专利名称：棉花类固醇5α-还原酶基因的用途及含有其的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及棉花类固醇5a-还原酶基 因的用途，含有该基因的编码蛋白质及植物表达载体；本发明还涉及制备含上 述基因的转基因植物的方法。
背景技术：
植物特别是农作物和林木的根系是它们从土壤中吸收水分和无机盐养分 的主要器官，同时也是植物固着的主要器官，因此，植物根系发育对植物地上 部分的生长和农作物的产量起着至关重要的作用。各种植物的根形态有所不 同，但根的基本功能相同。根由主根、侧根或不定根组成。主根是由种子根(胚 根)发育成的，与茎相连，向下生长。从主根向四周生出的根称为侧根，侧根 还可以再生出侧根。从茎或叶上直接长出的根，称为不定根。 一株植物的所有 根总起来叫根系，根系可分为直根系(如双子叶植物的根)和须根系(如单子 叶植物的根)两大类。根吸收水分和无机盐的主要部位是根毛，根毛是根尖表 皮细胞向外突出的毛状物。数量很多，集生于根尖的根毛区。根毛的寿命很短， 约1周左右即行萎蔫脱落。随着根尖的生长，在新的部位又生出新的根毛。
植物根系的发育同样也受植物激素的调控，研究历史比较长的植物激素如 生长素、细胞分裂素、脱落酸等对植物根系生长发育的作用已经有比较深入的 研究。油菜素类固醇物质(Brassinosteroids， BRs)是一类新型的植物激素， 研究历史较短。但由于其在植物生长发育过程中具有重要作用，研究者在多个 方面进行广泛的研究。许多研究结果都证实外施BL (Brassinolide， 一种生物 活性最高的BRs)能够促进植物根系发育(Bmssinosteroids interact with auxin to promote lateral root development in arabidopsis. Plant Physiology, 2004, 134)。但 这些报道都是外源施用BL的结果，利用植物基因工程技术，获得超量表达或 抑制BRs生物合成酶基因的转基因材料，以此研究某种具体BRs与某个具体 的合成酶基因对植物根系生长发育的影响还少有报道。DET2 (de-etiolated2，拟南芥类固醇5a-还原酶)是BRs生物合成途径中 催化较早反应的酶，催化菜油甾醇转化成菜油甾烷醇(The Ambidopsis de-etiolated2 mutant is blocked early in brassinosteroid biosynthesis. Plant Cell, 1997,9)。后来详细的研究表明DET2催化该转化过程中(24R) -24-甲基-胆甾 基-4-烯-3-酮到(24R)-24-甲基-5a-胆甾烷-3-酮的5a还原反应(Arabidopsis det2 is defective in the conversion of (24R)-24-methylcholest-4-en-3-one to (24R)-24-methyl-5alpha-cholestan-3-one in brassinosteroid biosynthesis. Plant Physiology, 1999， 120)。随后研究结果表明，DET2催化的反应是BRs生物合 成途径中主要的限速步骤。超量表达Z)五n的转基因拟南芥在光下生长明显比 野生型株型要大，生物生长量比野生型增大100%-150%;而转D五J2反义基 因的拟南芥植株得到了一系列表现型，株高从类似的极度矮化型到正常 株高的野生型(Brassinosteroid actions in plants. Journal of Experimental Botany, 1999,50)，说明拟南芥类固醇5a-还原酶基因的表达水平与植物的生长发育有 密切关系。
为了研究类固醇5cc-还原酶基因在棉花纤维生长发育中的作用，通过筛选 与拟南芥类固醇5a-还原酶(DET2)同源的棉花EST序列，并对候选EST序 列进行拼接和克隆测序，获得一段序列后，再进行3'-^0￡得到棉花类固醇501-还原酶基因的全序列，最后从棉花纤维中克隆棉花类固醇5a-还原酶基因(下 称GM)五T2基因)。利用体外还原系统证明了 GW)五77具有类固醇5a-还原酶 活性，进而构建超量表达和反义抑制G/lC^72基因的植物表达载体并进行棉 花的遗传转化，结果证明在棉花中抑制GW)5J2的表达使转基因棉花的生长 受到强烈的抑制，纤维细胞的起始数量减少，纤维的伸长受到抑制，难以得到 成熟的种子和纤维；相反，在纤维中适当提高GM)E"的表达，可以促进纤 维的起始和伸长，说明G/lD五T2基因在棉花纤维生长发育中具有重要作用 (G7 D五27, a steroid 5a-reductase, plays an important role in cotton fiber cell initiation and elongation. Plant Journal, 2007， 51)。
到目前为止，拟南芥、番茄、豌豆、牵牛和棉花中的类固醇5a-还原酶基 因已被克隆和鉴定，但DET2对根系生长的影响的报道还没有见到。
发明内容
4本发明的一个目的在于提供棉花类固醇5ct-还原酶基因 (Gossypiumhirsutum steroid 5a-reductase)的用途，即在促进植物根系发育中
的应用。
本发明另一目的在于提供含有该G/^E72基因的植物表达载体。 本发明又一目的在于提供制备基于本发明植物表达载体的转基因植物的 方法。
