专利名称：水稻雄性不育株系种子的制备方法、繁种方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的种子的制备方法、繁种方法及其应用，具体涉及的是一种水稻雄性不育株系种子的制备方法、繁种方法及其应用。
背景技术：
水稻雄性不育系，是指一种雄性生殖器官发育异常或退化(主要是花药或花粉退化)但雌蕊生殖器官发育正常的母本水稻材料，由于花药或花粉早期发育异常造成无花粉型或无生活力花粉，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实，因此借助这种母水稻作为遗传工具，通过人工辅助授粉的方法，就能产生大量杂交种子。
从育种战略上看，杂交水稻的发展可以分为三系法、两系法和一系法三个发展阶段。每进入一个新阶段，都是育种上的一次突破，从而会把水稻的产量提高到一个新台阶。三系杂交水稻的研究成功及其在生产上的广泛应用，为我国的粮食生产做出了巨大贡献。但由于受到细胞质生物遗传方面的制约，三系杂交水稻的研究近年来并没有取得很大突破性的进展。自从两用核不育系发现以后，杂交水稻的产量水平又产生了一个新的飞跃。超级杂交水稻的研究成功并在生产上大面积试种，表明两系法比三系法具有更高的生长优势和增产潜力。迄今，其中已获成功的是以利用光、温敏核不育系作为遗传工具的两系法杂交水稻。光温敏两系杂交水稻不需要保持系，种子生产简单，生产成本低，而且两系杂交稻亲本间无恢复系与保持系的限制，可以自由组合，降低了选育的时间、调高了选育优质组合的几率。我国的两系法杂交水稻现已开始进入生产应用，大量的试验和生产示范证明，它一般要比同熟期的三系杂交稻增产5-10 %，因此，两系杂交水稻大有发展前途。两系法具有配组自由、种子生产成本低、无不育细胞质负效应、易转育新不育系等优点；但光温敏核不育系一系两用，其育性受光温条件所左右，育性不稳定，易产生波动，制种和繁殖都存在一定的风险。如何有效地防止夏季异常低温对光温敏核不育系育性的影响已成为我国两系杂交稻生产必须解决的一个重要课题。选育实用的光、温敏核不育系是发展两系杂交水稻的前提。所谓实用，有两点要求，一是在制种时其不育性很稳定，不出现育性波动而发生自交结实现象；二是在繁殖时，育性恢复正常，有较高的自交结实产量。目前国内外育成的光温敏雄性不育系，其核不育基因来源于粳型农垦58S、籼型安农S-1、5460S、衡农S-1、新光S、株IS等；这些材料遗传背景较复杂，不育起点温度“漂变”即育性遗传不稳定；在自然条件下按常规方法繁殖时，随着世代数的增加温敏核不育系的起点温度整体水平逐步提高。其原因主要是温敏型核不育系，群体内个体间的起点温度存在差异，如果不采取有效措施加以防止，不育系将很快因为连续多年自交繁殖导致起点温度的升高，而丧失使用价值。在进行杂种种子生产时，易受不稳定的气温影响，使育性发生波动不稳，导致种子纯度下降，甚至于报废。因此这类材料几乎无使用价值。这一问题的出现严重影响了两系杂交水稻的应用前景，是两系杂交水稻进一步推广和应用的一大障碍。另一方面，不育起点温度低的温敏不育系，在夏季制种时虽无育性波动，但其自身繁殖的产量则低而不稳，有时甚至失败，因为它们恢复可育的温度范围很狭窄，一般仅:TC左右，因此这类材料的应用亦受到很大的限制。因此新型两系不育系的育种目标是育成光照、温度双因子共同控制育性以光照为主的新型光温敏核不育系，即在不育期间单因子低温不能影响育性转变，哪怕气温再低，持续时间再长，也能保持稳定不育。只有在光照和温度两个条件同时满足时，控制花粉发育的启动子才被启动，育性逐渐平稳地由不育转化为可育。由于不育性受两个气候因子共同控制，起到了双保险作用，可确保制种的绝对安全。对该发育过程中关键调控基因的研究和利用将大大加速这一目标的实现
