长比对照提高18.54%，生长率比对照提高21.67%，辨料转化率比对照提高了9.84%;摄食转基因藻对鱼的体长和摄食量没有显著影响(P〉0.05)，只是摄食量比对照鱼有所增加。随着饲喂时间的延长，转牙鲆生长激素基因集胞藻对大菱鲆的促生长作用效果越来越明显。转基因藻促进辨料转化率的作用也随着飼喂时间的延长而有所增加(如表2所示)。表2转牙鲆生长因子基因集胞藻对大菱鲆摄食和生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>对大菱鲆的肌肉成分进行分析发现，摄食转牙鲆生长激素基因集胞藻显著提高了大菱鲆肌肉蛋白质的含量(P復05),对照组和1.0%转基因集胞藻组的蛋白含量分别为16.11%和18.16%，实验组比对照组提高12.73%。实验组的水分含量显著降低(P復05)，脂肪含量与对照组没有差别。对肌肉M酸成分进行测定表明，除脯氨酸夕卜(两组含量相同)，其它15种^J^酸含量都比对照鱼有所提高。其中，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨S复和精氨酸都比对照鱼提高了10%以上。摄食转基因集胞藻对必需氨基酸与总tt酸含量之比没有产生影响。对两组鱼进行解剖，肉目&現察未发现有异常组织变化。两组的心、肝和脾的脏体比没有显著差异(P>0.05)。对两组鱼的胃、前肠、后肠、直肠及肝、脾、肾进行组织切片观察，组织结构和细胞形态未见差别。胃体粘膜完整，胃腺结构清晰；小肠绒毛形态正常；肝细胞未见损害，肝内无炎性细胞浸润；肾小球毛细血管丛结构清晰，肾小嚢腔内无渗出物。通过才企测血清溶菌酶活性，结果表明飼料中添力。1.0%的转基因集胞藻提高了大菱鲆血清溶菌酶活性，但与对照相比没有达到显著性差异(P〉0.05)。以上结果进一步证实了转牙鲆生长激素基因集胞藻对异源鱼类具有促进生长和提高辨料转化率的作用，且对异源鱼类也无毒、无害，是一种良好的鱼类生长促进剂。实施例11:表达牙鲆生长激素集胞藻的生物安全性检测选用青岛市动物实验中心的SPF级(清洁级)昆明种小鼠，体重20±2g,许可证号SCXK(鲁)20030010。预养5天后，*遞健康小鼠进行经口急性毒性研究、致畸作用研究、骨髓微核诱导作用研究、精子畸形诱导作用研究。结a明在对小鼠进行灌胃后的一周时间里，各组小鼠摄食与活动正常，M现出中毒症状，各组均无小鼠死亡。表明未转基因集胞藻和转牙鲆生长激素基因集胞藻对小鼠均不具有毒性，二者的LD5。都大于10g/kg。按照我国对化学有毒物品的分级标准，集胞藻和转牙鲆生长激素基因集胞藻属于实际无毒物质。在表达牙鲆生长激素集胞藻对小鼠的母体毒性、胚胎毒性和致畸性的研究中，通过对各组母鼠在期间多个时间点的体重增长进行称重和统计分析表明，转牙鲆生长激素基因集胞藻对孕鼠体重没有影响，三个转基因藻组孕鼠的体重与对照组比较都没有显著性差异(P〉0.05)。灌喂0.5g/kg、2.Og/kg及10.Og/kg转基因藻的母鼠，其生殖才几能与对照组没有差异，其产仔能力和活胎生产率没有受到影响。灌喂转基因藻的三组母鼠都没有产下死胎。灌喂转基因集胞藻的母鼠平均每窝生产活胎鼠的数量与对照母鼠没有差别。对照组、0.5g/kg、2.Og/kg及10.Og/kg转基因藻组母鼠所产胎鼠的雌雄比例分别为i:o.9，i:o.8,i:1.1和i:i，组间比较没有显著差异，表明转基因藻对小鼠后代性别比例不会产生影响。三个转基因集胞藻组母鼠所产胎鼠的体重、体长及尾长与对照组胎鼠比较没有显著差异(P〉0.05),四组胎鼠的胎盘重量也没有差别。灌喂0.5g/kg、2.Og/kg及10,Og/kg转基因集胞藻的三组母鼠均未产生畸形现象，也未产下畸形胎鼠，四组小鼠的外观和生理活动表现正常。对活胎鼠的骨骼进行;险查，四组胎鼠的推骨、肋骨和胸骨均未产生数目及形状上的畸形，其颅骨和四肢骨及盆骨等也显示正常形态。胎鼠内脏器官畸形检查结果表明，摄食转牙鲆生长激素基因集胞藻对胎鼠组织器官没有不良影响，灌喂转基因藻的母鼠所产胎鼠具有正常的延髓、脊髓、舌、目艮、心、肺、食管及消化和泌尿生殖器官。