根据本发明的一方面，所述的编码棉花类固醇5a-还原酶基因具 有如下核苷酸序列
1) 如SEQIDNO. l所示的核苷酸序列；或者
2) 与SEQIDNO. 1的核苷酸序列具有80%以上，优选90%以上同源性， 且编码相同功能蛋白质的核苷酸。
由上述G/lD￡77基因编码的蛋白质，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸残 基序列或将SEQ ID NO.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取 代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0.2的氨基酸残基序列相同生物活性的由 该序列衍生的蛋白质。
根据本发明的另一方面，提供的植物表达载体至少包含编码棉花类固醇 5a-还原酶GhDET2的核苷酸和启动子序列，所述植物表达载体通过将编码棉 花类固醇5a-还原酶基因G/lD五"、启动子序列与表达载体可操作地连接而构 建。为了筛选和表达的需要，还可选地在表达载体中包含筛选基因序列、报告 基因序列以及其他的为基因工程操作的需要而插入的各种内切酶位点，筛选基 因和报告基因可以从本领域常用的基因序列中选择，优选地，本发明的植物表 达具有如图l所示的结构。
用于构建本发明植物表达载体的启动子优选为组成型启动子或组织特异 性启动子，例如，根特异型启动子，更优选的是来源于花椰菜花叶病毒的植物 组成型启动子CaMV35S。通常，将G/lD五72基因构建在CaMV35S的下游。
在本发明的一个具体实施方案中，首先构建含有CaMV35S启动子序列的 表达载体pBI121-35S-NOS双元质粒载体，然后将G7^Z)^"基因正向插入植物 表达载体中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GW)￡72基因的植物 表达载体pBI121-35S-GM^72-NOS，其具有如图4所示的结构，该表达载体 同时包含了报告基因GUS序列，筛选基因序列(卡拉霉素抗性)和用于基因操作的各内切酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基 因和各基因操作序列均是可替换的，本发明并不对此进行限制。
根据本发明的另一方面，提供一种转化体，利用电击法或冻融法等方法处 理，将本发明的植物表达载体转染宿主而获得转化体，该转化体可用于转化植 物获得转基因植物。优选的宿主为农杆菌菌株。
根据本发明的再一方面，提供制备含有G/zZ)五72基因的转基因植物的方 法。将本发明的G/lOKT2基因与启动子构建植物表达载体，将所述植物表达 载体转化宿主获得含G力"f72基因的转化体，用所述转化体转化植物获得转 基因植物。
本发明提供了 基因的新用途，成功地构建了包含G/lD五"基因
和启动子的植物表达载体，并以该表达载体转化植物获得转基因植物，在转基 因植物中G/lD￡77基因被超量表达。通过对转基因烟草表型变异的分析，发 现超量表达基因能够促进主根的伸长生长，侧根的发生和伸长生长， 以及不定根的生长和根毛的生长。因此G/lD五77基因对整个植物根系生长具 有促进作用；同时，该基因的超量表达也能增加转基因烟草的生物生长量和果 实种子产量，这对于培养优良的作物品种具有重要的理论和实际意义。
图l:含(^/)￡"基因的植物表达载体的结构图，其中
35S，代表CaMV35S启动子；G/lD五72:代表G/lD￡72基因cDNA ; term, 代表终止子；LB，代表T-DNA左边界；RB，代表T-DNA右边界。
图2: pBI121-35S-NOS双元质粒载体的构建流程图，其中
NPTII，新霉素磷酸转移酶基因；GUS， p-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV35S， 来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子；Nosterm， Nos终止子；LB， T-DNA左边界；RB， T-DNA右边界。
图3:组成型启动子CaMV35S调控下的棉花类固醇5a-还原酶基因 (^"￡72表达载体的构建流程图
Amp，氨苄青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸转移酶基因；GUS， (3-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV35S，来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子； Nosterm， Nos终止子；LB， T-DNA左边界；RB， T-DNA右边界。用于构建植物表达载体的骨架载体为pBI121基础上改造的pBI121-35S-NOS载体，具有 CaMV 35S启动子调控下的GUS基因，便于在植物遗传转化的过程中对转化 子进行GUS染色的筛选。
图4:本发明优选的植物表达载体P6-G/LDE72结构图5: GM)￡72基因在转基因烟草中的RT-PCR分析