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中水稻育种存在的不足，提供一种水稻雄性不育株系的生产、繁种方法、及其杂交育种中的用途。本发明的种子能够实现一系两用，即0Sms4在长光照条件下为正常可育繁殖种子，在短光照条件下作为不育系，用于杂交稻生产，因而简化了杂交水稻种子生产程序。解决温敏为主水稻不育系杂交制种过程中由于温度变化产生的“漂移现象”。本发明是通过以下的技术方案实现的，第一方面，本发明提供了一种水稻雄性不育株系种子的制备方法，包括如下步骤采用常规方法将水稻种子中的0SMS4基因序列发生突变，使得0sMS4基因的表达量下降或不表达，进而获得隐性纯合0sMS4基因突变的水稻雄性不育株系种子。优选地，所述常规方法包括物理、化学或者生物学上常规的基因突变方法。进一步优选地，所述常规方法为生物学上常规的基因突变方法。进一步优选地，所述0sMS4基因序列发生改变为所述0sMS4基因序列突变为如SEQID NO. 2所示的序列。第二方面，本发明提供了一种水稻雄性不育株系的繁种方法，包括如下步骤培育第一方面所述方法获得的种子，在水稻雄性不育株系的幼穗发育期，保持平均温度为26 32°C，光照条件为每天光照时间彡13. 5小时，光照天数彡2天，所述水稻雄性不育株系表现为可育，进而能够进行繁种，获得水稻种子。优选地，所述包括如下步骤培育前述方法获得的种子，在水稻雄性不育株系的幼穗发育期，保持平均温度为25 35°C，每天光照时间> 14小时，所述水稻雄性不育株系表现为可育，进而能够进行繁种，获得水稻种子。优选地，所述幼穗的发育期为4 6期，保持温度为30 32°C，光照条件为每天光照时间为14小时，光照天数为15天。优选地，所述幼穗的发育期为4 5期，保持平均气温彡30°C，每天光照时间彡14小时。第三方面，本发明提供了一种如前面所述方法获得的水稻雄性不育株系种子在水稻杂交育种的用途。优选地，所述用途包括如下步骤培育前述方法获得的种子，在所述水稻雄性不育株系的幼穗发育期，常规温度下保持每日光照条件< 13小时，所述水稻雄性不育株系表现为不育，之后采用常规方法实施水稻杂交育种。优选地，所述用途包括如下步骤培育前述方法获得的种子，在所述水稻雄性不育株系的幼穗发育期的4 5期，平均气温< 28°C，光照时间< 13小时，所述水稻雄性不育株系表现为不育，之后采用常规方法实施水稻杂交育种。
第四方面，本发明还提供了一种能够转移不育性的水稻雄性不育株系种子的生产方法，包括如下步骤将前述方法获得的种子进行培育，之后与常规水稻材料进行杂交，将0sMS4基因的突变序列引入常规水稻材料中，繁种，进而得到常规水稻材料的雄性不育株系种子。本发明的有益效果如下I、在水稻种植季节的气候条件下(平均温度25°C以上)，通过控制水稻栽培时间来调节水稻生殖生长(开花、产生花粉过程)的光照时间，可以控制本发明水稻雄性不育株系，即0sms4植株的可育和不育，实现一系两用，即0sms4在长光照条件下为正常可育繁殖种子，在短光照条件下作为不育系，用于杂交稻生产，因而简化了杂交水稻种子生产程序，解决温敏为主水稻不育系杂交制种过程中由于温度变化产生的“漂移现象”；2、本发明的水稻0sms4不育系配组自由，选到优良组合的机率极大的超过了三系法。避免了不育细胞质对杂种优势的负效应和细胞质的单一化；3、本发明水稻雄性不育株系和其它水稻材料杂交后，能够将0sms4基因突变引入其它水稻材料，这些含有0sms4纯合突变的材料也会出现长光照可育，短光照不育的表型，能够用来进行两系杂交水稻育种。
图I为本发明效果示意图。其中图IA为粳稻9522去内外稃花表型图；图IB为osms4不育株去内外稃花表型图；图IC为0sMS4基因组DNA表达载体转化osms4不育株去内外稃花表型图；图ID为0sMS4RNAi表达载体转化粳稻9522植株去内外稃花表型图；图IE为光温敏不育株osms4去内外稃花表型图；图IF为粳稻9522花粉粒I2-IK染色图；图IG为0sms4不育株花粉粒I2-IK染色图；图IH为0sMS4基因组DNA表达载体转化osms4不育株花粉粒I2-IK染色图；图II为0sMS4RNAi表达载体转化粳稻9522植株花粉粒I2-IK染色图；图IJ为光温敏不育株osms4花粉粒I2_IK染色图；图IA到图IE的图标等于2晕米；图IF到图IJ的图标等于100微米。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例I、水稻雄性不育株系的生产方法