2.Og/kg、5.Og/kg和10.Og/kg转基因集胞藻组小鼠的骨髓细胞微核率与阴性对照组比较均无显著差别(P>0.05)，且没有表现出剂量一效应关系，说明转基因藻对小鼠骨髓细胞微核发生不具有诱导作用。对小鼠的精子进行研究发现，灌喂3.75g/kg、7.5g/kg和10.Og/kg转基因集胞藻的小鼠，其畸形精子数量与水对照组没有显著差异(P〉0.05)，也没有明显的剂量一反应关系。表明转基因集胞藻对'j、鼠精子畸形没有诱导作用，未发现有双头、双^CA^折叠的畸形精子。通过小鼠急性毒性试验、传统致畸试验、骨髓微核和精子畸形试验，证明转牙鲆生长激素基因集胞藻对小鼠不会产生致畸和致突变作用，是一种安全的转基因饲料或饲料添加剂。实施例12:摄食表达牙鲆生长激素集胞藻的牙鲆的安全性评价取实施例8中饲养的牙鲆鱼，将鱼击头处死，取肌肉称重，用组织匀浆器充分匀浆，然后用生理盐水稀释成O.5g/ml的混悬液，分装，-20。C冻存备用。小鼠为购自青岛市动物实验中心的SPF级(清洁级)昆明种小鼠，体重14±2g，许可证号SCXK(鲁)20030010。预养5天后，糸遞健康小鼠用于实验。实验小鼠分为六组。1、2、3、4组各24只小鼠，雌雄各半，分笼祠养，按IO.Og/kg.BW.d剂量分别灌喂商品饲料对照组、集胞藻对照组、0.5%转基因集胞藻和2.0%转基因集胞藻组牙鲆的肌肉，此四组用于^S正摄食了转基因集胞藻的牙鲆对小鼠的生长、生理生化及组织器官等有无影响。5、6两组各10只小鼠，雌;^各半，同笼饲养，分别灌喂商品饲料对照组和2.0%转基因集胞藻组牙鲆的肌肉，此二组用于检验摄食了转基因集胞藻的牙鲆对小鼠生殖才几能的影响。实验过程中对各组小鼠的一般性观察表明，转基因集胞藻飼喂的牙鲆组的小鼠其曰常活动及行为未见异常，各组均无死亡发生。对照组I、对照组II、0.5%转基因集胞藻飼喂的牙鲆组和2.0%转基因集胞藻饲喂的牙鲆组小鼠在8周内的平均摄食量分别为6.32g/鼠.天、5.87g/鼠.天、6.15g/鼠.天和6.58g/鼠.天，统计分析表明各组间无显著差异(P〉0.05)。各组小鼠试验前与试验开始后每周的体重情况经过统计分析表明，在整个实验过程中，转基因集胞藻饲喂的牙鲆组的小鼠体重与两个对照组小鼠相比，均无显著性差异(P〉0.05)。对照组II与对照组I的小鼠相比，其体重也无显著性差异(P>0.05)。对小鼠的血液常规和血液生化指标进行检测，结果表明转基因集胞藻饲喂的牙鲆组小鼠的红细胞数、白细胞数、血红蛋白含量及血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性，尿素氮、肌酐含量等十项指标与对照组相比，均无显著性差异(P>0.05)。对各组小鼠的脏体系数进行计算表明，转基因集胞藻饲喂的牙鲆组小鼠的心、肝、肾、脾系数与两个对照组小鼠相比，均无显著性差异(P〉0.05),两个对照组之间也没有显著性差异。解剖结果显示，所有小鼠的重要脏器和组织，包括心、肝、脾、肺、气管、胃、肠、肾、精嚢、睾丸和子宫等都未发现病理性变化。分别灌胃对照牙鲆和2.0%转基因集胞藻饲喂的牙鲆的10只雌性小鼠(每组5只)均怀孕并顺利产下子代，两组母鼠所产小鼠均无畸形和死胎出现，所产仔鼠的体重无显著差异(P〉0.05)。将幼鼠养至20天时，两组小鼠都没有出现死亡，日常活动和生长发育状况也未见差别。研究结果说明摄食转基因集胞藻的牙鲆对食用它的动物是安全无毒的。当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本
技术领域：
