专利名称：一种防治铁皮石斛疫病发酵液的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，尤其涉及到一种防治铁皮石斛疫病发酵液的制备方法。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是传统的中药材，也作为保 健品的原料，有巨大的市场需求和重要的经济价值。目前野生资源已濒临枯竭，人工栽培铁 皮石斛已越来越受到重视。然而，在人工栽培条件下铁皮石斛经常受到石斛疫病的危害。
铁皮石斛疫病是由疫霉菌引起的，经鉴定为烟草疫霉菌 Phytophthoranicotianae。在不同苗龄上发生，病原菌引起根腐、茎基部腐和顶枯等症状。 铁皮石斛疫病是一种毁灭性的病害，石斛栽培田间一旦发生，常造成严重的经济损失，然 而，在自然条件下绝没有观察到石斛疫病的发生。 一般发生在8月上旬，危害一直持续到9 月底或10月中旬。疫病主要为害当年移植的石斛苗，引起死亡。 植物病害拮抗细菌的筛选和应用是植物病害防治的研究热点。拮抗细菌及其代谢 产物的开发利用，以及筛选培养新型、高效、稳定、适生性强的拮抗细菌是今后生防菌发展 的趋势。因此，对防治铁皮石斛疫病的发酵液及其制备方法，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治铁皮石斛疫病的发酵液。 本发明提供的一种防治铁皮石斛疫病的复合发酵液，其制备方法包括以下步骤
1)取大田铁皮石斛基质，加入锥形瓶中，振荡，静置，将基质溶液依次稀释到。
2)分别取稀释液，滴加在牛肉膏蛋白胨平板上，用涂布棒涂匀。将制好的平板放置 恒温培养箱中，培养。 3)将上述2)培养好的板上挑取单菌落，分别传试管斜面，并进一步进行摇瓶培 养，得发酵液待用。 4)取长势良好的铁皮石斛疫病病原菌试管斜面一支，向试管斜面中加入无菌水， 刮铁皮石斛疫病菌的孢子，吸取孢子悬液加入无菌水中，振荡，使之成为分散均匀的孢子悬 液。吸取均匀的铁皮石斛病原菌孢子悬液于无菌平皿中，再倒入培养基，制成铁皮石斛疫病 菌混菌平板。 5)在铁皮石斛疫病菌制成的混菌平板上分别贴上无菌的滤纸片，每个平板贴5 个，在5个滤纸片上分别滴加步骤3)中的细菌单菌落制成的发酵液，培养后，根据形成抑菌 圈的情况挑选拮抗菌菌株。 6)将所选出发菌，进行单一菌发酵液的制备，考察对铁皮石斛疫病病菌拮抗效果。
7)对单一菌株发酵液及不同浓度酵液进行两两复合的发酵制备，得出拮抗菌Be和 B8复合发酵液拮抗能力最强。 8)分别将B6菌和B8菌接种到三角瓶液体培养基中，在3-35°C、 pH为7. 0-8. 0下 培养24-48小时，得到种子液；分别将菌种B6和B8经活化培养后，分别接种在培养液，保持在一定温度下进行静置培养；分别将拮抗菌B6和B8培养液经离心、过滤除菌(瓶顶过滤装 置)，冷冻干燥后配成溶液。将所得Be和Bs的发酵液按比例进行混合即得复合发酵液。将 所制备的发酵液在低温下进行冷藏保存。 优选地，所述步骤8)B6菌和B8菌的三角瓶液体培养基配方为牛肉膏蛋白胨 4-6g，蛋白胨8-12g， NaC14-6g，用水定容至1000mL。 优选地，所述步骤8)菌种Be培养的最佳条件为最优温度为27-3rC，最适碱度为 ra = 7. 1-7. 6，培养时间为48h。其中B8的培养条件为最优温度为26-32t:，最适碱度为 PH = 7. 3-7. 8，最佳培养时间为48h。 优选地，所述步骤8)菌种B6和B8经活化培养后，分别接种在牛肉膏蛋白胨培养 液，接种量为每100mL放入菌饼(小=7mm)3片，于25。C静置培养8d。
优选地，所述步骤8)拮抗菌培养液经离心的条件为温度为4t:，转速15000r/ min，离心时间为15min、冷冻干燥后配成7mg/mL-8mg/mL的溶液。 优选地，所述步骤8)中Be和Bs最优复合发酵液的混合比例为(0.8-1) : l时的
抑菌能力最强。
优选地，所述步骤8)保存是指在温度为l-4t:下进行冷藏保存。 本发明主要采用以菌治菌的防治方法，即活体微生物农药防治法，利用种植铁皮 石斛的土壤作为原材料，从中筛选出代谢产物对铁皮石斛疫病具有较强抑制作用的菌株， 然后进行发酵液的制备。 本发明为提供了一种防治铁皮石斛疫病的复合发酵液，为开发铁皮石斛疫病微生 物农药的制备，提供了一条思路。本发明在铁皮石斛疫病防治领域具有广阔的利用前景。
