基因组倍增的油菜籽植物、来源于其的组合物和它们的用途的制作方法

专利名称：基因组倍增的油菜籽植物、来源于其的组合物和它们的用途的制作方法
基因组倍增的油菜籽植物、来源于其的组合物和它们的用
途相关的申请本申请要求2007年11月6日提交的美国临时专利申请60/996，213的优先权的权益，其内容通过引用合并在此，如同在此完全地阐述了一样。本发明的领域和背景本发明，在其某些实施方式中，涉及基因组倍增的油菜籽植物、来源于其的组合物和它们的用途。油菜籽(欧洲油菜(Brassica napus))，也称为油菜(rape)、含油种子油菜、芜菁 (rapa)、和(对于一组特定的栽培种来说)油菜(canola)，是十字花科(芥菜或甘蓝科)的开嫩黄色花的成员。为了动物饲料、用于人类消费的植物油和生物柴油的生产，种植油菜籽；主要的生产者包括欧盟、加拿大、美国、澳大利亚、中国和印度。在印度，它在13%的作物地上种植。 根据美国农业部，在2000年油菜籽是世界上植物油的第三大来源，位于大豆和油棕之后， 也是世界的蛋白质膳食的第二大来源，虽然仅是主要的大豆粉的产量的五分之一。世界产量在快速地增长，FAO报道说，在2003-4季生产了 3千6百万吨油菜籽，2004-5生产了 4千 6百万吨。油菜籽是作物的有价值的、收获的部分。该作物还作为冬季覆盖作物种植。它提供了在冬季中土壤的良好覆盖，限制了氮流失。植物被犁回土中，或用作垫草。用于油料生产的油菜籽的加工提供了油菜籽动物粉作为副产物。副产物是高蛋白质的动物饲料，与大豆相竞争。饲料主要用于牛饲养，也用于猪和鸡(虽然用于这些是较低有价值的)。该粉具有非常低的葡糖异硫氰酸盐含量，葡糖异硫氰酸盐对牛和猪中的新陈代谢破坏负责。油菜籽“油饼”在中国也用作肥料，也可以用于装饰，例如，盆景。油菜籽叶子和茎也是可食用的，类似于相关的白菜(bok choy)或散叶甘蓝(kale)。油菜籽是重要的花蜜生产者，蜜蜂从它生产淡色的、但是辛辣的蜂蜜。油菜油(或油菜籽油)含有比例为2 1的ω-6和 ω-3脂肪酸，在ω-3脂肪酸上仅次于亚麻油。油菜油的支持者主张，它是最有益心脏健康的油之一，已经报道了降低胆固醇水平、降低血清甘油三酯水平和阻止超凝结。油菜籽油被用于生物柴油的制造，用于驱动机动车辆。生物柴油可以在更新的发动机中以纯的形式使用而没有发动机损坏，经常以从2%到20%生物柴油的比例与化石燃料柴油组合。以前，由于种植、压榨和精炼油菜籽生物柴油的成本，油菜籽衍生的生物柴油生产起来比标准柴油燃料费用更高。由于为此目的的油菜籽油的提高的需求，油菜籽油的价格当前处在非常高的水平(自2005年11月开始)。油菜籽油在欧洲大部分地区是用于生物柴油生产的优选的油储藏，部分地因为与其他油来源，例如大豆相比，每单位土地面积上油菜籽产生更多的油。因而，油菜籽是重要的和有价值的农田作物。因此，植物育种者的持续目标是开发农业上合理的，稳定的、高产的油菜籽栽培种。这个目标的理由明显地是最大化在所使用的土地上产生的谷粒的数量，和提供动物和人类的食物。为了实现这个目标，油菜籽育种者必需选择和开发具有产生优越的栽培种的性状的油菜籽植物。迄今为止，还没有四倍体油菜籽品种，主要的障碍看来是遗传不稳定性和没有足够的有性繁殖力来实现商业上有价值的杂交。其他的背景技术包括C. MollersjM. C. M. Iqbal and G. R6bbelen;Efficient productionof doubled hapIoid Brassica napus plants by colchicine treatment ofmicrospores,Euphytica, Vol. 75, Numbers 1-2/January, 1994, Springer, Netherlands.Zhang, G. Q. ；Resynthesizing Brassica napus from interspecif ichybridization between Brassica rapa and B. oleracea through ovaryculture. Euphytica 140 (3)，2004.Robert T. Gaeta, J. Chris Pires, Federico Iniguez-Luy, Enrique Leonand Thomas C. Osborn ；Genomic Changes in Resynthesized Brassicanapus and Their Effect on Gene Expression and Phenotype ；The PlantCell 19 :3403-3417. 