专利名称：一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法及用途，属于微生物发 酵饲料和液体饲料领域。
背景技术：
发酵液体饲料(Fermented Liquid Feed,简写FLF)，作为一种新型饲料，它的最早 使用是在20世纪80年代末的荷兰，之后，丹麦、法国、瑞典、西班牙、瑞士等国也陆续加入到 了使用者的行列，近几年来，发酵液体饲料在欧洲已广泛使用，并成为人们研究的热点。可 改善饲料的消化特性，提高猪的生产性能，尤其是在预防断奶仔猪腹泻、提高采食量和日增 重方面已取得了显著的效果。但还有一些关键技术问题尚需解决发酵液体饲料的适宜菌 种开发、发酵液体饲料的发酵工艺，特别是菌种的好坏将直接影响发酵液体饲料的饲喂效 果。比如，饲喂系统含大量杂菌，原料中含不适于发酵的菌或含量太低不足以抑制有害菌 等，这些问题都会引起发酵液体饲料的发酵不良。目前，关于发酵液体饲料的研究也只是集中在养猪生产中，更确切的说是对断奶 仔猪的研究，而对生长猪等却鲜有报道。由中国国家知识产权局公开的申请号为200610165284. 5，发明名称为“液态猪饲 料发酵工艺及设备”的发明专利申请，公开了由乳酸菌、粪链球菌，酵母菌与黑曲霉、芽孢杆 菌混合配比发酵液态饲料的工艺及设备，菌种繁多，培养工艺复杂，并且制备的液体发酵饲 料仅应用在断奶后仔猪上。针对上述存在的技术问题，本发明提出的解决方案是从健康成长猪肠道内容物 中分离筛选出乳酸菌，并经体外抑菌试验和动物饲喂效果实验选育适宜发酵液体饲料的优 良菌种，然后采用液体深层发酵工艺制备乳酸菌发酵液；优化罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料 的工艺参数；并且制备的发酵液体饲料不仅对断奶仔猪的生长性能效果显著，而且对生长 猪、育肥猪的生长性能效果也显著。因此本发明的罗伊氏乳杆菌是适宜液体发酵饲料的优 良菌种，能够有效抑制饲喂系统、饲料原料中含有的大量杂菌、有害菌的生长繁殖，保证发 酵液体饲料良好发酵，并且制备发酵液体饲料的工艺简单，易于操作，能够在粗放的猪场环 境中进行发酵，效果良好，对断奶仔猪、生长猪、育肥猪的生长性能效果显著。
发明内容
本发明的目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，包括用于罗伊氏乳杆菌 发酵的干基质，活菌含量为l-5X108cfu/g罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri (保藏编 号为CGMCC3457)及其乳酸等代谢产物，水分含量40-60 %，pH值为4. 5-5. 5。本发明所述的用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质为全价料的大料部分，不包括4% 的预混料，全价料为参照NRC(1998)猪的营养需要配制的常规基础日粮。本发明所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料还包括4%的预混料，为在罗伊氏 乳杆菌发酵上述干基质结束后添加，为市场上销售的不含有任何抗生素药物的4%预混料。
本发明的另一目的在于提供一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法。本发明的另一目的在于提供罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的用途。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，包括优良乳酸菌的选 育及其菌种鉴定，罗伊氏乳杆菌发酵液的制备，应用罗伊氏乳杆菌发酵液制备发酵液体饲 料的步骤及发酵工艺参数优化。1、本发明所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其中优良乳酸菌的 选育及其菌种鉴定，具体步骤如下(1)肠道内容物中优良乳酸菌菌种的分离筛选无菌操作取健康成年猪盲肠内容物，用无菌生理盐水作适当稀释。蘸取稀释液在 MRS平板培养基上划线接种，30-37°C厌氧培养24-48小时，挑取形态及颜色各异的菌落分 别划线接种作纯培养，并进行镜检，观察分离细菌的颜色及形态特征。挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽孢杆菌接种于MRS液体培养基，30-37°C厌 氧培养16-24小时。将细菌培养液按20-25%的比例添加灭菌甘油，混勻，-20°C保存、备用。 分别编号为 CL9、L3、ffffl、LB2、W0、S64。本发明所述的MRS平板培养基牛肉膏1. 0g、胰蛋白胨0. 5g、酵母浸出粉0. 5g、葡 萄糖1. 5g、乳糖0. 5g、5%半胱氨酸1. 0ml、吐温-800. 1ml、氯化镁0. 05g、柠檬酸铁铵0. 2g、 硫酸锰0. 005g、乙酸钠0. 5g、琼脂粉1. 4g、无水磷酸氢二钠0. 2g、IOOml蒸馏水，调pH值至 5. 