具体实施例方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合实施方式对本发明所
述的防治铁皮石斛疫病发酵液的制备方法作进一步的详细说明。 防治铁皮石斛疫病的菌种的筛选方法，具体包括以下步骤 1)取大田铁皮石斛基质，加入锥形瓶中，振荡，静置，将基质溶液依次稀释到。 2)分别取稀释液，滴加在牛肉膏蛋白胨平板上，用涂布棒涂匀。将制好的平板放置
恒温培养箱中，培养。 3)将上述2)培养好的板上挑取单菌落，分别传试管斜面，并进一步进行摇瓶培 养，得发酵液待用。 4)取长势良好的铁皮石斛疫病病原菌试管斜面一支，向试管斜面中加入无菌水， 刮铁皮石斛疫病菌的孢子，吸取孢子悬液加入无菌水中，振荡，使之成为分散均匀的孢子悬 液。吸取均匀的铁皮石斛病原菌孢子悬液于无菌平皿中，再倒入培养基，制成铁皮石斛疫病 菌混菌平板。 5)在铁皮石斛疫病菌制成的混菌平板上分别贴上无菌的滤纸片，每个平板贴5 个，在5个滤纸片上分别滴加步骤3)中的细菌单菌落制成的发酵液，培养后，根据形成抑菌 圈的情况挑选拮抗菌菌株。 6)将所选出发菌，进行单一菌发酵液的制备，考察对铁皮石斛疫病病菌拮抗效果， 并分别对不同浓度发酵液进行分析。
7)对单一菌株发酵液及不同浓度酵液进行两两复合的发酵制备，考察出更优的拮 抗菌复合发酵液。 所述步骤1)中基质溶液稀释到105倍和106倍溶液。 所述步骤2)中恒温培养箱的培养温度为36°C ，培养时间为48h。 所述步骤3)发酵液是指将筛选出菌种经活化培养后，接种在培养基，静置培养，
拮抗菌培养液经离心、过滤除菌，冷冻干燥后配成10mg/mL的溶液。 所述步骤4)吸取孢子悬浮液约为lmL，加入无菌水量为29mL。 所述步骤5)倒入的培养基为PDA培养基。选出15种具有拮抗效果菌株BrB15。 所述步骤6)考察对铁皮石斛疫病病原菌的拮抗效果，采用的是抑菌圈的方法，以
抑菌圈直径的大小来衡量拮抗作用。 所述步骤7)最优的复合发酵液为B6和B8两种发酵液体的复合发酵液。其发酵浓
度分别为7mg/mL-8mg/mL，混合比例体积比为(0.8-1) : 1 防治铁皮石斛疫病的发酵液的制备方法，具体包括以下步骤 1)分别将筛选出来的B6菌和B8菌接种到三角瓶液体培养基中，在3-35°C、 pH为
7. 0-8. 0下培养24-48小时，得到种子液; 2)分别将菌种B6和B8经活化培养后，分别接种在培养液，保持在一定温度下进行 静置培养。 3)分别将拮抗菌B6和B8培养液经离心、过滤除菌(瓶顶过滤装置)，冷冻干燥后 配成溶液。 4)将步骤3)中所得B6和B8的发酵液进行复合按一定比例进行复核，进行抑菌测 定。 5)将优选出的拮抗最强的复合发酵液进行保存。 所述步骤1)菌种B6培养的最佳条件为最优温度为27-3rC，最适碱度为ffl = 7. 1-7. 6，培养时间为48h。其中B8的培养条件为最优温度为26-32t:，最适碱度为PH = 7.3-7.8，最佳培养时间为48h。所述Be菌和Bs菌的三角瓶液体培养基配方为牛肉膏蛋白 胨4-6g，蛋白胨8-12g， NaC14-6g，用水定容至1000mL。 所述步骤2)菌种B6和B8经活化培养后，分别接种在牛肉膏蛋白胨培养液，接种量 为每100mL放入菌饼(小=7mm)3片，于25。C静置培养8d。 所述步骤3)拮抗菌培养液经离心的条件为温度为4°C ，转速15000r/min，离心时 间为15min、冷冻干燥后配成7. 5mg/mL的溶液。 所述步骤4)中B6和B8最优复合发酵液的混合比例为(0. 8-1) : 1时的抑菌能力最强。 所述步骤5)保存是指在温度为fC下进行冷藏保存。
权利要求
本发明所提供的一种防治铁皮石斛疫病的发酵液及其制备方法，其特征在于筛选出的B6和B8两种菌的复合发酵液，其混合比例为(0.8-1)∶1，发酵液的浓度为7mg/mL-8mg/mL。其中B6的培养条件为最优温度为27-31℃，最适碱度为pH＝7.1-7.6。其中B8的培养条件为最优温度为26-32℃，最适碱度为pH＝7.3-7.8。