以野生型烟草和转基因烟草植株的叶片为材料，提取总RNA，通过反转 录合成单链cDNA，然后用GAZ^T2的特异引物D6P1和D6P2 (SEQ ID NO.3 和SEQIDN0.4)进行扩增(图5上)。为确定各样品单链cDNA合成的质量 和浓度，以烟草的Ubiquitin特异引物Ubi-up和Ubi-down (SEQ ID N0.9和 SEQIDNO.10)进行扩增(图5中)。为排除转基因烟草基因组DNA的污染， 直接以总RNA为模板进行扩增(图5下)。WT，野生型烟草；f/S/， Ubiquitin; 1、 2、 3、 4分别为转基因烟草的2#、 13#、 18#和19#植株。
图6:转基因烟草和野生型烟草的主根生长
A，野生型烟草种子播种后4天的主根生长情况。B，转基因烟草(TOD2) 种子播种后4天的主根生长情况。C，野生型烟草种子播种后6天的主根生长 情况。D，转基因烟草(TOD2)种子播种后6天的主根生长情况。E，转基因 烟草(TOD2)和野生型烟草在沙中生长30天的主根长度。F，转基因烟草种 子和野生型烟草种子播种后6天时的主根长度。WT，野生型烟草；TOD2 TOD19,超量表达^力1^72基因的转基因烟草株系2#至19#。 G，转基因烟草 (TOD2)与野生型烟草主根的生长速度。WT，野生型烟草；TOD2，超量表 达G/lD￡72基因的转基因烟草株系2弁。
图7:转基因烟草的侧根发育
A，播种后10天的野生型烟草根系，标尺长lcm。
B，播种后IO天的转基因烟草根系，标尺长lcm。
图中箭头表示主根上侧根的发生部位。
图8:转基因烟草的根毛发育
A，萌发的野生型烟草种子(浸种60小时)；B，萌发的转基因(TOD2) 烟草种子(浸种60小时)；C，野生型烟草的根毛(播种后10天)；D F，不 同转基因烟草株系的根毛(播种后10天)。
图9:转基因烟草不定根的生长取转基因烟草T,代无菌苗和野生型烟草无菌苗的茎段，在MS培养基中 进行生根，生长20天后统计不定根的数量和长度。A和B，转基因烟草(TOD2) 和野生型烟草茎段上不定根的生长情况；C，不定根的平均长度；D，每个茎 段上不定根的平均数量
图10:转基因烟草和野生型烟草的株高和叶片比较
A，本明烟草植株进入成熟期后，转基因烟草和野生型烟草的植株形态和 株高。TOD,超量表达G/lD五"基因的转基因烟草；WT，野生型烟草。B， 转基因烟草和野生型烟草的同位成熟叶片。TOD，超量表达( M)五72基因的 转基因烟草的叶片；WT，野生型烟草的叶片。
图ll:转基因烟草和野生型烟草的花、果实和种子 A，转基因烟草和野生型烟草花和果实发育过程的外观形态。WT，野生型烟 草；TOD:超量表达WZ^r2的转基因烟草。B，转基因烟草和野生型烟草的 果实发育(剥离了花器官的其余部分)。WT，野生型烟草；TOD，超量表达 G/lD￡72的转基因烟草。C，转基因烟草和野生型烟草的种子大小，标尺长lcm。 WT，野生型烟草；TOD，超量表达G力Z^72的转基因烟草。D，转基因本明 烟草和野生型本明烟草种子的千粒重。WT，野生型本明烟草种子；TOD1 TOD19，超量表达G/ld五r2基因的转基因株系1 19。 E，相对于野生型本明 烟草种子的重量，转基因本明烟草种子重量的增加比率。WT，野生型本明烟 草种子；TODl TOD19，超量表达G/ld五"基因的转基因株系1 19，种子 重量单位为克。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发 明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属 于本发明所附权利要求所定义的范围。
本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做 具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell, 2001)。
在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为徐州142 (Gossypium hirsutum cv Xuzhoul42 )，所用的烟草实验材料为本明烟(Nicotiana benthamiana)实施例一G/^五72基因序列的克隆
1. 棉花RNA的提取
选取约3 g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心 管，加入15mL65。C预热的RNA提取液(2。/。CTAB (W/V)， 2% PVP (W/V)， 100醒ol/LTris-HCl (pH8.0)， 0.5g/L Spermidine, 2，0mol/L NaCl， 2%巯基乙 醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65'C水浴3 10min，期间混匀2~3次。 氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次(10,000 r/min，室温，5 min)。取上清，加入 1/4体积10mol/LLiCl溶液，《C放置6h，以氯仿:异戊醇(25:24:1)各抽提1 次(10,000 r/min，室温，5 min)。加2倍体积的无水乙醇，在-70。C冰箱沉淀 30min以上。12,000 r/min， 4。C离心20min，弃上清。沉淀用200 |uL的DEPC 处理水溶解。酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)各抽 提1次(10,000 r/min，室温，5 min)。力B 1/10体积3 mol/L NaAc溶液和2.5 倍体积的无水乙醇，在-7(TC冰箱沉淀30min以上。12,000 r/min， 4"C离心20 min，弃上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，风干。加200 的DEPC处理 水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。
