一种高效毒杀植物寄生线虫生物制剂的制备方法

专利名称：一种高效毒杀植物寄生线虫生物制剂的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体指一种利用解淀粉芽孢杆菌(Sad/^ amyfo/!Xaci^s)制备高效毒杀植物寄生线虫生物制剂的方法。
背景技术：
植物寄生性线虫是指寄生于植物且具有独特的取食器官——口针的线虫，目前已记载的 约有200多属5000多种。几乎所有植物都受到线虫的寄生和为害。据联合国粮农组织统计， 全世界每年因线虫为害造成的损失超过1000亿美元。在我国，据报道有近百种线虫病害严重 威胁着农、林、经济等作物。如松材线虫病是一种主要危害松属植物的毁灭性森林病害，具有 易传播、发病速度快、防治难等特点，对松林危害严重，可使松树成片枯死，被称为"森林 的癌症"，该病是国内外的重要检疫对象，至今尚无有效的防治方法。
目前采用化学杀线虫剂进行线虫病害防治仍是最主要的防治措施。但化学杀线剂大多为 高毒、高残留农药，对土壤微生物、植物、水源和大气层易造成严重的污染和破坏，且药物 在植物体内的残留对人类和其它有益生物也易造成危害。如曾广泛应用的杀线化学药剂丰索 磷、灭线磷等因为致畸、致癌以及引起精子减少等原因而逐步被禁用，胺线磷、丁环硫磷等 也已停止开发,现有的大多数药剂品种也存在着农业成本太高、防效不理想甚至是产生药害和 抗性等诸多问题，使植物线虫的化学防治工作面临很大的困境。为此，许多国家的科学家都 努力寻找防治植物寄生性线虫的新途径，利用资源丰富的有益微生物防治植物寄生性线虫一 直为世人所关注，也成为发展新杀线剂的重要途径。解淀粉芽孢杆菌(S. "n^/o/!'g"e/a"'e朋J 是一种好氧、能产生芽孢的细菌。有报道表明解淀粉芽孢杆菌能产生多种抑制植物病原真菌 的抗菌物质，能够有效抑制植物的灰霉病、根腐病以及核盘菌等真菌病害，在生物防治中起 着重要的作用。但迄今未见关于解淀粉芽孢杆菌具有杀线活性的专利和报道。本发明通过研 究测定解淀粉芽孢杆菌生物发酵液的杀线活性、高效产毒培养条件的筛选等，以期制备出高 效的生物杀线剂，这对植物线虫病害的生物防治具有重要的理论指导意义和广阔的实践应用 价值。

发明内容
本发明的目的是将细菌解淀粉芽孢杆菌(及^^/0/^恥/"c/em)经液体发酵后制备成具
高毒杀植物寄生线虫活性的生物制剂。该细菌在本发明筛选出的培养基配方以及特定的培养
条件下其生物发酵液产生了高毒杀线虫的活性和分解线虫体壁的物质，对松材线虫等植物寄 生线虫具有显著的毒杀效果。本发明的技术方案是
扩大培养解淀粉芽孢杆菌；制备生物杀线剂；进行杀线虫的药效实验；确定其杀线虫的 作用和杀线范围。
该杀线生物制剂的制备方法(以下为重量百分比)
1、 解淀粉芽孢杆菌试管种的培养
将解淀粉芽孢杆菌的菌株接种到如下培养基上1~8%的牛肉膏，1~10%的蛋白胨，卜5% 的NaCl， 1.5 2%的琼脂，并将pH调至6.5 8，置3(TC条件下培养24h，获得试管种。
2、 解淀粉芽孢杆菌高效生物i'j剂的制备
将解淀粉芽孢杆菌试管种接种到250ml三角瓶的液体培养基中，液体培养基的配方为 2~10%的牛肉膏，1~10%的蛋白胨粉，0.1~3%的K2HP04， 0.1 1。/。的MgS04, 1~5%的NaCl， 装瓶容积比为2/5，于pH6.5 8， 25~37匸的条件下摇床振荡培养2-15 d，转速为120rpm。将 培养好的发酵液离心20分钟(4000rpm)，上清液即为具有高毒杀线虫活性的生物制剂。
3、 药效测定
将lmL该生物制剂注离心管中，再接入50pL约1000条的松材线虫或其他植物寄生线虫 液并混合均匀。24h后吸取混合液在显微镜下观察并记录死虫数和总虫数。
本发明与现有技术相比，其显著优点是本生物制剂利用解淀粉芽孢杆菌在一定条件下 经液体发酵后提取制备，方法简单，对松材线虫等重要植物寄生线虫毒杀效果显著，且对环 境友好。
具体实施例方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 实施例1
1、杀线生物制剂的制备
将解淀粉芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，25 37'C条件下培养24h，获得试 管种，将试管种制成109cfu/mL的种子液，接种到250mL三角瓶液体培养基中，该液体培养 基配方为2~10%的牛肉膏，1~10%的蛋白胨粉，0.1~3%的K2HP04， 0.1 P/。的MgS04， 1 5% 的NaCl，每瓶装新鲜液体培养基100mL，接种液lmL，于pH6.5-8， 25 37'C的条件下摇床 振荡培养2-15d,转速为120rpm，将发酵培养物于4000rpm,离心20min，上清液为具有高毒 杀线虫活性的生物制剂。对照为无菌液体培养基经4000rpm离心后的上清液。2、供试线虫的培养与制备
先接种灰葡萄孢(&Wto"'wm^)于PDA平板，25'C时和无光照条件下培养至灰葡萄孢 菌丝长满平板后再接入松材线虫，继续培养至灰葡萄孢菌丝消失，线虫长满平板。使用时将 载有线虫的培养基挑出，放入贝尔曼漏斗中，用无菌水将线虫洗出后，离心(2000rpm)消毒 (0.2%硫酸链霉素)浓縮配制成约20条&L的线虫悬液。
