专利名称：一种华贵栉孔扇贝自交系的建立方法
技术领域：
本发明属于贝类育种技术领域，具体涉及一种华贵栉孔扇贝自交系的建立方法。
背景技术：
华贵栉孔扇贝[Chlamys(Minachlamys)nobilis (Reeve，1852)]为暖水性贝类，自然分布于日本的本州、四国、九州，中国的南海及印度尼西亚等地。在广东省沿海的海门、 遮浪、大亚湾、大鹏湾、间坡等地均有分布。华贵栉孔扇贝为雌雄异体型海洋双壳贝类，1年左右达性成熟，雌性性腺为橘黄色，雄性性腺为乳白色，繁殖期在广东沿海为5-10月，以 5-6月为繁殖盛期，可产卵300-1500万粒。广泛存在雌雄同体及性转换现象。周年内进行性转换的比例占总数的4. 47%，其中雄性进行转换的比例是5. 17%，雌性进行转换的比例是 4. 0%。雌、雄同体及性转换主要的发生时间在12-2月和7-8月。目前，理论上有两种方法进行生物体纯合体的构建培育，其中基因纯化速度最快的是通过雌核发育或雄核发育，但目前对贝类的雄核发育研究尚无报道，对贝类的雌核发育虽有一些研究，但在技术方面难度很大，目前尚不能在实际研究中进行应用。另外一种方法是近亲繁殖，包括自交、全同胞交配、半同胞交配、回交等多种交配策略。其中，近亲繁殖中亲缘关系最近的交配方式是自交，自交的基因纯化速率远远快于其它的近交方式，自交主要是利用雌雄同体或性转变现象建立自交系，在技术上可有两种方法一是利用精子低温冷藏技术和性转现象结合进行自交建立自交系，但目前海水贝类的精子低温冷藏技术研究还处于初期阶段，该技术的应用还需以时日；另一种较可行的方法是利用雌雄同体个体的成熟精卵通过自体受精建立自交系。太平洋牡蛎是一种雌雄异体型贝类，Hedgecock等 (1995)利用少数的雌雄同体个体的雌雄配子进行自体受精建立了自交系，王梅芳等(2006) 对马氏珠母贝雌雄同体个体的自体受精及其早期胚胎发育进行了研究，发现自体受精的受精率明显低于异体受精，发育过程中有较多的卵裂球解体，部分胚胎可发育成D型幼虫，但未能培育出幼苗。张国范等(2003)成功地利用雌雄同体型的海湾扇贝构建了自交家系。对于雌雄异体型贝类，其雌雄配子同体个体的比例较低，而且其雌、雄配子同时发育成熟的情况更是少见。在华贵栉孔扇贝，虽然通过组织切片观察到了雌雄同体现象的存在，但利用该现象构建自交系的方法并没有报道，而且也未见通过解剖法进行人工授精方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种华贵栉孔扇贝自交系的建立方法。本发明采取如下方案达到上述目的从华贵栉孔扇贝中选择出雌雄同体的个体， 采用自交的方法建立和培育自交系。所述的自交的方法为挑选性腺成熟的、外观上为雌性的华贵栉孔扇贝，显微镜检查性腺组织，挑选出同时含有卵和精子的个体，即雌雄同体型个体，对其进行诱导催产，每个个体在相互隔离的条件下独立排放精、卵，并使同一个个体所产的精、卵进行自体受精， 然后按该物种的常规技术进行胚胎孵化、幼虫培育及养成，在操作过程中采取常规的隔离措施，避免自交系以外的个体混入其中。其操作步骤如下
雌雄同体个体的鉴别将性腺饱满的、颜色为橘黄色的贝编号，每一个贝用注射器针穿刺性腺组织，涂抹在载玻片上并滴一滴海水，将载玻片上置于显微镜下观察，如样品中含有卵和精子，则该个体为雌雄同体型。催产和授精将挑选出的雌雄同体个体阴干30-60分钟后，流水冲20-30分钟， 将每个贝单独放入一个容器中，每个容器中事先加入比原培育水温高3- 5 ！的海水。观察贝的精卵排放情况。将同一个个体所产的卵子与精子进行受精，避免其他个体的配子混入。针对精卵排放不同步及数量差异悬殊的具体情况，本发明在催产和受精过程中采取下述措施人为增加或减少精子数量以对水体中精、卵的相对比例进行人工干预和调节 对于先产精后产卵的情况，当含有精子的水体呈现乳白色时，将贝取出置于另一容器中继续排放，并保留精液；当该贝开始排卵时，即刻将该贝取出并冲洗，然后置于新鲜的过滤海水中让其产卵，当产卵水体中卵的数量达到10个/mL以上或不再排放时，取样于显微镜下观察，当50 %以下的卵子外周可观察的精子数量少于一个时，按体积比1 :100加入该贝的精液，并搅动水体，3- 5分钟后取样于显微镜下观察，到90%以上的卵子外周可观察到 1-2个精子时停止加入精液；30分钟后用虹吸法换水。对于先产卵后产精的情况，当产卵量达到10个/mL以上时，将贝取出置于另一容器中让其排精，然后按体积比1 :100加入精液该贝所产卵中。