2. cDNA合成和G/lD￡77基因cDNA序列的PCR扩增
根据EST整合序列分析，在推测的起始密码子上游序列设计引物D6P1 (SEQIDN0.3)，用3'-RACE的方法扩增棉花类固醇5a-还原酶基因的cDNA 序列。操作步骤按3'-RACE试剂盒(TaKaRa)说明书进行。具体方法如下
(1) cDNA—链合成
取约lO(ig总RNA到DEPC-处理的扩增管中，65。C水浴10min使RNA变 性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入2pL 10xRNAreaction buffer, 4 25醒ol/L MgC12， 2|iL 10匪ol/L dNTPs， 5 U AMV RTase， 0.5 |tiL RNase inhibitor (20U)禾卩l^L 2.5|Limol/L Oligo-dT 3' site adaptor,加入DEPC处理的水 至终体积20pL。反转录反应的保温程序为30°C， lOmin; 50°C， 45min; 95°C， 5min; 5°C， 5min。程序结束后， 一链产物于-20'C冻存。
(2) 扩增
25 |iL的cDNA扩增体系含2.5 lOxEx PCR buffer (Mg2+ free), 2|uL 2.5 mmol/LdNTPs, 2jil 25mmol/L MgCl2， lpL特异引物D6P1 (5jdmol/L)， lpL 3'-site引物(5pmol/L)， 0.2jiL Ex Taq DNA聚合酶，l|uL cDNA—链产物。扩增程序为94°C， 5min; 94。C， 30sec， 56。C， 30sec， 72°C， lmin， 30个循 环；72。C延伸10min。
3.cDNA片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a。
(1) 电泳
将cDNA扩增产物在1.2% (W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
(2) 回收
使用回收试剂盒回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝 胶上电泳定量。
(3) 克隆和测序
回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克 隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证， 将回收片段克隆到pUCm-T (上海Sangon)载体上。序列测定由上海博亚公 司完成。
回收的片段与pUCm-T (上海生工)载体建立如下连接体系 10xT4 DNA连接缓冲液 1 pL
载体DNA片段 1 外源连接产物DNA片段 1
T4 DNA连接酶_1 nL
用双蒸水补足体积至10 pL的连接体系
载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3， 16'C连接12h。 之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。实施例二pBI121-35S-NOS双元质粒载体的构建
pBI121双元质粒是一种商品化的植物表达载体，本实验室购买保存。在 T-DNA区域的左右边界内有一套Nos启动子控制NPTII基因的植物表达元件 和一套CaMV 35S启动子控制GUS基因的植物表达元件。为了表达目标基因， 我们在该质粒载体中添加了一套由CaMV 35S启动子控制目标基因的植物表 达元件。该植物表达载体可实现Kan (卡拉霉素抗性)和GUS活性的双标记 筛选。在多克隆位点(Multiple cloning site， MCS)插入外源基因，可以实现 外源基因的超量表达(图2)。
首先，为了获得CaMV 35S启动子片段，依据pBI121双元质粒上的CaMV35S启动子序列设计带有5amHI和Smal酶切位点的引物p6-l和p6-2 (p6-l 的序列见SEQ ID N0.5， p6-2的序列见SEQ ID N0.6)，以pBI121双元质粒 DNA为模板进行扩增，用^wzHI和Swal双酶切扩增产物和pBI121质粒，通 过回收、连接、转化和验证获得插入CaMV35S启动子片段的中间载体。然后 根据pBI121双元质粒上Nos终止子的序列设计扩增引物获得Nos终止子片段 (引物p6-3序列见SEQIDN0.7，引物p6-4序列见SEQ ID N0.8)，该片段的 一端带有XbaI、 BamHI和KpnI酶切位点，另一端带有BglII酶切位点。通过 回收、连接、转化和验证获得了含有CaMV35S启动子的pBI121-35S-NOS植 物表达载体的骨架(图2)。