2. —种防治铁皮石斛疫病的发酵液及其制备方法，其特征在于包括以下步骤1) 取大田铁皮石斛基质，加入锥形瓶中，振荡，静置，将基质溶液依次稀释到。2) 分别取稀释液，滴加在牛肉膏蛋白胨平板上，用涂布棒涂匀。将制好的平板放置恒温 培养箱中，培养。3) 将上述2)培养好的板上挑取单菌落，分别传试管斜面，并进一步进行摇瓶培养，得 发酵液待用。4) 取长势良好的铁皮石斛疫病病原菌试管斜面一支，向试管斜面中加入无菌水，刮铁 皮石斛疫病菌的孢子，吸取孢子悬液加入无菌水中，振荡，使之成为分散均匀的孢子悬液。 吸取均匀的铁皮石斛病原菌孢子悬液于无菌平皿中，再倒入培养基，制成铁皮石斛疫病菌 混菌平板。5) 在铁皮石斛疫病菌制成的混菌平板上分别贴上无菌的滤纸片，每个平板贴5个，在5 个滤纸片上分别滴加步骤3)中的细菌单菌落制成的发酵液，培养后，根据形成抑菌圈的情 况挑选拮抗菌菌株。6) 将所选出发菌，进行单一菌发酵液的制备，考察对铁皮石斛疫病病菌拮抗效果。7) 对单一菌株发酵液及不同浓度酵液进行两两复合的发酵制备，得出拮抗菌Be和B8复 合发酵液拮抗能力最强。8) 分别将B6菌和B8菌接种到三角瓶液体培养基中，在3-35°C、 pH为7. 0-8. 0下培养 24-48小时，得到种子液；分别将菌种B6和B8经活化培养后，分别接种在培养液，保持在一 定温度下进行静置培养；分别将拮抗菌B6和B8培养液经离心、过滤除菌(瓶顶过滤装置)， 冷冻干燥后配成溶液。将所得Be和Bs的发酵液按比例进行混合即得复合发酵液。将所制 备的发酵液在低温下进行冷藏保存。
3. 如权利要求2 —种铁皮石斛疫病拮抗菌复合发酵液的制备方法，其特征在于，所述 步骤8)中86菌和88菌的三角瓶液体培养基配方为牛肉膏蛋白胨4-6g，蛋白胨8-12g，NaCl 4-6g，用水定容至1000mL。
4. 如权利要求2 —种铁皮石斛疫病拮抗菌复合发酵液的制备方法，其特征在于，所述 步骤8)菌种B6培养的最佳条件为最优温度为27-3rC，最适碱度为ra = 7. 17. 6，培养时 间为48h。其中B8的培养条件为最优温度为26-32t:，最适碱度为ffl = 7. 37. 8，最佳培养 时间为48h。
5. 如权利要求2 —种铁皮石斛疫病拮抗菌复合发酵液的制备方法，其特征在于，所述 步骤8)菌种B6和B8经活化培养后，分别接种在牛肉膏蛋白胨培养液，接种量为每100mL放 入菌饼(小=7mm)3片，于25。C静置培养8d。
6. 如权利要求2 —种铁皮石斛疫病拮抗菌复合发酵液的制备方法，其特征在于，所述 步骤8)拮抗菌培养液经离心的条件为温度为4t:，转速15000r/min，离心时间为15min、 冷冻干燥后配成7mg/mL-8mg/mL的溶液。
7. 如权利要求2 —种铁皮石斛疫病拮抗菌复合发酵液的制备方法，其特征在于，所述步骤8)中86和88最优复合发酵液的混合比例为(0.8-1) : l时的抑菌能力最强。
8.如权利要求2 —种防治铁皮石斛疫病的发酵液及其制备方法，其特征在于，所述步 骤8)保存是指在温度为l-4。C下进行冷藏保存。
全文摘要
本发明所提供的铁皮石斛疫病拮抗菌复合发酵液，其特征在于筛选出的B6和B8两种菌的复合发酵液，其混合比例为(0.8-1)∶1，发酵液的浓度为7mg/mL-8mg/mL。其中B6的培养条件为生长温度范围为3-35℃，最优温度为27-31℃，碱度范围为pH＝5-8.5，最适碱度为pH＝7.1-7.6。其中B8的培养条件为生长温度范围为4-38℃，最优温度为26-32℃，碱度范围为pH＝5-8.5，最适碱度为pH＝7.3-7.8，本发明提供了一种对铁皮石斛疫病病菌具有拮抗作用的菌种复合发酵液的制备方法，为开发铁皮石斛疫病微生物农药的制备，提供了一条思路。本发明在铁皮石斛疫病防治领域具有广阔的利用前景。
文档编号A01P3/00GK101715789SQ200910155280
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者俞巧仙, 叶智根, 周术涛, 雷志力 申请人:浙江森宇实业有限公司