专利名称：一种甜叶菊多倍体离体诱导技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甜叶菊染色体加倍的技术，属于农业生物技术领域或植物细胞工程领域。
背景技术：
甜叶菊(stevia rebaudiana bertoni)是菊科多年生草本植物,原产南美巴拉圭，现世界各地引种栽培均获得成功。甜叶菊叶片中含有的甜菊糖甙甜度是蔗糖的25(Γ300倍，但所含热量仅是蔗糖的1/300，是目前已知最甜的天然甜味剂，已经替代糖精在食品、医药等工业中得到广泛应用，并对肥胖症、低血糖、糖尿病、小儿龋齿、高血压、心脏病等具有·一定的防治效果和辅助治疗作用，是继甘蔗糖、甜菜糖之外有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三健康糖源”。多倍体育种是对植物进行高产优质种质改造的重要手段，植物染色体数目加倍后，往往表现出植物器官的巨大性，适应性、抗逆性增强，营养生长阶段延长，开花期推迟，次生代谢产物增加等特点。这些对于以叶片为收获物并用以提取甜菊糖的甜叶菊来说，更是意义重大。利用秋水仙素进行化学诱变获得多倍体是园艺植株育种中的重要方法之一，将化学诱变技术与组织培养技术结合进行诱变育种具有其独特优势。国内外有关甜叶菊组培快繁已经有较多的研究和应用，但有关利用秋水仙素进行甜叶菊多倍体离体诱变研究未见报道。本发明的目的是通过将两项科技手段结合应用于甜叶菊，建立起一种高效的甜叶菊多倍体诱导技术体系。
发明内容
I.在超净工作台上将甜叶菊试管苗去顶除叶，将切下的茎段接种于再生苗培养基上。培养基为 MS+BA1.0 mg/L+NAAO. 2 mg/L。2.向茎段滴加浓度为O. 1% -O. 4%秋水仙素溶液，确保秋水仙素溶液浸润每个茎段。3.在组培室内培养1-3天后，用无菌水漂洗3次。4.将茎段转移至新的再生培养基上继续培养30天，长成芽苗。5.将芽苗接种于生根培养基中生根培养20天。培养基为1/2MS +ΙΒΑ0. 5 mg/L。6.试管苗根长至1-2 cm时，取根用常规细胞压片技术进行染色体检测；撕取突变苗及对照苗叶片下表皮观察组织细胞及气孔结构特征。7.染色体检测的染色方法为0.002 mol/L 8_羟基喹啉预处理2 h、卡诺氏固定液固定24 h、l mol/L盐酸及无水乙醇I : I解离液解离30 min、改良苯酚品红染液染色10min。8.整个组织培养期间培养室温度为25± 1°C，光照强度约30 μ mo I · m_2 · s—1 (光源为40 W日光灯)，光照时间12 h/d。本发明所述的甜叶菊多倍体诱导方法，与传统秋水仙素处理茎尖生长点不同，传统方法是用秋水仙素点滴涂抹茎尖生长点，但由于甜叶菊的顶端新叶丛生，诱变剂难以完全浸润到生长点，影响诱变的效果。本发明采用试管苗茎段侧芽作为外植体且在其再生植株过程中进行诱导处理，由于试管苗侧芽体较小，有利于秋水仙素的有效渗入侧芽所有细胞产生诱变效应，因而可能是获得较高比例的多倍体植株的原因之一，也使得嵌合体很少。本发明的将二倍体甜叶菊转变为四倍体后，染色体数目由2n=2x=22转变为2n=4x=44 (图1)，多倍体甜叶菊的诱导率(诱导率=多倍体植株数/处理的甜叶菊株数X 100)最高达到43. 6%。四倍体甜叶菊的外形也发生了明显的改变，表现在，气孔增大(图2)，叶片明显变大，叶片变宽，叶形由长披针形变成椭圆形(图3)。
参见附图
图I为甜叶菊染色体加倍前(A)后(B)染色体数目的变化。图2为甜叶菊染色体加倍前(A)后(B)叶片气孔大小的变化。