2007.发明概述根据本发明的某些实施方式的方面，提供了具有倍增的基因组的油菜籽植物，繁殖力至少相同于在类似条件下生长的、与所述基因组倍增植物同基因的整倍体油菜籽植物。根据本发明的某些实施方式，所述繁殖力由以下至少一种确定每棵植物的种子数量；配子繁殖力分析；和乙酸胭脂红染色。根据本发明的某些实施方式，所述植物展现了基因组稳定性至少2次传代。根据本发明的某些实施方式，所述植物具有超过整倍体油菜籽植物的种子重量的
种子重量。根据本发明的某些实施方式的方面，提供了根据布达佩斯条约在NCIMB Ltd.保藏的、登记号NCIMB 41592欧洲油菜(Brassica napus) 187-2-4N的油菜籽植物。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了所述油菜籽植物的植物部分。 根据本发明的某些实施方式的方面，提供了从所述植物或植物部分产生的油菜籽
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了从所述植物或植物部分产生的油菜籽
根据本发明的某些实施方式，所述植物部分是种子。
根据本发明的某些实施方式的方面，提供了所述油菜籽植物的分离的可再生的细根据本发明的某些实施方式，所述细胞在培养中展现了基因组稳定性至少2次传油。粉。胞。代。根据本发明的某些实施方式，所述细胞来自分生组织、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子或茎。根据本发明的某些实施方式的方面，提供了包含所述可再生的细胞的组织培养
4物。根据本发明的某些实施方式的方面，提供了生产油菜籽的种子的方法，包括自交育种或杂交育种所述植物。根据本发明的某些实施方式的方面，提供了生产油菜籽油的方法，所述方法包括(a)收获油菜籽植物或植物部分的种子；和(b)加工所述种子以生产油菜籽油。根据本发明的某些实施方式的方面，提供了产生基因组倍增的油菜籽的方法，所述方法包括在磁场下用G2/M细胞周期抑制物接触油菜籽的种子从而产生所述遗传倍增的油菜籽种子。根据本发明的某些实施方式，所述G2/M细胞周期抑制物包含微管聚合抑制物。根据本发明的某些实施方式，所述微管聚合抑制物选自由秋水仙碱、诺考达唑、 oryzaline、氟乐灵和硫酸长春碱构成的组。除非另外定义，此处使用的所有技术和/或科学术语具有本发明相关技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于在此描述的那些的方法和/或材料可以被用于本发明的实施方式的实践或测试，以下描述了示范性的方法和/或材料。 在冲突的情况下，以本专利说明书，包括定义，为准。此外，所述材料、方法和实施例仅仅是说明性的，不意图是必要地限制性的。附图的简要描述 仅通过举例的方式，参考附图，在此描述了本发明的某些实施方式。现在具体详细参考附图，强调的是，所显示的细节是通过举例的方式，是为了本发明的实施方式的说明性的论述。就此来说，说明书与附图一起，使得本发明的实施方式如何实践对于本领域技术人员来说是显而易见的。在附图中附图IA-D是FACS输出图象，显示了倍增的油菜籽植物(附


图1C_D)对比对照整倍体植物(附
图1A-B)中的碘化丙锭染色。FL2激光被用于检测碘化丙锭染料。流式细胞计分析由直方图显示显示了根据细胞的DNA含量的细胞的分布的单参数的直方图。未倍增的植物的Gl期位于通道300上(Ml)。第二点图直方图显示了所有属于通道300的细胞具有相同的大小(FL2W)。细胞周期的S期被标记为M2。通道600上出现了未倍增的植物的细胞周期的G2(M3)。附图IC和ID画面，M3区域显示了倍增的植物的Gl。根据点图明显的是，细胞移动到600并显示了更大的表型。附图2是倍增的雄性不育植物和倍增的完全繁殖力植物之间的杂交种的不育性状的统计学的表格。附图3A-F是显示了根据当前的教导产生的倍增的油菜籽与整倍体植物之间就荚果大小、种子数量、种子大小和花大小而言的差异的照片。本发明的实施方式的说明本发明，在其某些实施方式中，涉及基因组倍增的油菜籽植物、来源于其的组合物和它们的用途。在详细地解释本发明的至少一个实施方式之前，要理解的是，本发明不必要地将