的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。序列表<110〉中国海洋大学<120>转牙鲆生长激素基因集胞藻及其制备方法和应用<160〉10<170〉<210〉1<211>525<212〉腿<213>牙鲆生长激素c腿(cDNAofGrowthhormoneof尸扁7/c雄j^<220><221>CDS<222〉(1)…(522)<223〉<400〉11ATGCAGCCAATCACAGAGAACCAGCGCCTGTTCTCCATCGCTGTTGGTCGAGTTCAGTAT61CTTCACCTGGTTGCTAAGAAACTCTTCAGTGACTTTGAGAACTCACTACAGTTGGAGGAT121CAACGTCTTCTCAACAAAATCGCTTCAAAAGAATTTTGTCATTCAGATAATTTCTTGAGT181CCGATCGACAAACACGAGACACAAGGCAGCTCAGTTCAGAAGCTTTTATCGGTCTCTTAT241CGATTGATTGAGTCCTGGGAGTTTTTCAGTCGCTTCCTGGTCGCAAGTTTTGCTGTGAGG301ACCCAGGTTACATCCAAACTGTCAGAACTGAAGATGGGTCTCCTGAAGCTGATAGAGGCC361AATCAGGATGGAGCAGGTGGATTCTCTGAGAGTTCGGTGCTCCAGCTCACGCCGTATGGA421AACTCTGAACTGTTCGCCTGCTTTAAGAAGGATATGCACAAGGTGGAGACGTACCTGACC481GTGGCCAAATGCCGACTCTTTCCAGAAGCTAACTGCACCCTGTAG<210〉2<211〉174<212〉PRT<213〉重组牙鲜生长激素(recombinantGrowthhormoneof<400〉21METGinProlieThrGluAsnGinArgLeuPheSerlieAlaVal16GlyArgValGinTyrLeuHisLeuValAlaLysLysLeuPheSer31AspPheGluAsnSerLeuGinLeuGluAspGinArgLeuLeuAsn46LyslieAlaSerLysGluPheCysHisSerAspAsnPheLeuSer61ProlieAspLysHisGluThrGinGlySerSerValGinLysLeu76LeuSerValSerTyrArgLeulieGluSerTrpGluPhePheSer91ArgPheLeuValAlaSerPheAlaValArgThrGinValThrSer106LysLeuSerGluLeuLysMetGlyLeuLeuLysLeulieGluAla121AsnGinAspGlyAlaGlyGlyPheSerGluSerSerValLeuGin136LeuThrProTyrGlyAsnSerGluLeuPheAlaCysPheLysLys151AspMetHisLysValGluThrTyrLeuThrValAlaLysCysArg166LeuPheProGluAlaAsnCysThrLeu<210>3<211>397<212〉飄<213〉集胞藻isiAB启动子(promoterofisiABof5y/ec力ocj^〃sPCC6803)<400>31AGCATATATAC虹AATTCTAAATAAGATCTTTTACACCGCTACTGCAATCAACCTCATC61AACAAAATTCCCCTCTAGCATCCCTGGAGGCAAATCCTCACCTGGCCATGGGTTCAACCC121TGCTTAACATTTCTTAATAATTTTAGTTGCTATAAATTCTCATTTATGCCCCTATAATAA181TTCGGGAGTAAGTGCTAAAGATTCTCAACTGCTCCATCAGTGGTTTGAGCTTAGTCCTAG241GGAAAGATTGGCGATCGCCGTTGTGGTTAAGCCAGAATAGGTCTCGGGTGGACAGAGAAC301GCTTTATTCTTTGCCTCCATGGCGGCATCCCACCTAGGTTTCTCGGCACTTATTGCCATA361ATTTATTATTTGTCGTCTCAATTAAGGAGGCAATTCT<210>4<211>2880<212>DNA<213>集胞藻groESL基因(groESLof5)7ec力ocj^〃sPCC6803)<400>41GCCAAGGTCATCTGTAACGGTGAGGAAAAA61CCGATGAACACTCCCCATCGGTAGAAAATC121TGCAAAACGGTGAATATTTGGGGGATGACTTTGTTAAATCAGAAAGAATCTACCTATGTGCTGGGGTAATTGACTTGGTGATGATTGAGGACATTGTCCGTTTCCCCGAGGAGCTTCCAA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>16211681174118011861192119812041210丄216122212281234124012461252125812641270127612821<210><211〉GATCACGATTGCCAAAGAGATTGAACTGGAAGACCATGTAGAAAATACTGGGGTTTCCTTAATTCGCCAAGCGGCTTCTAAAACCAATGATGTGGCTGGGGATGGTACCACCACCGATACGGTTTTGGCCCACGCCATTGTTAAAGAAGGTTTACGCAACGTGGCCGCTGGTGCCAACCCCATTTCCCTCAAGCGGGGTATTGATAAGGCCACTGATTTCCTCGTTGCTCGGATTAAAGAGCATGCCCAACCCGTGGGAGATTCCAAGGCGATCGCCCAGGTGGGAGCCATTTCCGCCGGTAACGACGAAGAAGTTGGCCAAATGATTGCCAATGCCATGGATAAAGTCGGCCAAGAAGGGGTTATTTCCCTCGAAGAAGGCAAATCCATGACCACCGAGTTGGAAATCACCGAAGGGATGCGCTTCGATAAGGGTTATATCTCCCCTTACTTCGTCACCGATGCGGAACGGATGGAAGCTGTCCTGGAAGATCCCCGCATTTTGATCACTGACAAAAAAATCAACTTGGTGCAAGACCTGGTGCCCATCCTTGAACAAGTGGCCCGTCAAGGTAAGCCCCTGTTGATCATTGCCGAAGATATTGAAAAAGAAGCTTTGGCTACCCTCGTAGTTAACCGTCTCCGGGGTGTGTTGAATGTGGCCGCTGTGAAAGCCCCCGGCTTTGGCGATCGCCGTAAACAAATGTTAGAAGACATTGCCACCCTCACCGGCGGTCAAGTAATCAGCGAAGATGCTGGTCTGAAACTGGAAAGCGCCACTGTGGATAGCCTCGGTTCTGCCCGTCGCATCAACATCACCAAAGACAACACCACCATTGTGGCCGAAGGCAACGAAGCCGCCGTTAAGTCCCGCTGTGAGCAAATCCGTCGCCAGATCGAAGAAACCGATTCTAGCTACGACAAAGAAAAACTCCAAGAGCGCTTGGCTAAATTGGCCGGTGGTGTAGCGGTAATCAAAGTCGGTGCTGCTACCGAAACCGAAATGAAAGACCGTAAACTCCGCCTGGAAGATGCCATCAATGCCACCAAAGCCGCTGTGGAAGAAGGTATTGTTCCCGGTGGTGGTACCACCCTGGCCCACTTGGCTCCCCAATTGGAAGACTGGGCCACTGGCAACCTCAAAGATGAAGAGTTAACCGGTGCCCTGATTGTAGCCCGGGCTCTGCCTGCTCCCCTCAAACGGATTGCCGAAAACGCCGGTCAAAACGGTGCGGTTATCTCCGAGCGAGTCAAAGAGAA<212>DNA<213>牙鲆生长激素c腿(c腿ofGrowthhormoneof尸細7/c雄j^<楊>5CGGGATCCATGCAGCCAATCACAGAGAACC<210>6<211〉34<212