4。本发明所述的MRS液体培养基为MRS平板培养基中不添加琼脂粉。(2)对常见致病菌抑菌效果优良的乳酸菌菌种的选育应用体外抑菌圈法筛选步骤(1)分离的乳酸菌。将乳酸菌菌株接种到MRS液体培 养基中，30-37°C厌氧培养16-24h后，通过测定OD5c 值调整活菌数为5X108cfu/ml。同时 将致病菌接种于营养肉汤中，37°C培养18h后，调整活菌数至lX106cfu/mL，将营养琼脂培 养基冷却到40°C左右时倾注到无菌培养皿中，待凝固后，吸取致病菌菌液0. Iml在平板表 面均勻涂开，37°C固定培养菌落30min，在平板上打直径4mm的孔，孔深3mm。将调整好浓度 的乳酸菌液注至满孔，于37°C微需氧环境培养48h观察结果，测定抑菌圈大小。实验结果如 下乳酸菌对常见致病菌的抑菌实验结果单位mm
菌种大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆歯
WWl 18231517
L3 200125LB2 810130
CL9 128010
WO_0_15_10_12
~S64 15251415结果表明乳酸菌ffffl、S64对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆 菌抑菌效果最好，对四株致病菌都有显著的抑菌效果。这为能够有效抑制饲喂系统、饲料原 料中含有的大量杂菌、有害菌的生长繁殖，保证发酵液体饲料良好发酵奠定了基础。本发明所述的营养琼脂培养基为牛肉膏l.Og，蛋白胨l.Og，葡萄糖l.Og，NaCl
权利要求
一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，其特征在于，包括用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质，罗伊氏乳杆菌活菌含量1 5×108cfu/g及其乳酸代谢产物，水分含量40 60％，pH值为4.5 5.5。
2.如权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，其特征在于，还包括4%的预 混料。
3.如权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，其特征在于，发酵的干基质 为全价料的大料部分，不包括4%的预混料，全价料为参照NRC(1998)猪的营养需要配制的常规基础日粮。
4.如权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，其特征在于，罗伊氏乳杆菌 Lactobacillus reuteri为本申请人于2009年11月20日向中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心提供保藏，保藏号为CGMCC3457的菌种。
5.如权利要求2、3所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，其特征在于，4%的预混料 在发酵结束后再添加，为市场上销售的不含任何抗生素药物的4%预混料。
6.一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于包括优良乳酸菌的选育 及其菌种鉴定，罗伊氏乳杆菌发酵液的制备，应用罗伊氏乳杆菌发酵液制备发酵液体饲料 的步骤和工艺参数优化。
7.如权利要求6所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其特征在于，优 良乳酸菌的选育及其菌种鉴定，具体步骤如下(1)肠道内容物中乳酸菌菌种的分离筛选无菌操作取成年猪盲肠内容物，用无菌生理盐水作适当稀释。蘸取稀释液在MRS平板 培养基上划线接种，30-37°C厌氧培养24-48小时，挑取形态及颜色各异的菌落分别划线接 种作纯培养，并进行镜检，观察分离细菌的颜色及形态特征。挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽孢杆菌接种于MRS液体培养基，30-37°C厌氧培 养16-24小时。将细菌培养液按20-25%的比例添加灭菌甘油，混勻，_20°C保存、备用。本发明所述的MRS平板培养基牛肉膏1. 0g、胰蛋白胨0. 5g、酵母浸出粉0. 5g、葡萄糖 1. 5g、乳糖0. 5g、5%半胱氨酸1. 0ml、吐温-80 0. lml、氯化镁0. 05g、柠檬酸铁铵0. 2g、硫酸 锰0. 005g、乙酸钠0. 5g、琼脂粉1. 4g、无水磷酸氢二钠0. 2g、IOOml蒸馏水，调pH值至5. 4。本发明所述的MRS液体培养基为MRS平板培养基中不添加琼脂粉。(2)对常见致病菌的抑菌效果优良的乳酸菌种的选育应用体外抑菌圈法筛选步骤(1)分离的乳酸菌。将乳酸菌菌株接种到MRS液体培养基 中，30-37 °C厌氧培养16-24h后，通过测定OD5c 值调整活菌数为5X108cfu/ml。