实施例三超量表达载体的构建和烟草遗传转化
1. 超量表达载体的构建
pUC-G力Z^T2载体是在克隆G/lD￡77基因时构建，其上的G/ Z)五T7片段 已测序。pBluescript-SK为商业化载体，由本实验室购买保存，本实验中用于 目的片段转换方向或借用新的酶切位点。植物表达载体的骨架 pBI121-35S-NOS按照实施例二方法为本实验室构建保存。
为了在转基因植物中超量表达基因，需要将G/^￡72基因正向 插入植物表达载体中，并用适当的启动子启动表达。为此我们根据 pUC-GAZ)￡72载体上的酶切位点和G/^￡72的插入方向以及植物表达载体 (pBI121-35S-NOS)上的多克隆位点和CaMV 35S启动子的方向，设计了如 图3所示的载体构建路线。根据这个植物表达载体构建路线，构建了超量表达 (^D五T2基因的植物表达载体pBI121-35S-G/lD五:T2-NOS，载体结构如图4。
2. 烟草遗传转化
(1 )用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404和烟草遗 传转化。
参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入 农杆菌LBA4404。
上述的植物表达载体通过农杆菌介导叶盘感染的方法导入烟草。具体方法 如下
烟草种子用1%的次氯酸钠消毒后，在MSB固体培养基上萌发，培养条 件为25°C、 16hr光照/8hr黑暗的光周期。约一个月后生长健壮的无菌苗即可用作转化外植体。
采用农杆菌介导的叶盘转化法含植物表达载体的农杆菌菌株接种于液体
YEB， 28°C 200rpm摇床培养过夜，从己摇好的菌液中重新吸取l~2ml于 20 25ml液体YEB中再次活化。待菌液摇至OD600约为0.8时，取出用YEB 稀释到0.05 0.2备用。
将无菌苗健壮叶片，切成约0.5cmx0.5cm大小叶盘，放入OD600值为 0.05~0.2的农杆菌菌液中，轻轻振荡侵染5min后，立刻倾去菌液，将外植体 接入表面铺有一层滤纸的共培养基上，24。C暗培养3d。
共培养完成后，外植体接入筛选培养基中进行分化培养，每2 3w继代一 次。出现再生绿芽后，将其切下转入生根培养基中生根。
当抗性苗的根生长到2 3cm长时，洗净根部的琼脂，水培炼苗2 3d，移 栽到营养钵，于自然条件下生长。
表l:根癌农杆菌介导的烟草遗传转化用培养基
培养基名称成分
基本培养基MSB (MS无机+Bs有机+7g /L琼脂+30 g/L蔗糖，pH5.8)
预培养基MSB+2.0 mg/L2,4-D
共培养培养基MSB+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA
筛选培养基MSB+2,0 mg/L 6-BA+0,1 mg/L NAA +500 mg/L Cef+ 100 mg/L Kan
生根培养基MSB+300 mg/L Cef+150 mg/L Kan
MS: Murashige&Skoog， 1%2
B5: Gamborg， 1986
(2)转化植株的鉴定
组织化学鉴定转化植株在生根培养基上生根并长到2 3cm时，将幼苗 从培养瓶中取出洗净，转入三角瓶上水培炼苗2~3d。同时，取一小块叶片和 一小段根进行GUS染色。GUS阳性的植株直接移栽到营养钵中。
PCR鉴定待烟草植株移栽成活并生长到一定大小，取0.5g叶片提取烟 草基因组DNA，以GhDET2的引物D6P1和D6P2 (SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4)进行扩增。25 |iL的扩增体系含2.5 |uL 10x PCR buffer, 2 |iL2.5mmol/L dNTPs， 1.5 nL 25薩ol/L MgC12，各1 jiL弓l物D6P1和D6P2 (5 pmol/L)， 1U Taq DNA聚合酶，1 (iL烟草基因组DNA(50ng)。扩增程序为94°C， 5 min; 94°C，30 sec， 56°C， 30 see, 72°C， 60 sec， 25个循环；72°C延伸10 min。用P6-GhDET2 载体质粒作阳性对照，以水和野生型烟草基因组DNA作阴性对照。实施例四检测GhDET2基因在转基因烟草中的表达水平
用半定量RT-PCR方法分析转基因植株中目的基因的表达。GM)五n基因 用引物D6P1和D6P2 (SEQIDN0.3和SEQIDN0.4)扩增，25 |uL的扩增体 系含2.5 pL 10x PCR buffer, 2 (iL 2.5腿ol/L dNTPs， 1.5 [iL 25腿ol/L MgC12， 各1 fiL引物D6P1和D6P2 (5 pmol/L)， 1U Taq DNA聚合酶，1 |uL cDNA —链 合成产物。扩增程序为94°C， 5 min; 94。C， 30sec， 56°C， 30sec， 72°C， 60 sec， 20~25个循环；72°C延伸10 min。用Ubiquitin基因做内标，引物为 Ubi-up禾卩Ubi-down 。