>DNA<213〉牙鲆生长激素cDNA(cDNAofGrowthhormoneof尸扁〃c雄,s<400>6ATAAGAATGCGGCCGCCTACAGGGTGCAGTTAGC<210〉7<211>33<212>DNA<213>集胞藻isiAB启动子(promoterofisiABof5y/ec力ocj^,/sPCC6803)<400〉7GGAATTCGGGCCCTTGGGCGATCGCCAAAAATC<210>8<211〉29<212〉DNA<213>集胞藻isiAB启动子(promoterofisiABof加ec力oc/"/sPCC6803)<400〉8CGGGATCCAGAATTGCCTCCTTAATTGAG<210〉9<211>19<212〉DNA<213〉集胞藻groESL基因(groESLof加ec力。c/"/xPCC6803)<400>9GCCAAGGTCATCTGTAACG<210>10<211>19<212〉DNA<213〉集胞藻groESL基因(groESLof5y/ec力ocj^"、PCC6803)<400>10TTCTCTTTGACTCGCTCGG权利要求1.一种转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于所述的转基因集胞藻是将牙鲆的生长激素基因转入集胞藻中获得的。2.根据权利要求l所述的转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于所述的转基因集胞藻表达牙鲆的生长激素，该转基因集胞藻已由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.2479。3.根据权利要求l所述的转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于所述的集胞藻为》77ec力oci^〃ssp.PCC6803。4.根据权利要求1或2所述的转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于所述的牙鲆生长激素基因为牙鲆生长〗敫素成熟肽cDNA,含有525bp的核苷酸片段，与序列表第1号序列所示核苷酸序列具有100%的同源性。5.根据权利要求2所述的转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于所述牙鲆生长激素为牙鲆生长激素成熟肽，编码174个氨基酸残基，其分子量为19KDa，其tt酸序列与序列表第2号序列所示的tt酸序列具有100%的同源性。6.根据权利要求4所述的转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于通过将牙鲆的生长激素基因构建载体pZGH,转化集胞藻，获得转基因集胞藻分"ec力oc"〃sSynGH。7.根据权利要求6所述的转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于所述的载体pZGH中，生长激素cDNA的前端为集胞藻的isiAB(铁缺乏诱导蛋白)的启动子，由isiAB启动子来启动生长激素的表达，isiAB启动子长397bp,与序列表第3号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性。8.根据权利要求6所述的转牙鲆生长激素基因集胞藻，其特征在于所述的载体pZGH中，生长激素基因表达框的两侧为集胞藻的groESL基因，以groESL基因作为与集胞藻的基因组DNA发生同源重组的位点，groESL基因长2880bp,与序列表第4号序列所示的核苷S臾序列具有100%的同源性。9.