同时将致 病菌接种于营养肉汤中，37°C培养18h后，调整活菌数至lX106cfu/mL，将营养琼脂培养基 冷却到40°C左右时倾注到无菌培养皿中，待凝固后，吸取致病菌菌液0. Iml在平板表面均 勻涂开，37°C固定培养菌落30min，在平板上打直径4mm的孔，孔深3mm。将调整好浓度的乳 酸菌液注至满孔，于37°C微需氧环境培养48h观察结果，测定抑菌圈大小，优选抑菌效果优 良的乳酸菌菌种。本发明所述的营养琼脂培养基为牛肉膏1. 0g，蛋白胨1. 0g，葡萄糖1. Og5NaCl 0. 5g， 琼脂 1. 5-2. 0g，蒸馏水 100ml, pH 7. O0本发明所述的营养肉汤培养基为牛肉膏1. 0g，蛋白胨1. 0g，葡萄糖1. Og5NaCl 0. 5g，蒸馏水 100ml，pH 7. O0(3)适宜发酵液体饲料的优良乳酸菌菌种的选育采用动物饲喂效果实验选育适宜发酵液体饲料的优良乳酸菌菌种，将步骤(2)初步选 育的乳酸菌按照常规方法制成液体发酵饲料，饲喂动物，对照组饲喂基础日粮，液体饲料对 照组为基础日粮+水，实验组饲喂乳酸菌液体发酵饲料，测定动物的生长性能日增重、料 肉比、腹泻率指标，优选对动物生长性能优良的乳酸菌菌种。(4)优良乳酸菌的菌种鉴定利用16S rDNA分子生物学法结合传统生理生化实验鉴定步骤(2)、(3)选育的优良乳 酸菌。
8.如权利要求6所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其中罗伊氏乳杆 菌发酵液的制备过程如下(1)罗伊氏乳杆菌种子液的制备将试管斜面保藏菌种接种至装有400mlMRS培养基的500ml三角瓶中，30-40°C恒温静 止厌氧培养10-24h。(2)罗伊氏乳杆菌发酵液的制备将步骤(1)制备的罗伊氏乳杆菌种子液按照5-10%接种量接种至装有40L发酵培养基 的50L发酵罐中，30-40°C恒温厌氧培养16-24h。本发明所述的发酵培养基为葡萄糖2g，酵母浸出粉0. 5g，牛肉蛋白粉lg，鱼肉汁lg， 吐温80 0. Olml,醋酸钠0. 5g，柠檬酸铁铵0. 2g，硫酸镁0. 058g,硫酸锰0. 0028,蒸馏水 100ml，调 pH 值至 5. 4-6. 5。
9.如权利要求6所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的制备方法，其中应用罗伊氏 乳杆菌发酵液制备发酵液体饲料的步骤及工艺参数如下(1)用于罗伊氏乳杆菌液体发酵的干基质的配制本发明所述的用于乳酸菌液体发酵 的干基质，是全价料的大料部分，不包括4%预混料，即先将全价料中4%预混料之外的大 料成分按照配比混勻制成用于发酵的干基质。(2)罗伊氏乳杆菌发酵液的稀释按照1%。_1%的接种量将罗伊氏乳杆菌发酵液接种 于一定量的地下水或自来水的容器中，搅拌均勻，待用。其中地下水或自来水的装液量为 50-70% ο(3)罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料的工艺参数将步骤(1)混合好的干基质与步骤(2) 稀释好的菌液混合均勻，水料比为1.2-1. 8 1，盖盖，密封，培养温度为15-35°C，厌氧培养 16-48h，pH值为4. 5-5. 5，终止发酵。(4)将步骤(3)制备好的液体发酵饲料中添加4%预混料配成全价料，搅拌均勻，即得 罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，立即饲喂。
10.如权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料，是一种新型无抗绿色饲料， 可用于直接饲喂断奶仔猪、生长猪、育肥猪。
全文摘要
本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料及其制备方法和用途，属于微生物发酵饲料和液体饲料领域。本发明的罗伊氏乳杆菌发酵液体饲料是经定向选育的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri(保藏编号为CGMCC No.3457)按照优化的发酵液体饲料工艺制成的液体发酵饲料，不仅包括用于罗伊氏乳杆菌发酵的干基质，罗伊氏乳杆菌活菌含量1-5×108cfu/g及其乳酸代谢产物，水分含量40-60％，pH值为4.5-5.5。还包括4％的预混料，为在发酵结束后再添加，4％的预混料不含任何抗生素。本发明的发酵液体饲料工艺简单，易于散养户操作，能够在粗放的猪场环境中进行良好发酵，制备的发酵液体饲料对断奶仔猪、生长猪、育肥猪的生长性能效果显著。不仅能够提高饲料利用率，促进动物生长，而且还能改善并维持肠道菌群平衡，提高免疫力和抗病力，改善动物体型与产品品质，显著降低饲料成本，增加经济效益。
文档编号A23K1/00GK101946850SQ20091024968
公开日2011年1月19日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者孙占敏, 张广民, 李红霞, 王旭莉, 王春阳, 王金全, 胡丽博, 蔡辉益, 陈鲜鑫 申请人:中国农业科学院饲料研究所