3、 药效测定方法将杀线粗提液lmL注入lmL离心管中，再接入50pL约1000条的松材线 虫液并混合均匀。分别于处理后24h吸取混合液在显微镜下观察并记录死虫数和总虫数，以 不接菌的液体培养基粗提液为对照。观察方法为用移液枪取50^L含线虫的混合液于载玻片上 置于显微镜下观察，每处理3个重复，每次观察不少于30条线虫，由于线虫有假死现象，先 在显微镜下观察和记录总虫数，其间每次用移液枪取50pL清水反复刺激，4h后线虫仍僵直 不动就记录为死亡。
4、 试验结果
表1不同浓度的解淀粉芽孢杆菌生物制剂对松材线虫的毒杀活性
处理浓度24h死亡率％24h虫体消解率％
原浓度100100
2倍稀释液100100
4倍稀释液10097.8
10倍稀释液10096,4
00
CK
结果表明该生物制剂原液及稀释2倍、4倍和10倍液对松材线虫的杀线活性均为100%,虫 体的消解率分别为100%、 100%、 97. 8%和96. 4%，说明其具有高的杀线活性。
实施例2
1、 杀线生物制剂的制备同实施例1中的"1"部分
2、 供试线虫的制备香蕉穿孔线虫(i^tfop/w/w"z'/w7/;y)，水稻干尖线虫G4; /^/e"c/w/fi^ ^xse少z') 从寄主植物中通过漏斗法分离，其余线虫的制备同实施例1中的"2"部分。
3、 药效测定方法同实施例1中的"3"部分
4、 试验结果
结果(表2)表明该生物制剂对表2中所列的多种线虫均有杀线活性，对香蕉穿孔线虫、 水稻干尖线虫、松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫等线虫24h杀线率达到100%，对照的杀 线率为0%，说明其具有高的杀线活性且杀线谱较广，具有良好的应用开发前景。表2解淀粉芽孢杆菌生物制剂对不同植物寄生线虫的杀线活性比较
线虫种类24h死亡率％
原浓度2倍稀释液4倍稀释液10倍稀 释液
小杆线虫(朋a繊ssp.)10010010097
霍夫曼尼伞滑刃线虫(5腦"/ /ze/e"c/2jtf / q/^a""/)10010010097
腐生线虫(Pa"dgre〃us recftv/viw)1001008874
李氏长尾线虫(&!'"wra/")100989874
松材线虫(5w，一e/e"c^M"x一pMws)100999949
矛以l^t才线虫(及wwcrowrfz^)100%8839
香蕉穿孔线虫(i acfopAo^ssf'fm'fo)1001005020
7Ji稻干尖线虫(^!p/ze/e"c/zo/(ie51 6ew一)1001009512
大核滑刃线虫(A聽cra"wc/ea加)1005642
吴氏长尾线虫(5W"wra而ae)腦100952
外滑刃科线虫(i^to/^efe"c/n'c/ae sp.)10098110
权利要求
1、一种高效毒杀植物寄生线虫的生物制剂，由生产菌株及辅料经液体培养后提取制备而得。
2、 根据权利要求1所述的生物制剂，其特征在于该生物制剂的生产菌株为解淀粉芽孢杆菌 (5鎖7/ws聽卢/—)。
3、 根据权利要求1所述的生物制剂制备方法，其特征在于该生物制剂的制备包含以下步骤将解淀粉芽孢杆菌试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中，振荡培养一段时间后，将培养 好的发酵液离心20min (4000rpm),收集上清液，即为具高杀线活性的生物制剂。
4、 根据权利要求3所述的生物制剂制备方法，其特征在于所述的液体培养基的配方为2~10% 的牛肉膏，1~10%的蛋白胨粉，0.1~3%的K2HP04， 0.1 1%的MgS04， 1~5%的NaCl;培养 基pH值为6.5~8。
5、 根据权利要求3所述的生物制剂制备方法，其特征在于装瓶容积比为2/5，培养温度为 25~37°C，摇床振荡培养2-15天，转速为120rpm。
全文摘要
本发明涉及一种高效毒杀植物寄生线虫生物制剂的制备方法，属微生物农药技术领域。本发明所涉及的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该生物制剂的制备方法为将解淀粉芽孢杆菌试管种接种到液体培养基(配方为2-10％的牛肉膏，1-10％的蛋白胨粉，0.1-3％的K₂HPO₄，0.1-1％的MgSO₄，1-5％的NaCl)中；装量容积比为2/5，在pH6.5～8、温度25～37℃的条件下，摇床振荡培养，转速为120rpm，2-15天后将培养好的发酵液离心20min(4000rpm)，上清液即为具高杀线活性的生物制剂。经药效测定，本发明产品对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)和水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)等植物寄生线虫毒杀率达100％，开发应用前景广阔。
文档编号A01P5/00GK101584346SQ20081023483
公开日2009年11月25日 申请日期2008年11月19日 优先权日2008年11月19日
发明者叶建仁, 吴小芹, 徐旭凌, 朱丽梅, 陈江天 申请人:南京林业大学