5它的应用限于以下说明所阐述的或通过实施例所例示的细节。本发明能有其他的实施方式或者能以各种方式实践和进行。为了动物饲料、用于人类消费的植物油和生物柴油的生产，种植油菜籽。主要的生产者包括欧盟、加拿大、美国、澳大利亚、中国和印度。在印度，它在13%的作物地上种植。 多年来，科学家努力提高种子的总体油含量而不影响农学性能。为了满足这些需求，本发明人鉴定了用于油菜籽植物种子中基因组倍增的条件。 根据当前的教导产生的基因组倍增的油菜籽提供了子代植物，所述子代植物的特征在于与它们的同基因的整倍体植物一样高的产量(例如，种子产量、油产量)和繁殖力。因而，根据本发明的某些实施方式的方面，提供了具有倍增的基因组的油菜籽植物，繁殖力至少相同于在类似条件下生长的、与所述基因组倍增植物同基因的整倍体油菜籽植物。在此使用的，用语“油菜籽植物”是十字花科(芥菜或甘蓝科)的开嫩黄色花的成员，也称为油菜、含油种子油菜、芜菁、油菜籽以及对于一组特定的栽培种来说，油菜 (canola)0油菜籽是两个基因组(即，A基因组和C基因组)形成的二元的异源四倍体(即， 双二倍体)，具有总共38个染色体。A-基因组部分来源于芸苔(Brassica campestris)，由 20个染色体组成。C-基因组部分来源于甘蓝(Brassica oleracea)，由18个染色体组成。 上文描述的具有38个染色体的油菜籽植物在此称为整倍体(即，未倍增的)。在本发明的某些实施方式中，整倍体植物是同基因的。在此使用的，整倍体植物是与倍增的植物同基因的，即，染色体的组含有在所有位置上基本上相同的等位基因。整倍体植物可以是天然发生的，遗传修饰的或育种产物。本发明的某些实施方式的油菜籽植物是指整个植物或其部分，加工的或未加工的 (例如，种子、油、干燥组织、粉、块，等等)、可再生的组织培养物和由此分离的细胞。在此使用的，术语“倍增的基因组”是指一种植物，其中存在与同基因的整倍体祖代相比更高的(例如，双倍的)倍性，也就是比整倍体植物更高的染色体拷贝数(例如，5N、 6N、7N、8N、10N)。根据本发明的某些实施方式，所述基因组倍增的植物是同源多倍体，S卩，染色体复制的结果。在此使用的，术语“有繁殖力的”是指有性繁殖的能力。繁殖力可以利用本领域公知的方法来分析。可以分析以下参数以测定繁殖力种子的数量；配子繁殖力可以通过例如在蔗糖底物上的花粉发芽来测定；以及花粉繁殖力，例如显微镜下利用乙酸胭脂红分析的，其中有繁殖力的花粉被染色。根据本发明的某些实施方式，成熟的倍增的油菜籽植物当在相同的条件下生长时具有与它的同基因的祖代至少大约相同(+/-10%)的种子数量；任选地，进一步有至少 90%有繁殖力的花粉被乙酸胭脂红染色；以及做为选择或另外地，至少90%的种子在蔗糖上发芽。为了表征本发明的倍增的植物的性状(例如，繁殖力、产量、生物量和活力)进行的分析一般与它的同基因的祖代(即，整倍体植物)在处于与测试的植物相同的发育年龄和在类似的生长条件下时比较地进行。
因而，根据本发明的某些实施方式，基因组倍增的植物具有与整倍体油菜籽植物相比更大的叶表面积。在示范性的实施方式中，叶面积比整倍体植物的大30% -100%，叶厚度是整倍体植物的至少1. 5-2. 5倍。根据本发明的某些实施方式，基因组倍增的植物具有与整倍体油菜籽植物相比更大的气孔表面。在示范性的实施方式中，所述气孔表面积是所述整倍体植物的至少1. 5-2. 5倍。根据本发明的某些实施方式，所述基因组倍增的植物能够与整倍体植物杂交育种。根据本发明的某些实施方式，基因组倍增的具有比整倍体植物更高的光合效率。根据本发明的某些实施方式，所述基因组倍增的植物稳定至少4、5、7、9或10代。在此使用的，术语“稳定的”是指染色体或染色体拷贝的数目，其在几代间保持恒定，而所述植物不显现以下参数的至少一种中的实质性降低产量、繁殖力、生物量、活力。根据本发明的某些实施方式，基因组倍增的植物具有的种子产量(通过以下至少一项确定的种子数量、种子大小和体积油含量)至少类似于在相同条件下生长和具有同样的发育龄的同基因的整倍体植物。根据本发明的进一步的实施方式，所述种子产量超过所述整倍体植物至至少约1. 