图3为甜叶菊染色体加倍前(A)后(B)叶片形态及大小的变化。
具体实施例方式实施例I :
I.在超净工作台上将甜叶菊试管苗去除叶片，切成带一侧芽，长约I. O cm的茎段。将切下的茎段接种于再生苗培养基上。培养基为MS+BA1.0 mg/L+NAAO. 2 mg/L。每瓶接种4个茎段，每处理接种10瓶，置于培养室培养。2.向茎段滴加浓度为O. 1%秋水仙素溶液，确保秋水仙素溶液浸润每个茎段。3.在组培室内培养3天后，用无菌水漂洗3次。将茎段转移至新的再生培养基上继续培养30天，长成芽苗。将芽苗接种于生根培养基中生根培养20天，培养基为MS +ΝΑΑ0. 5mg/L ο5.试管苗根长至1-2 cm时，取根用常规细胞压片技术进行染色体检测，撕取突变苗及对照苗叶片下表皮观察组织细胞及气孔结构特征。6.上述染色体检测的染色方法为0.002 mol/L 8_羟基喹啉预处理2 h、卡诺氏固定液固定24 h、l mol/L盐酸及无水乙醇I : I解离液解离30 min、改良苯酚品红染液染色10 min。7.在个过程中的组培室的培养条件为温度25± I °C，光照强度约30μ mo I · m_2 · s—1 (光源为40 W日光灯),光照时间12 h/d。效果经检测染色体加倍的甜叶菊植株，叶片变圆，变大，变厚，气孔增大，染色体数目由2n=2x=22转变为2n=4x=44，多倍体甜叶菊诱导率达到42. 3%。实施例2
具体方法如实施例1，其中滴加O. 4%秋水仙素浓度后培养3天，多倍体甜叶菊诱导率达到 43. 6%ο实施例3
具体方法如实施例1，其中滴加O. 2%秋水仙素浓度后培养3天，多倍体甜叶菊诱导率达到 41. 1%。
权利要求
1.在超净工作台上将甜叶菊试管苗去除叶片，切成带一侧芽，长约l.oCm的茎段。
2.将切下的茎段接种于再生苗培养基上。
3.向茎段滴加浓度为O.1%-0. 4%秋水仙素溶液,确保秋水仙素溶液浸润每个茎段。
4.在组培室内培养1-3天后，用无菌水漂洗3次。
5.将茎段转移至新的再生培养基上继续培养30天，长成芽苗。
6.将芽苗接种于生根培养基中生根培养20天。
7.试管苗根长至1-2cm时，取根用常规细胞压片技术进行染色体检测，并撕取突变苗叶片下表皮观察组织细胞及气孔结构特征。
8.根据权利要求2和权利要求5所述的再生苗培养基，其特征在于，培养基为MS+BA1.Omg/L+NAAO. 2 mg/L。
9.根据权利要求6所述的生根培养基，其特征在于，培养基为1/2MS+ΙΒΑ0. 5 mg/L。
10.根据权利要求7所述的染色体检测方法，其特征在于，染色方法为0.002mo I/L8-羟基喹啉预处理2 h、卡诺氏固定液固定24 h、l mol/L盐酸及无水乙醇I : I解离液解离30 min、改良苯酚品红染液染色10 min。
11.根据权利要求4、权利要求5和权利要求6所述的培养条件，其特征在于，培养室温度25±1°C，光照强度约30 μ mo I · m_2 · s—1 (光源为40 W日光灯)，光照时间12 h/d。
全文摘要
采用离体培养与化学诱变技术相结合诱导甜叶菊多倍体。将甜叶菊试管苗切顶除叶，切成带一侧芽的茎段，插于再生苗培养基上，用秋水仙碱滴加浸润茎段。培养1-3天后清洗，再培养30天长成芽苗，转接于生根培养基上生根。经细胞组织学鉴定，多倍体诱导成功，多倍体比率可达43.6%。
文档编号A01H4/00GK102893860SQ201110317740
公开日2013年1月30日 申请日期2011年10月19日 优先权日2011年10月19日
发明者崔广荣, 何克勤, 胡能兵, 张子学, 林平, 王波 申请人:崔广荣