I、水稻雄性不育株系的获得取常规的水稻材料，即粳稻9522种子。采用6tlCo Y射线进行照射，处理剂量为280Gy，获取诱变材料。对诱变材料的F2代中的一株雄性不育突变体进行三代回交，获得隐性单基因调控的稳定遗传的水稻突变体osms4。之后将水稻突变体0sms4与粳稻9522回交，Fl代全部为可育。自交F2代中出现分离，其中正常植株为419，突变株为126，正常植株与突变植株比例接近3 Kx2 = 1.028,P > 0. 05)，表明该雄性不育突变体表型由一个单核基因突变造成。2、确定水稻雄性不育株系的突变位点
2. I、定位群体将第I步获得的水稻0sms4突变体与籼稻品系龙特甫B杂交，自交获得F2代，选择其中为雄性不育植株为定位群体。2. 2、水稻 DNA 提取采用改进的CTAB法进行雄性不育植株的DNA提取。步骤如下取雄性不育植株叶片0. 1-0. 2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入700ul 100°C预热的I. 5xCTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入56°C水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，离心(13000rpm) 10分钟，取上清于新管中，加入900ul无水乙醇混匀后_20°C放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm(10分钟)。去掉上清，将沉淀用lml70%乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中，4°C冰箱保存。2. 3、InDel分子标记分析InDel分子标记设计，根据比较粳稻日本晴籼稻9311两品系的已公布的核苷酸序列(参见http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi),对差异的部分设计引物,验证2个亲本粳稻9522和籼稻龙特甫B之间的多态性；PCR 扩增程序为IOul 体系中，Iul 模板，Iul 10pmol/ul Primerl, Iul IOpmoI/ulPrimer2, Iul IOXBuffer (Mg2+), Iul 2mM dNTP,0. Iul Taq，3.9ul 水。通过 6%的 PAGE胶电泳，银染方法检测。2. 4、群体分离分析(bulked segregant analysis)初定位方法用从F2代得到的不育突变体132株(遗传重组子132)对标记进行扩增反应，发现I号染色体上的标记ZH104与0sMS4座位相联锁，选取附近的标记ZH106，在F2代分离群体进行进一步验证，都与0smS4有连锁关系，并且初步将0sMS4定在ZH104和ZH106之间。为进一步定位0sMS4座位，扩大F2代群体到3000株，从中得到用于定为突变体750株，在ZH104和ZH106之间发展了 8个InDel标记(表I)，最终将0sMS4座位定位在ZH134和ZH138之间。通过在网上(http://www.tigr.org)下载的粳稻日本晴第I号染色体拼接的序列(参见 http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，分析 ZH134 和 ZH138 两标记别位于克隆AP00837上，物理距离为23kb。用分子标记对定位群体中的雄性不育单株进行基因型分析，利用MapDraw V2. I构建目标基因区域的分子标记的连锁图谱。2. 5、0sMS4基因的克隆