25、1. 5,1. 75,2,2. 5、3或5倍。根据本发明的某些实施方式，所述多倍体植物具有至少与同基因的整倍体植物类似的种子产量(通过以下至少一种测定的种子数量、种子大小和体积油含量)。根据本发明的进一步的实施方式，所述种子产量超过所述整倍体植物至至少约1. 15、1.25、1.5、 1. 75,2,2. 5、3 或 5 倍。根据本发明的进一步的实施方式，所述种子重量超过所述整倍体植物至至少约 1. 15、1. 25、1. 5,1. 75,2,2. 5、3 或 5 倍。本发明的这个方面的植物可以利用colchicination的改进的方法产生，如下本发明的多倍体植物可以利用如下文所描述的colchicination的改进的方法来产生。在蒸馏水中在27°C的温度下使种子发芽8小时。此后，在包含以下的倍增溶液中浸泡种子20小时0. 5%秋水仙碱0.5% DMS0、0. 03% Triton χ 100。最后，洗涤种子，在 27°C在适合的发芽床上播种。另外地或作为选择，本发明的倍增的油菜籽植物可以利用秋水仙碱或任何其他细胞周期抑制物(例如，G2/M期抑制物，例如，微管组装抑制物，例如，秋水仙碱、长春碱、诺考达唑、oryzaline和氟乐灵)产生，其中靶向试剂是磁场，用于抑制物向染色质丝的靶向递送。这种方法的具体实施方式
在下文中提供。值得注意的，进行测量来维持每个期的标明的PH值(例如，用HCl或NaOH)。阶段一-3小时种子在的温度下在暗处在陪氏培养皿中在包含0.5% DMS0、滴定到pH 5. 6的硫酸长春碱(0. 1% ν/ν)溶液中孵育。监测ρΗ条件以在这个阶段自始至终维持恒定的PH 值(5. 6)。器皿置于1300高斯的磁场中，其中磁铁相互距离10. 5cm放置。阶段二-3小时
种子在上述溶液中在日光条件下4°C孵育，pH值滴定到6。阶段三-6小时种子在上述溶液中在日光条件下20°C孵育，pH值滴定到5. 4。阶段四-12小时种子在日光条件下孵育，pH值滴定到6。除去磁场，诺考达唑添加到5m/ml的浓度。阶段五-12小时种子在恒温条件)下在日光下孵育。种子在水中充分洗涤以提高pH值到7。此后，种子播种到合适的生长床中，在^TC 长日光条件(16小时)下。利用上述的教导，本发明人建立了遗传倍增的油菜籽植物，例如，根据布达佩斯条约在NCIMB Ltd.保藏、具有登记号NCIMB 41592欧洲油菜187-2-4N。一旦被建立，本发明的油菜籽植物可以有性地或无性地繁殖，例如通过利用组织培养技术。在此使用的，用语“组织培养”是指可以由其产生油菜籽植物的植物细胞或植物部分，包括植物原生质体、植物愈伤组织、植物块和植物细胞，它们是植物中完整的，或是植物的部分，例如，种子、叶、茎、花粉、根、根尖、花药、胚珠、花瓣、花、胚、纤维和荚。根据本发明的某些实施方式，培养的细胞在培养中展现了基因组稳定性至少2、3、 4、5、7、9或10次传代。产生植物组织培养物和从组织培养物再生植物的技术是本领域公知的。例如， 这样的技术有 Vasil. , 1984. Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants, Vol I, II, III, Laboratory Procedures and TheirAppIications, Academic Press, New York ；Green et al. , 1987. Plant Tissueand Cell Culture, Academic Press, New York ；Weissbach and ffeissbach. 1989. Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press ；Gelvin etal.,1990, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer AcademicPublishers ；Evans et al. ,1983,Handbook of Plant Cell Culture,MacMillian Publishing Company, New York ；禾口 Klee et al. ,1987. Ann. Rev. of Plant Phys.38 467486。