为了确定基因在转基因烟草中的表达情况，我们提取转基因烟 草和野生型烟草叶片的总RNA。以这些总RNA反转录的单链cDNA为模板进 行PCR扩增，烟草Ubiquitin特异引物Ubi-up和Ubi-down的扩增产物显示各 样品的总RNA量以及单链cDNA合成的质量和浓度相似。G/lC^T2的特异引 物D6P1和D6P2在转基因烟草中扩增出一条与预期大小一致的特异带，而野 生型烟草中没有任何扩增产物。为了排除总RNA中可能有基因组DNA的污 染，同时以总RNA为模板进行扩增，扩增产物中没有任何特异带(图5)，说 明G/lD五"基因已在检测的转基因烟草中表达，不同植株之间在表达量上有 一定差异。
实施例五转基因烟草与野生型烟草根系生长发育的比较 1.转基因烟草和野生型烟草T1代幼苗主根生长的比较 为研究基因对根系发育的影响，转基因烟草TO代种子经灭菌后 播种在垂直平板上，定时主根长度。具体的操作如下
(1) 烟草种子灭菌与漂洗 将转基因烟草To代种子和野生型烟草的种子在iy。的次氯酸钠水溶液中浸
泡8分钟，其间不停地摇晃以使种子表面与消毒液充分接触。然后倒掉消毒液， 加入适量的无菌水清洗4次，每次3-5分钟。
(2) 准备平板
配制琼脂浓度为0.8%的1/2MSB培养基，高温灭菌后在无菌条件下分装 在直径为12cm的培养皿中，每个培养皿盛50ml培养基。冷却凝固待用。(3) 播种和培养
在每个培养皿的背面中部用笔划一条直线，以使烟草种子排列整齐，最后
用封口膜(Parafilm)将培养皿封住以免培养基中的水分散失。播种后的培养 皿垂直放在固定的支架中，并使所划直线保持水平。所有培养皿都放在培养室 培养(28°C，光照条件)。
(4) 生长状态观测
播种后，每天观测种子萌发、根和下胚轴的生长。大约播种6天后，烟草 幼苗的根和下胚轴已经生长到一定长度，用直尺第一次测量根和下胚轴的长 度。同时在根尖和子叶着生部位的相应位置用记号笔做上记号，然后每隔24 小时测量根和下胚轴的伸长长度。最后统计分析转GAD五72基因的烟草和野 生型烟草幼苗在相同条件下，主根和下胚轴的长度差异和生长速率差异。实施例六转基因烟草种子萌发和沙培实验
用垂直平板法萌发烟草种子虽然有利于直接观测根的生长过程，但由于垂 直平板空间和培养基营养的限制以及微生物污染的因素，无法对根的伸长情况 进行长时间的比较。为了在更长的时间检测转基因烟草根的生长长度，本实验 采用了沙培法。并在种子催芽阶段观测了转基因烟草种子的萌发情况。具体操 作步骤如下
(1) 种子催芽和萌发率检测 将适量的转基因烟草和野生型烟草种子用水浸泡催芽，转基因烟草种子浸
泡在含100 mg/L kanamycin的水中，野生型烟草的种子浸泡在不含kanamycin 的水中，在植物组培室摇床上以100rpm的速度摇晃2d。在这过程中，用大口 吸管随机抽取一定数量的种子，统计种子萌发率。
(2) 准备沙培基质
用自来水清洗干净沙中的泥浆，然后在底部有孔的培养钵中装入相同高度 的河沙， 一次试验的所有培养钵放在一个能盛水的浅盘中。并加水让钵中的河 沙湿透。
(3) 播种和培养
将露白的烟草种子播在每一钵的河沙表面。在温室中培养，其间每隔5天 加水一次，水不能直接浇在培养钵中的河沙上，只能加在底盘中。
(4) 取根和测量烟草幼苗培养30d后，将培养钵放在大体积水中，轻摇钵体，让河沙软化
松散，然后将烟草幼苗完整取出。每个转基因株系和野生型烟草选取有代表性
的10株幼苗测量其根长和下胚轴长度(图6-图8)。实施例七Tl代转基因烟草不定根生长变异分析
为了检测转化基因对转基因烟草不定根生长的影响，用消毒后的TO代种 子在筛选培养基上培养无菌苗，切取无菌苗茎段进行生根实验，观测不定根的 生长变异情况。具体的操作如下
(1) 转基因烟草种子灭菌和清洗
将^G/lD五"基因的烟草TO代种子和野生型烟草的种子在1% (V/V)的 次氯酸钠水溶液中浸泡8min，其间不停地摇晃以使种子表面与消毒液充分接 触。然后倒掉消毒液，加入适量的无菌水清洗4次，每次3 5min。
(2) 播种
将灭菌的转基因烟草种子均匀地放在含50mg/L kanamycin的1/2 MSB培 养基上，野生型烟草的种子播在不含kanamydn的1/2MSB培养基上。然后放 置在培养室中，使种子发芽。
(3) 切取烟草幼苗茎段生根 切取生长30d天的无菌烟草幼苗茎段，插在1/2MS培养基上，观察不定
根的发生和生长情况。待野生型烟草茎段的不定根生长到一定程度时，将苗取 出，统计转基因烟草茎段和野生型烟草茎段上不定根的数量，并测量长度大于 5mm的不定根长度(图9)。
实施例八转基因烟草与野生型烟草株高和叶片的比较
超量表达G/lD五"基因的转基因烟草和野生型烟草同时种植在培养钵中， 经过正常的栽培管理，植株进入成熟期后，观测转基因烟草和野生型烟草的生 长状况(图10)。
实施例九转基因烟草与野生型烟草果实和种子发育的比较
超量表达(^2)￡77基因能够促进转基因烟草的营养生长。为了弄清 G7^五T2对烟草生殖器官发育的影响，我们观测了超量表达基因的转 基因烟草的花器官形态、果实和种子大小(图ll)。
15SEQUENCE LISTING
<110> 西南大学
〈120〉棉花类固醇5 a -还原酶基因的用途及含有其的表达载体
<130> 09P103582
<160〉 10
<170〉 Patentln version 3.5
<210> 1
<211〉 899
<212> 隱
<213> Gossypium hirsutum
<220>
<221> misc—feature
<222> 0) —(899)
<223>棉誌^固醇5ci-还原酶基因的核苷酸序列
〈400〉 1