对23kb范围内的预测的MYB家族的基因测序，测序结果表明，突变体中在这个基因的第一个外显子上发生了一个核苷酸的缺失和一个G到A的颠换，最终确定发生突变的基因为0sMS4基因(SEQ ID NO. I所示)，突变后的基因为0sMS4，其碱基序列如SEQ ID NO. 2所示，进而确定水稻osms4突变体的突变位点为0sMS4基因。3、水稻雄性不育株系恢复育性验证以粳稻9522 的基因组 DNA 为模板，以 MYBF (SEQ ID NO. 3) ,MYBR (SEQ ID NO. 4)为引物，扩增一个4318bp的片断，其中包括0sMS4基因全长、启动子和终止子。PCR反应体系的总体积为50 u L，水稻基因组DNA模板I y L (约50ng)、1*K0D酶反应缓冲液、25mM MgCl2 3u L/,2Mm dNTP 4 y L、10 y M 引物 0. 5 y L、50%甘油 5 y L、0. 5 单位KOD 酶(Takara 公司)，加 ddH20 M 50 u L0反应程序94°C变性10min，94°C 40s,55°C 40s,68°C 4min，35 个循环；68°C延伸5min。产物在I %琼脂糖胶上检测，割胶纯化。 将这个片断直接用PmaCI和BamHI双酶切后回收片断，连入相同酶切的PCAMBIA1301载体,测序验证正确。把构建好的载体电转农杆菌EHA105，采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacteriumandsequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal 1994,6:271-282)，转到正常的粳稻9522水稻品种中。如图I所示，互补载体转入osms4突变体后，花药变成黄色，I2-IK染色花粉粒也恢复染色，可以得到正常的结实。结果表明，0sMS4基因可以恢复突变体育性。4、RNAi (RNA interference)转化验证基因功能在0sMS4基因的最后一个外显子和3_UTR(非翻译区)设计RNAi片段。设计引物 0sMS4i-lF(SEQ ID NO. 5)，0sMS4i_lR(SEQ ID NO. 6)，0sMS4i_2F (SEQ ID NO. 7)和0sMS4i-2R(SEQ ID NO. 8)。PCR反应体系的总体积为20 u L，水稻基因组DNA模板I U L(约50ng)、l*Taq酶反应缓冲液、25mM MgC121. L/、2Mm dNTP I. 5 y L、10 y M 引物 0. 2 y L、50 % 甘油 2 y L、
0.3 单位 Taq 酶(Takara 公司)，加 ddH20 至 20y L。反应程序94°C变性 5min，94°C 40s、55°C 40s lmin，72°C 40s，35个循环；72°C延伸5min。产物在I. 5%琼脂糖胶上检测，割胶纯化。把2 个纯化的 DNA 片段分别连接到 RNAi 载体pTCK303 (Plant Molecular Biology,2004,22 :409-417)上。把构建好的载体电转农杆菌EHA105，采用农杆菌介导的遗传转化方法(Hiei 等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. PlantJournal1994，6 :271-282),转到正常的粳稻9522水稻品种中。RNAi转基因植株中花药为白色，花粉粒不着色(见附图I)，进而证明0sMS4基因具有控制水稻育性的功能。实施例2、水稻雄性不育株系育性转换及繁种方法实施例I获得的水稻osms4突变体的育性转换能够通过温光环境的控制实现。自然条件下，幼穗分化进期至花粉母细胞形成期，当每日光照< 13小时时，不育系育性稳定，花药为白色，花粉染色为典败；