组织培养物可以从组织的细胞或原生质体产生，所述组织选自由种子、叶子、茎、 花粉、根、根尖、花药、胚珠、花瓣、花、胚、纤维和荚构成的组。要理解的是，本发明的植物还可以用于与其他油菜籽植物一起植物育种(S卩，自交育种或杂交育种)以产生展现了本发明的油菜籽植物的至少某些特征的新的植物或植物系。用任何这些与其他植物杂交产生的植物可以在谱系育种、转化和/或回交中利用，来产生其他的栽培种，其展现了本发明的油菜籽植物的特征和任何其他期望的形状。本领域公知的采用分子或生物化学的操作的筛选技术可以用于确保追求的重要商业特征保留在每个育种世代中。回交的目标是改变或替换回归亲本系中的单个性状或特征。为了实现这一点， 回归的亲本系的单个基因被来自非回归系的期望基因取代或补充，而保持基本上所有其他期望的基因，因而，保持原始系的期望的生理学和形态学构造。特定非回归亲本的选择将取决于回交的目的。主要目的之一是为植物增加某些商业上期望的、农学上重要的性状。确切的回交方案将取决于要改变或添加的特征或性状，来确定合适的测试方案。当要转移的特征是显性等位基因时，虽然回交方法被简化了，隐性等位基因也可能被转移。在这种情况下，可能需要引入子代的测试来确定期望的特征是否被成功地转移。同样地，转基因可以利用本领域的技术人员公知的多种已建立的转化方法的任一种来导入植物中，例如:Gressel. ,1985. Biotechnologically ConferringHerbicide Resistance in Crops The Present Realities，In :Molecular Formand Function of the plant Genome，L van Vloten-Doting, (ed.), PlenumPress, New York ；Huftner, S.L.，et al.，1992，Revising Oversight ofGenetically Modified Plants，Bio/Technology ；Klee，H.，et al.，1989， PlantGene Vectors and Genetic Transformation :Plant Transformation SystemsBased on the use of Agrobacterium tumefaciens， Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants ；and Koncz, C.，et al. 1986，Molecularand General Genetics要理解的是，本发明的油菜籽植物(祖代或倍增的)可以遗传地修饰，例如，以引入感兴趣的性状，例如，改善的油成分和对压力(生物的或非生物的)的增强的抗性。对于改变油菜籽植物的油成分有用的核酸序列和油菜籽转化方法、以及可用于其的核酸构建体的非限制性实例在美国专利号6，974，893中描述了，通过全面引用将其合并在此。根据本发明的某些实施方式，倍增的油菜籽的脂肪酸成份与整倍体油菜籽植物是大约相同的，然而不同成分的水平可以变化。因而，本发明提供了新的油菜籽植物和栽培种，以及用于产生它们的种子和组织培养物。根据当前的教导产生的油菜籽植物可以被进一步加工来产生油菜籽植物产品，其通常用于许多工业应用，包括动物饲料、用于人类消费的植物油和生物柴油。美国专利号6，441，278提供了加工油菜籽的示范性的方法，通过引用完全地合并在此。以下是非限制性的描述。采集油菜籽种子，通过本领域已知的技术压碎。种子一般用水对种子喷雾以提高水分到例如8. 5%来调整。调整的种子利用平滑滚压器，例如0. 23到 0. 27mm的间隙设置的来压片。可以对压片施加热量来使酶失活，促进进一步的细胞破裂，聚结油滴，以及团聚蛋白质颗粒，以便于提取工艺。一般地，通过螺旋压榨机从压片中压出大部分的油，来从加热的油菜籽压片中除去油。产生的压块含有一定的残油。产自压榨操作的粗制油一般通过具有槽隙的管线导流顶部的沉淀池来除去螺旋压榨操作中与油一起榨出的固体。澄清的油可以通过板框式滤器来除去其余的微细固体颗粒。从螺旋压榨操作产生的油菜籽压块可以用商售的正己烷提取。从提取工艺回收的油菜籽油与来自螺旋压榨操作的澄清油组合，产生混合的粗制油。