tccgatcagaccctttttcactactgcctcctcactctttacat朋ttgc60
tttaccMcatggatcagcctttacttcctccaagccccttatggcaagcgicaaccgccc120
tggttggggtcctaccatctctccacctttggcttggttcctcatggaaagtcccaccct180
ctggctcactttcttcctctttccctccggccaacatttctacaaccctaaatcattcct240
tctcatctcgccctttctctttcactacttcaaccgcactgtcctttaccctcttcggct300
cgccaggaac3cc3cccaaaccaggggttttccagtgagtgtagcttttatggcgttcgg360
gtttaatcttttgaacggttatttgcaagccaggtgggtgtcgcactataaggsctacta420
tgaaaatgaggagctgttttggtggaggtttcttgctggattgctaatttUgtagttgg480tatgtgggtg犯tgttsgggctgataaagtgttggtgggactgaagaaacaaggtgatgg540
tggatataagatcccaagaggagggctgUtgsgttggtgagttgccccaactattttgg600
ggagattatggagtggtttgggtgggcggtgatg織tggtcttgggtgggttttggctt660
ctttctctacacttgtgccaacttgatgcctagagctcgtgccacccgcctttggtattt720
ggagaagttcaaggacgattgtgatcccattcatatattg780
3dg3tttgatatttgtgtttascccacat3tgattgattcggtgatcaagttgtatcttt840
ttaatggtttaaatcagatttcttttctgt899
<210〉 2
<211〉 258
<212> PRT
<213〉 人工序列
<220〉
〈221〉 MISC_FEATURE <222> (1).. (258)
<223>棉花类固醇5a-还原酶基因GhDET2编码的蛋白质序列 <400> 2
Met Ala Ser Asp Gin Thr Leu Phe His Tyr Cys Leu Leu Thr Leu Tyr 15 10 15
lie lie Ala Leu Pro Thr Trp lie Ser Leu Tyr Phe Leu Gin Ala Pro 20 25 30Tyr Gly Lys His Asn Arg Pro Gly Trp Gly Pro Thr lie Ser Pro Pro
35 40
45
Leu Ala Trp Phe Leu Met Glu Ser Pro Thr Leu Trp Leu Thr Phe Phe
50 55
60
Leu Phe Pro Ser Gly Gin His Phe Tyr Asn Pro Lys Ser Phe Leu Leu
65 70
75
80
lie Ser Pro Phe Leu Phe His Tyr Phe Asn Arg Thr Val Leu Tyr Pro 85 90 95
Leu Arg Leu Ala Arg Asn Thr Thr Gin Thr Arg Gly Phe Pro Val Ser 100 105 110
Val Ala Phe Met Ala Phe Gly Phe Asn Leu Leu Asn Gly Tyr Leu Gin
115 120
125
Ala Arg Trp Val Ser His Tyr Lys Asp Tyr Tyr Glu Asn Glu Glu Leu
130 135
140
Phe Trp Trp Arg Phe Leu Ala Gly Leu Leu lie Phe Val Val Gly Met
145 150
155
L60
Trp Val Asn Val Arg Ala Asp Lys Val Leu Val Gly Leu Lys Lys Gin 165 170 175
Glv Asp Gly Gly Tyr Lys lie Pro Arg Gly Gly Leu Phe Glu Leu Val 180 185 190
Ser Cys Pro Asn Tyr Phe Gly Glu lie Met Glu Trp Phe Gly Trp Ala
195 200
205
Val Met Thr Trp Ser Trp Val Gly Phe Gly Phe Phe Leu Tyr Thr Cys
210 215
220
Ala Asn Leu Met Pro Arg Ala Arg Ala Thr Arg Leu Trp Tyi' Leu Glu
225 230
235
240
Lys Phe Lys Asp Asp Tyr Pro Lys Asp Arg Lys Ala Val lie Pro Phe ' 245 250 ' 255
lie Tyr
<210〉 3
<211> 21
<212> ■ 〈213〉人工序列
<220〉
〈221> misc—feature <222〉 (1)..(21)