针对产精不产卵或产卵不产精的具体情况，本发明采用解剖性腺法和氨海水刺激法进行人工授精。对于产精不产卵，产卵不产精的个体，在常规催产结束后对亲本生殖腺进行解剖，然后将获得的配子在氨海水中进行人工授精。具体操作方法为用解剖刀剖开贝体，剪取性腺并剪碎，用200-300目筛绢袋挤压性腺组织，获得挤压物。对产精不产卵的情况，将性腺组织挤压物放入较大容器中，事先盛有50 - 200升的0.002-0. 005%的氨海水， 30分钟后吸出容器上层2/3的水体，并加入过滤海水，重复3次。对产卵不产精的情况，则将挤压物置于IL的0. 002-0. 005%的氨海水中，按1 :100的体积比加入已收集的卵中，显微镜检查卵周围精子的数量，当50%卵周围的精子少于1个时，添加精液直至90%以上的卵周围有1-2个精子时停止。按常规技术进行孵化、幼虫培育和养殖，并防止不同亲本间的污染。本发明中关键的步骤在于(1)利用华贵栉孔扇贝自然存在的雌雄同体现象，通过显微检查鉴别出雌雄同体个体；(2)通过解剖法获取通过诱导法不能获得的配子，并通过氨海水刺激法促进精、卵成熟，并完成受精和胚胎发育；(3)精子数量过多，会导致华贵栉孔扇贝胚胎发育失败，本发明采用镜检的方法辅助控制精液量的加入，并通过增大水体和换水的方法稀释精子的密度，调剂精卵的比例。本发明的优点本发明利用雌雄异体型的华贵栉孔扇贝中的雌雄同体特殊个体建立自交系，可加快华贵栉孔扇贝基因的纯化速度，加快品种选育速度。本发明操作简便、不使用特殊的化学试剂，容易推广应用。
具体实施方式
2009 年 11 月
从大鹏湾养殖群体中挑选出两龄的性腺较饱满、颜色为橘黄色的华贵栉孔扇贝70个， 于室内蓄养3天。蓄养期间，每天换水一次，水温22°C，且投喂充足的饵料，促进性腺进一步发育成生理成熟状态。将贝排列编号，每一个贝用注射器针穿刺性腺组织，涂抹在载玻片上并滴一滴海水，将载玻片上置于显微镜下观察，发现4个贝的性腺组织中既有卵子又和有精子。将这4个雌雄同体型个体阴干60分钟后再流水刺激30分钟，然后将贝分别置于 4个编号的盛有IL海水(26°C，升温4°C)的玻璃烧杯中。1、2、4号个体约在10分钟开始排精，当水体呈乳白色时，将贝取出置于另一烧杯中，并加入同样的升温海水，当换水3次后，观察到1、4号个体开始排卵，将贝取出并用过滤海水冲洗，然后置于干净的盛有约3L过滤海水的5L玻璃缸中，10分钟后，已收集有大量的卵，同时加入相应编号贝所产的精液1ml，用玻璃棒搅勻水体，取少量水体于显微镜下观察， 精子游动，卵圆形；但1号个体卵周围的精子数量较多，约有40%的卵周围的精子达10个以上，而4号个体卵周围的精子数量仅1-2个。2小时后统计受精率，1、4号个体的受精率分别为30%和78%。对于华贵栉孔扇贝，除了每个个体所产的精卵质量、成熟度不同，它们会导致不同的受精率外，精子数量也是一个最为关键的因素，数量过多会导致孵化失败，1号个体受精率较低，可能的主要原因是精子数量过多。一般情况下，卵周围的精子数量控制在1-2 个较合适，如4号个体。10小时后收集上浮幼虫进行常规培育，1号个体经3天培育后，幼虫全部死亡；4号个体在第13天时，开始出现眼点并投入采苗器，幼虫密度为15个/100ml。 2010年3月，4号贝有120个贝存活，大小为2. 32cm。2号个体于30分钟开始排卵，但数量少，显微观察其精子基本不活动，卵形态不规则，放弃。3号个体未产精产卵。2011年5月
从大亚湾养殖群体中挑选出30个性腺饱满、颜色为橘黄色的华贵栉孔扇贝，于室内蓄养4天，蓄养水温25°C。将贝排列编号，每一个贝用注射器针穿刺性腺组织，涂抹在载玻片上并滴一滴海水，将载玻片上置于显微镜下观察，发现1个贝的性腺组织中既有卵子又和有精子。将这个雌雄同体型个体阴干30分钟后再流水刺激20分钟，然后将贝置于盛有3L 海水(29°C，升温4°C)的玻璃缸中。15分钟后开始排精，60分钟后仍没有观察到排卵，即刻将该改贝取出并用海水冲洗后剖开，用剪刀剪取性腺并剪碎该组织，并置于200目的筛绢网袋中进行挤压，将挤压出的黄色液体置于100L的0. 0025%的氨海水中，镜检发现精子过多，大部分卵透明，少部分卵圆形，30分钟后吸去2/3上清液，再加入过滤海水，重复3次后，将沉到容器底部的卵转入IOL容器中进行孵化，2小时后统计受精率，为73%。8小时后收集上浮幼虫，并按常规技术进行幼虫培育，23天后获得30个300-500um的稚贝。
权利要求