一般通过在添加了食品级磷酸的分批精炼槽中加热，从粗制油中除去游离脂肪酸和胶质。酸用来将非可水合的磷脂转变为可水合的形式，以及螯合粗制油中存在的次要金属。随着皂脚一起从油中除去磷脂和金属盐。油-酸混合物用氢氧化钠溶液处理来中和酸-油混合物中的游离脂肪酸和磷酸。中和的游离脂肪酸、磷脂等等(皂脚)从中和的油中导出。可以进行水洗涤来进一步降低油的皂含量。如果希望，通过本领域已知的技术，油可以在使用之前漂白和脱臭。预计的是，在从本申请成熟的专利期间，许多相关的油菜籽产品将被开发，本专利的范围意图预先包括所有这些新的技术。在此使用的，术语“约”是指士 10%。术语“包含(comprises)”、“包含(comprising) ”、“包括(includes) ”、“包括 (including) ”、具有(having) ”和它们的同根词意味着“包括但不限于”。这个术语涵盖术语“由......组成”和“基本上由......组成”。用语“基本上由......组成”意味着组合物或方法可以包括其他成分和/或步
骤，但是仅当所述其他成分和/或步骤不实质上改变所要求的组合物或方法的基础的和新的特征时。如在此使用的，单数形式“一”和“该”包括复数的指代，除非上下文明显地另外指示了。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括复数种化合物，包括其混合物。在整个本申请中，本发明的各种实施方式可以以范围的形式呈现。要理解的是，范围形式的描述仅仅是为方便和简洁起见，不应被看作是对本发明的范围的固定的限制。因此，范围的描述应当被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内单独的数值。例如， 从1到6的范围的描述应当被认为具体公开了子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到 6、3到6，等等，以及该范围内单独的数字，例如，1、2、3、4、5和6。这是不考虑范围的宽度而适用的。无论何时在此标明数值范围时，这意味着包括该指定的范围内的任何引证的数字 (分数或整数)。用语“范围在”第一表明的数字和第二表明的数字“之间”，以及“范围从” 第一表明的数字“到，，第二表明的数字，在此可互换地使用，意味着包括第一和第二表明的数字以及它们之间的所有分数和整数的数字。如在此使用的，术语“方法”是指用于实现给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的，或易于从已知的方式、手段、技术和步骤发展出的那些方式、手段、技术和步骤。要理解的是，为了清楚而在独立的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以组合于单个实施方式中提供。反之，为了简洁起见在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以单独地、或以任何适合的组合、或适当时在本发明的任何其他描述的实施方式中提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的基本特征，除非所述实施方式没有那些元素是不起作用的。上文中描述的以及在以下的权利要求小节中要求权利的本发明的各种实施方式和方面可以在以下实施例中找到实验支持。
实施例现在参考以下实施例，其与上文的描述一起，以非限制性的方式说明了本发明的某些实施方式。实施例1
10
多倍体油菜籽植物的产生中国安徽省的农业学院提供了两个雄性亲本系(CHAR0 1和CHARO 8)和一个具有遗传性不育性的母系(CHA0 1)。利用根据在此描述的任何方案的无突变基因组倍增 (MFGM)技术，这些亲本系经历基因组倍增处理。处理的植物在幼苗期经历初步选择，之后种植在由昆虫网保护的区域。当植物发育到第五片真叶的水平时，它们全部在FACS仪器(荧光活化的细胞分选器)中测试基因组倍增。简要地，通过浸入到切剁缓冲液中30秒，从2cmX2cm叶组织中释放核。切剁缓冲液由每500ml蒸馏水4. 575克MgCl2,2. 095克MOPS,4. 4克柠檬酸钠、1 克DTT、1.65克Triton χ 100组成。切剁用刀片在一个方向上进行。切剁的组织转移到陪氏培养皿并置于冰上。