<223〉扩增GhDET2基因的特异引物D6Pl <400> 3
gaaaatggcc tccgatcaga c
21<210〉 4
<211> 20
<212> DNA
〈213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature <222> (l)..咖
〈223>扩增GhDET2基因的特异引物D6P2 <400〉 4
caccgaatca atcatattgg 20
<210> 5
<211> 27
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221> misc—feature <222> (1)..(27)
〈223〉扩增CaMV 35S启动子的特异引物p6-l (带有BamHI酶切位点) <400> 5
ggatccgatt acgccaagct tgcatgc 27
〈210〉 6
<211〉 27
<212〉 DNA
〈213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc.—feature <222〉 (1).. (27)
〈223〉扩增CaMV 35S启动子的特异引物p6-2 (带有SmaI酶切位点) <400〉 6
cccgggtcaa actctagagt cccccgt 27
<210〉 <211〉 〈212〉 <213>
<220> <221> 〈222〉 <223〉
<400〉
39 陽
人工序列
misc—feature (l).r(39)
扩增Nos终止子的特异引物p6-3 (带有XbaI、 BamHI和KpnI酶切位点) 7
tctagaggat ccggtaccga cgagttcttc tgagatcgt 39
〈210〉 8
<211> 27
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<221〉 misc_feature <222〉 (1)..(27)
〈223〉扩增Nos终止子的特异引物p6-3 (带有BglII酶切位点) <400> 8
agatctcccg atctagtaac atagatg 27<formula>formula see original document page 19</formula>
权利要求
1、棉花类固醇5α-还原酶基因GhDET2在促进植物根系发育中的应用，其中所述棉花类固醇5α-还原酶基因GhDET2具有下述核苷酸序列1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或2)与SEQ ID NO.1的核苷酸序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2、权利要求1所述的应用，其中所述棉花类固醇5a-还原酶基因G/lD￡72 具有与SEQ ID NO. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
3、棉花类固醇5(x-还原酶基因G/LD五72在农作物育种或林木育种中的应用， 其中所述棉花类固醇5a-还原酶基因G/lD￡72具有下述核苷酸序列1) 如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或2) 与SEQ ID NO. 1的核苷酸序列具有80%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
4、权利要求3所述的应用，其中所述棉花类固醇5a-还原酶基因G/lD五" 具有与SEQ ID NO. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的核苷酸序列。
5、 含有棉花类固醇5a-还原酶基因G/LD5"和组成型或组织特异性启动子 的植物表达载体。
6、 根据权利要求5所述的植物表达载体，其具有如图l所示的结构。
7、 根据权利要求5所述的植物表达载体，其具有如图4所示的结构。
8、 一种转化体，以权利要求5所述的植物表达载体转化宿主获得。
9、 一种含有棉花类固醇5a-还原酶基因G/lD五72的转基因植物的制备方法，包含下述步骤1) 将基因GAZ^"与组成型或组织特异性启动子可操作地连接；2) 构建含有基因与组成型启动子或组织特异性启动子的植物 表达载体；3) 用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；4) 用所述转化体转化植物，获得转基因植物。
全文摘要
本发明涉及棉花类固醇5α-还原酶基因GhDET2在促进植物根系发育中的用途。通过在植物中的表达GhDET2基因，促进了转基因植物胚根的伸长，侧根的发生和伸长，以及根毛的生长；促进转基因植物茎段不定根的生长；同时也促进转基因植物的营养生长，提高了转基因植物的产量和种子大小。可用于农作物育种和林木育种，增加转基因植物的营养生长，提高植物的生物产量和种子产量。本发明还提供包含基因GhDET2的植物表达载体以及制备含有该基因的转基因植物的方法。
文档编号A01H5/00GK101503703SQ20091010583
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者磊 侯, 明 罗, 肖月华, 胡明瑜, 炎 裴 申请人:西南大学