根据权利要求l所述转牙鲆生长激素基因集胞藻的制备方法，其特征在于具有如下步骤[1]牙鲆生长激素cDNA的制备提取牙鲆脑垂体总RNA,设计含有酶切位点BamHI和NotI的引物pingl和ping2,pingl引物序列与序列表第5号序列所示的核苦酸序列具有100%的同源性，ping2引物序列与序列表第6号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，采用逆转录聚合酶链式^^应(RT-PCR)方法，扩增出牙鲆生长激素成熟肽cDNA,测序确定其与预期的序列一致；[2]构建集胞藻转化载体将牙鲆生长激素成熟肽cDNA，经BamHI和NotI双酶切后连入;U^杆菌质粒pUC-pK，构建中间载体pUC-pKGH;大肠杆菌质粒pUC-pK是以pUC18为原始载体，在其多克隆位点中连入isiAB启动子序列和卡那霉素抗性基因序列构建而成的，其中isiAB启动子序列是以集胞藻基因组DNA为模板，以prol和pro2为引物，prol引物序列与序列表第7号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，pro2引物序列与序列表第8号序列所示的核苷S臾序列具有100%的同源性，并在序列两端分别设计了EcoRI和BamHI酶切位点，PCR扩增后经EcoRI和BamHI酶切连入，此外prol引物上还设计了一个ApaI酶切位点，卡那霉素抗性基因的末端具有一个XhoI酶切位点，为连入同源重组片^LgroESL基因内部^t准备；与此同时，以集胞藻的基因组DNA为模板，以groESLl和groESL2为引物，groESLl引物序列与序列表第9号序列所示的核苷酸序列具有100%的同源性，groESL2引物序列与序列表第10号序列所示的核苷S臾序列具有100%的同源性，PCR扩增groESL基因,连入pMD18-simpleT载体中，得到载体pT-gro;采用ApaI和XhoI分别酶切载体pUC-沐GH和pT-gro,连接得到集胞藻同源重组载体pZGH,测序确定生长激素cDNA序列、isiAB启动子序列和groESL序列均与预期的序列一致；[3]牙鲆生长激素基因转化到集胞藻中(1)培养集胞藻至对数生长中期，收集藻细胞，用新鲜培养基洗涤；(2)加入质粒pZGH，将藻细胞与质粒的混合物培养2-10小时；(3)将藻细胞涂布在不含抗生素的BG-ll固体培养基上，恢复培养12-24小时；(4)转移藻细胞到含卡那霉素(5-50|iig/ml)的BG-11固体培养基上，10-14天，转化子长出；(5)将转化子进行PCR鉴定，m选生长速度快的阳性克隆进行大M^莫培养。[4]转牙鲆生长激素基因集胞藻的培养转牙鲆生长激素基因集胞藻于20-30°C下在BG-11液体培养基培养，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，光照强度为25-120,01.m—2.s—，BG-<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>[5]牙鲆生长激素在转基因集胞藻中的诱导表达转牙鲆生长激素基因集胞藻于20-30°C下在BG-11液体培养基培养，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，光照强度为25-120pmo1.m—2.s—'，接种密度OD73。=0.2左右，待其生长进入平台期，转到不^4失的BG-11培养基中继续培养14-20天。10.转牙鲆生长激素基因集胞藻在养殖鲆鲽鱼类的饲料添加剂或飼料中的应用。全文摘要本发明公开了一种转牙鲆生长激素基因集胞藻及其制备方法和应用，所述的转基因集胞藻是将牙鲆的生长激素基因转入集胞藻中获得的，转基因集胞藻表达牙鲆的生长激素。集胞藻增殖快，易培养，具有简单而稳定的同源重组系统，可以实现外源基因在集胞藻中的长期稳定表达，而且集胞藻可以直接作为饲料，得到的表达牙鲆生长激素的集胞藻不需要纯化可以直接用作鲆鲽鱼类养殖的饲料或饲料添加剂，加快鲆鲽鱼类的生长速度，缩短养殖周期。文档编号A23K1/18GK101280274SQ200810109080公开日2008年10月8日申请日期2008年5月23日优先权日2008年5月23日发明者滨刘,刘顺梅,张学成,臧晓南申请人:中国海洋大学