样品在使用之前过滤OO目)。核样品(2CC-6CC)转移到FACS试管，15 μ 1碘化丙锭(PI)添加到每个样品中。在15分钟之后，样品在装备有在15mW下运行的Cyonics氩激光器G88nm)的流式细胞计中分析。超过635nm的荧光被门滤，结果显示为IOM个通道的每个中核的数量的单参数直方图。对照固定到通道300。附图IA-D显示了对照整倍体植物对比多倍体植物的FACS仪器的输出。所有基因组倍增的植物通过在含有蔗糖溶液的背景上发芽花粉来测试花粉繁殖力。仅花粉繁殖力是完整的、以及在可视显微镜检查下花粉粒表现为未受损的植物被保留在田地里，用于自花授粉和产生Fl杂交种。当种子成熟时，从来自两种中国雄性品种 CHARO 1和CHARO 8的每一个的50个倍增植物采集自花授粉种子。种植这些种子来测试2 代稳定性，仅稳定的株系被保留用于计划的其余部分。进行所有有繁殖力的倍增植物之间， 以及所有来自CHAO 1母系的倍增的不育植物之间的杂交。仅具有Aaaa基因型的植物能够维持不育系，Aaaa X aaaa交配的配子的分布在附图2中示出。种植所有杂交后代用于后代测试，以定位1 1分开可繁殖和不育的群体。在任何这些群体中，不育植物用采集自可繁殖植物的花粉受精，以维持不育系。对于包括4个重复的比较性的田间测试，种植杂交四倍体种子。实施例2通过花粉发芽和荚果数量测定的多倍体繁殖力已知油菜籽多倍体具有较低的花粉繁殖力，因而在荚果中较低的种子数量。为了测试根据当前的教导产生的多倍体的繁殖力，2N油菜群体中的发芽百分比和每荚果种子数与使用“MFGM”技术产生的多倍体同基因的4N系相比较。在开花期，采集花粉，并在糖溶液上发芽。简要地，种子在^TC在蔗糖床蔗糖和2mM H3BO3)上孵育12小时。此后评估发芽。发芽百分比通过在显微镜下对发芽的花粉粒计数来计算。在完整的荚果长成之后，采集来自同一植物的所有10个上部荚果的种子， 并计数。结果表1-花粉发芽和每荚果种子数QN-未倍增的；4N-倍增的)
权利要求
1.一种具有倍增的基因组的油菜籽植物，繁殖力至少相同于在类似条件下生长的、与所述基因组倍增植物同基因的整倍体油菜籽植物。
2.权利要求1的植物，其中所述繁殖力通过以下至少一种确定 每棵植物的种子数量；配子繁殖力分析；和乙酸胭脂红染色。
3.权利要求1的植物，展现了基因组稳定性至少2次传代。
4.权利要求1的植物，具有超过所述整倍体油菜籽植物的种子重量的种子重量。
5.一种油菜籽植物，根据布达佩斯条约在NCIMB Ltd.保藏，登记号NCIMB 41592欧洲油菜 187-2-4N。
6.权利要求1-5的任一项的油菜籽植物的植物部分。
7.从权利要求1-6的任一项的植物或植物部分产生的油菜籽油。
8.从权利要求1-6的任一项的植物或植物部分产生的油菜籽粉。
9.权利要求6的植物部分，是种子。
10.权利要求1-5的任一项的油菜籽植物的分离的可再生的细胞。
11.权利要求9的细胞，在培养中展现了基因组稳定性至少2次传代。
12.权利要求10的细胞，来自分生组织、花粉、叶、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子或茎。
13.包含权利要求10或12的可再生的细胞的组织培养物。
14.一种产生油菜籽的种子的方法，包括自交育种或杂交育种权利要求1-5的任一项的植物。
15.一种生产油菜籽油的方法，所述方法包括(a)收获权利要求1-6的任一项的油菜籽植物或植物部分的种子；和(b)加工所述种子以生产油菜籽油。
16.一种产生基因组倍增的油菜籽的方法，所述方法包括在磁场下用G2/M细胞周期抑制物接触油菜籽种子从而产生所述遗传倍增的油菜籽种子。
17.权利要求16的方法，其中所述G2/M细胞周期抑制物包含微管聚合抑制物。
18.权利要求17的方法，其中所述微管聚合抑制物选自由秋水仙碱、诺考达唑、 oryzaline、氟乐灵和硫酸长春碱构成的组。
全文摘要
一种具有倍增的基因组的油菜籽植物，繁殖力至少相同于在类似条件下生长的、与所述基因组倍增植物同基因的整倍体油菜籽植物。
文档编号A01H5/00GK102170773SQ200880124139
公开日2011年8月31日 申请日期2008年11月6日 优先权日2007年11月6日
发明者A·勒纳, A·阿维多夫 申请人:凯伊马生物农业技术有限公司