当每日光照时间彡13. 5小时时，光照天数彡2天时，温度为26 30°C条件下，由不育转换成可育。当每日光照时间彡14小时时，温度为25 35°C条件下，由不育转换成可育。花粉染色正常花粉粒在45-80%，结实率在60-80%之间。水稻osms4突变体的育性转换对光照时间、光照强度和光谱范围都较敏感。光照时间没有达到育性转换条件时，对温度的波动表现出钝感。当水稻osms4突变体为可育时，可实现繁种。在水稻0sms4突变体的幼穗发育至4 6期时，保持平均温度为30 32°C，光照条件为每天光照时间为14小时，光照天数为15天，水稻的0sms4突变体可育，进而得到水稻0sms4突变体的种子，产量为150-400公斤/亩。实施例3、水稻雄性不育株系在水稻杂交育种的用途2008年上海秋季制种，面积I. 0 H ;父本为上海市农业科学研究院选育的梗稻恢复系湘晴(JP50)，父本5月30日播种，6月25日插秧，9月5日抽穗；
母本(即实施例I中的水稻的osms4突变体)于6月23日播种，7月12日插秧，9月8日抽穗；父母本行比2 8。母本开花第一天即取样花粉镜检，经I2-IK染色80%花粉为典败，20%为圆败；套袋自交结实为O。母本开花早，花时较集中，父母本花时相遇良好；收获杂交种子140kg ；2008年冬海南纯度鉴定不育株率为0.5%，纯度为97.8%。2008年海南冬季制种I. 5亩，父本为上海市农业科学研究院选育的粳稻恢复系湘晴(JP69)。父本12月10播种，3月I日抽穗，母本(即实施例I中的水稻的osms4突变体)12月31日播种，3月4日抽穗；母本osms4花药为纯白色、短棒状,套袋自交不结实。母本在短光低温、低湿条件下开花较晚，异交结实降低，制种产量不理想，每亩收获种子30kg。2009年正季上海杂交一代纯度鉴定纯度为96. 7%，其中不育株为I %。实施例4、水稻雄件不育株系的自由配组0sms4不育系配组自由，选到优良组合的机率极大的超过了三系法。避免了不育细胞质对杂种优势的负效应和细胞质的单一化。从2006年开始广泛同不同生态类型的恢复系、常规稻测交配组。利用该光温敏不育系同早熟粳型恢复性C418配组，杂种一代表现出早熟，大穗、闻抗、生长势强等特点。同JP69、JP50配组，杂种一代茎杆粗壮、穗型大，着粒密、抗倒性强、结实率高，具有超级杂交稻的农艺性状和技术指标。与常规粳稻秀水123、桂花黄等测交，杂种一代表现株叶形态好，分蘖力强，熟期适中，结实率高，稳产性好，易于栽培。同时与籼稻亲本9311、龙特浦等配组，杂种一代表现出超强生长势，株叶形态理想，结实率在50-70%，说明该不育系具有一定的广亲和性。实施例5、能够恢复可育件的水稻雄件不育株系的牛产方法采用常规杂交手段将水稻osms4突变体与籼稻珍汕97B、天丰B、丰矮占一号、早熟粳稻“松江早熟香粳”杂交，F2代通过群体分离统计，合乎3 I分离规律。利用分子标记检测方式，把具有0sMS4基因的不育株继续同杂交亲本回交，B1F2代在海南选择不育性稳定，农艺性状好的不育单株带稻根回上海再生长苗，剥蘖繁殖，在不同光照、温度条件下观察其育性。结果发现，有1/3的株系具有0sms4的育性转换特性，恢复可育结实率达60%。将这些株系经采样PCR检测，确定都具有0sMS4分子标记存在(SEQID NO. 2)。将收获的种子带海南分期播种，结果发现在不同时期抽穗都为不育，花药镜检为典败，套袋自交不结实。试验证明，海南(纬度109. 30，经度18. 14三亚)接近赤道，太阳基本属于直射，光照时间短(1-3月份小于13小时)，光照条件达不到该不育基因转换的要求，因此说明在海南制种是安全可靠的。本实施例证实水稻0sms4突变体和其它水稻材料杂交后，将该突变序列引入其它遗传背景的水稻时，这些含有0sms4纯合突变的材料也会出现长光照可育，短光照不育的表型，也可以用来进行两系杂交水稻育种。综上所述，本发明通过控制水稻栽培时间来调节水稻生殖生长，可以控制本发明水稻雄性不育株系，即0sms4植株的可育和不育，实现一系两用，简化了杂交水稻种子生产程序。本发明的水稻0sms4不育系配组自由，选到优良组合的机率极大的超过了三系法，避免了不育细胞质对杂种优势的负效应和细胞质的单一化；本发明水稻雄性不育株系和其它 水稻材料杂交后，能够将0sMS4基因突变引入其它水稻材料，这些含有osms4纯合突变的材料也会出现长光照可育，短光照不育的表型，能够用来进行两系杂交水稻育种。