1.一种华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，其特征在于从华贵栉孔扇贝中选择出雌雄同体的个体，采用自交的方法建立和培育自交系；通过解剖法获取配子，并通过氨海水刺激法促进精、卵成熟，完成受精和胚胎发育。
2.根据权利要求1所述华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，其特征在于所述的自交的方法为挑选性腺成熟的、外观上为雌性的华贵栉孔扇贝，对其进行诱导催产，每个个体在相互隔离的条件下独立排放精、卵，并使同一个个体所产的精、卵进行自体受精，然后进行胚胎孵化、幼虫培育及养成；在操作过程中采取隔离措施，避免自交系以外的个体混入其中。
3.根据权利要求1或2所述华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，其特征在于雌雄同体个体的鉴别方法为用注射器针穿刺性腺组织，涂抹在载玻片上并滴一滴海水，将载玻片上置于显微镜下观察，如样品中含有卵和精子，则该个体为雌雄同体个体。
4.根据权利要求1或2所述华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，其特征在于催产和授精的方法为将挑选出的雌雄同体个体阴干30-60分钟后，流水冲20-30分钟，将每个贝单独放入一个容器中，每个容器中事先加入比原培育水温高3- 5 °C的海水；观察贝的精卵排放情况；将同一个个体所产的卵与精子进行受精，避免其他个体的配子混入。
5.根据权利要求1或2所述华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，其特征在于对于先产精后产卵的情况，采取以下措施当含有精子的水体呈现乳白色时，将贝取出置于另一容器中继续排放，并保留精液；当该贝开始排卵时，即刻将该贝取出并冲洗，然后置于新鲜的过滤海水中让其产卵，当产卵水体中卵的数量达到10个/mL以上或不再排放时，取样于显微镜下观察，当50 %以下的卵子外周可观察的精子数量少于一个时，按体积比1 :100加入该贝的精液，并搅动水体，3- 5分钟后取样于显微镜下观察，到90%以上的卵子外周可观察到1-2个精子时停止加入精液。
6.根据权利要求1或2所述华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，其特征在于对于先产卵后产精的情况，采取以下措施当产卵量达到10个/mL以上时，将贝取出置于另一容器中让其排精，然后按体积比1 :100加入精液到该贝所产卵中。
7.根据权利要求1或2所述华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，其特征在于针对产精不产卵或产卵不产精的情况，采取以下措施对于产精不产卵，产卵不产精的个体，在常规催产结束后对亲本生殖腺进行解剖，然后将获得的配子在氨海水中进行人工授精。
8.根据权利要求7所述华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，其特征在于用解剖刀剖开贝体，剪取性腺并剪碎，用200-300目筛绢袋挤压性腺组织，获得挤压物；对产精不产卵的情况，将性腺组织挤压物放入较大容器中，事先盛有50 - 200升的0.002-0. 005%的氨海水，30分钟后吸出容器上层2/3的水体，并加入过滤海水，重复3次；对产卵不产精的情况， 则将挤压物置于IL的0. 002-0. 005%的氨海水中，按1 :100的体积比加入已收集的卵中， 显微镜检查卵周围精子的数量，当50%卵周围的精子少于1个时，添加精液直至90%以上的卵周围有1-2个精子时停止。
全文摘要
本发明涉及一种华贵栉孔扇贝自交系的建立方法，该方法能快速对华贵栉孔扇贝基因组进行纯化，加快其品种选育速度。通过显微检查，挑选出外观上为雌性的含有雌、雄生殖细胞的个体，即雌雄同体型个体，通过诱导催产或解剖授精的方法，使同一个体的精卵受精，并采取措施人为增加或减少精子数量以对水体中雌雄两种配子的相对比例进行人工干预和调节，按该物种的常规技术进行孵化、培育和养殖，建立自交系。本发明操作简便、不使用特殊的化学试剂，容易推广应用。
文档编号A01K61/00GK102440207SQ20111030367
公开日2012年5月9日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者何毛贤, 刘文广 申请人:中国科学院南海海洋研究所