权利要求
1.一种0sms4水稻雄性不育株系种子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤采用常规方法将水稻种子中的0sMS4基因序列发生突变，使得0sMS4基因的表达量下降或不表达，进而获得隐性纯合0sMS4基因突变的水稻雄性不育株系种子。
2.如权利要求I所述的水稻雄性不育株系种子的制备方法，其特征是，所述常规方法包括物理、化学或者生物学上常规的基因突变方法。
3.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系种子的制备方法，其特征是，所述常规方法为生物学上常规的基因突变方法。
4.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系种子的制备方法，其特征是，所述0sMS4基因序列发生改变，如所述0sMS4基因序列突变为如SEQ ID NO. 2所示的序列。
5.一种水稻雄性不育株系的繁种方法，其特征在于，包括如下步骤培育权利要求I所述方法获得的种子，在水稻雄性不育株系的幼穗发育期，保持平均温度为26 32°C，每天光照时间> 13. 5小时，光照天数> 2天，所述水稻雄性不育株系表现为可育，进而能够进行 繁种，获得水稻种子。
6.如权利要求5所述的水稻雄性不育株系的繁种方法，其特征是，包括如下步骤培育权利要求I所述方法获得的种子，在水稻雄性不育株系的幼穗发育期，保持温度为25 35°C，每天光照时间> 14小时，所述水稻雄性不育株系表现为可育，进而能够进行繁种，获得水稻种子。
7.如权利要求6所述的水稻雄性不育株系的繁种方法，其特征是，所述幼穗的发育期为4 6期，保持平均温度为30 32°C，每天光照时间为14小时，光照天数为15天。
8.如权利要求5所述的水稻雄性不育株系的繁种方法，其特征是，所述幼穗的发育期为4 5期，保持平均气温彡30°C，每天光照时间彡14小时。
9.一种如权利要求I所述方法获得的水稻雄性不育株系种子在水稻杂交育种的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步骤培育权利要求I所述方法获得的种子，在所述水稻雄性不育株系的幼穗发育期，常规温度下保持每日光照(13小时，所述水稻雄性不育株系表现为不育，之后采用常规方法实施水稻杂交育种。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步骤培育权利要求I所述方法获得的种子，在所述水稻雄性不育株系的幼穗发育期的4 5期，平均气温(28°C，光照时间< 13小时，所述水稻雄性不育株系表现为不育，之后采用常规方法实施水稻杂交育种。
12.一种能够转移不育性的水稻雄性不育株系种子的生产方法，其特征在于，包括如下步骤将权利要求I所述方法获得的种子进行培育，之后与常规水稻材料进行杂交，将0sMS4基因的突变序列引入常规水稻材料中，繁种，进而得到常规水稻材料的雄性不育株系种子。
全文摘要
本发明涉及一种水稻雄性不育株系种子的制备方法、繁种方法及其应用。所述制备方法包括如下步骤采用常规方法将水稻种子中的OsMS4基因序列发生突变，通过传统的遗传杂交筛选，获得一个隐性纯合OsMS4基因突变的水稻雄性不育系；该osms4不育系在一定繁种条件下可以恢复花粉育性，具有繁殖含有纯合OsMS4基因突变的种子的能力。该纯合隐性OsMS4基因突变的水稻雄性不育系种子能够实现繁种。本发明通过控制水稻栽培时间来调节水稻生殖生长，可以控制本发明水稻雄性不育株系，即osms4植株的可育和不育，实现一系两用，简化了杂交水稻种子生产程序。
文档编号A01H1/06GK102726285SQ20111043116
公开日2012年10月17日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者张大兵, 张辉, 梁婉琪, 袁政 申请人:上海交通大学