产生单克隆植物细胞系的方法
【专利摘要】本发明提供一种由植物细胞的异种群体产生单克隆植物细胞系的方法，其包含下列步骤：（a）提供植物细胞的异种群体；（b）由该植物细胞的异种群体制备原生质体；（c）通过将原生质体制备物进行流式细胞分选而分离单一原生质体；（d）在饲养细胞材料存在的情况下，通过共培养使分离的单一转化原生质体再生直到形成小集落；（e）将小集落从饲养细胞材料中转移，并培养小集落直到形成单克隆植物细胞系。
【专利说明】产生单克隆植物細胞系的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物【技术领域】。具体而言，本发明涉及通过流式细胞分选由植物细胞的异质性群体产生天然(野生型)或转基因单克隆植物细胞系。对于本领域技术人员而言明显的是，本发明也包含使用该单克隆植物细胞系再生整株可育性植株。
【背景技术】
[0002]在过去数十年间，已将许多工作投注于建立并培养以植物为基础的系统，以用于积聚和获取天然或异种蛋白质与次级代谢产物。文献提供了大量的证据性材料来证明以植物为基础的系统的实用性，即、生产多种所希望的物质，该物质被分泌至培养基或从生产细胞、组织、细胞器或甚至于整株植物或其部分分离。同样地，存在有广泛的确保建立稳定或暂时转化的植物材料的转化实验报告(transformation protocol)。但是,还需要可靠、相对低成本并且快速的技术，以从植物细胞获得高产量的所要产物。
[0003]已重复报导，植物细胞群(诸如植物悬浮培养物)的转化通常会产生转基因培养物，该培养物显示细胞具有高度异质性(混合型)与目标蛋白质表达水平不一致，所述目标蛋白质与初级异质性细胞群中的表观基因不同的细胞混合物有夫。在重组细胞系中，转基因表达的异质性证实生产率方面的严重问题。
[0004]主要问题为在转化试验中通常罕见高产克隆，而且要建立同源性高产细胞系相当耗时。因此，仍存在着的技术挑战为从刚转化或已转化的转基因植物培养物中生产与回收优异的转基因产物。
[0005]关于流式细胞分选(flow cytometric sorting)(诸如FACS (突光激活细胞分选)应用)，必须通过细胞的酶消化而释放出原生质体，从而自通常聚集在一起的植物细胞群或培养物取得単一球形细胞。但是，对于大部分的植物品种来说，単一原生质体的再生会受限于必须維持某一群体密度。
[0006]迄今，并未描述过ー种用于再生单ー转基因细胞/原生质体或用于自其(特别是在流式细胞分选之后)再生完整可育性植株的可靠且可再现的エ序。
【发明内容】
[0007]因此，本发明主要是涉及提供ー种以植物为基础的系统，其利用由植物细胞的异质性(混合型)群体(诸如悬浮培养物)产生的未转化或转基因的单克隆植物细胞系，以产生高水平的所期望的天然或重组产物，并且克服现有技术的问题，尤其是关于快速分离以及接下来再生単一(转基因)原生质体，直到形成可用来建立单克隆植物细胞系的小集落(microcolony),所述单克隆植物细胞系优选能够生产并积聚大量的期望产物。对于本领域技术人员而言清楚的是，本发明同样提供由已建立的单克隆植物细胞系再生而来的完整可育性植株。
[0008]相对于许多目前使用及开发的基于使用完整植株或至少完整并已分化的植物组织的系统，使用悬浮 细胞的优势在于，同源性材料在受控、无菌与所限制的条件下可再现地生产。
[0009]在植物中，目前有两种主要的生产重组蛋白质的策略，即:(i)产生稳定的转基因植物或悬浮细胞系；或(ii)在用细菌(例如土壤杆菌)、病毒(例如烟草镶嵌病毒、马铃薯病毒X/Y、豇豆花叶病毒与许多其他病毒)或两者组合(例如优化的侵染(magnifection))侵染植物表达宿主(植物、组织或细胞)，使得宿主能够表达异种遗传信息(DNA或RNA)后，异质性基因瞬时表达。另外且为本领域技术人员所公知，基因信息亦可通过已建立的机械方法(例如电穿孔或激光打孔)而引入植物表达宿主。
[0010]尽管本发明优选涉及被稳定转化的植物细胞材料的应用，但是本发明方法中也可以涉及用于瞬时表达的系统，其具有快速优势(基因产物、上市时间、紧急反应)以及达到比稳定转化的转基因植物或其部分(诸如细胞)高得多的积聚水平的可能性。
[0011]依据本发明，提供ー种由植物细胞的异质性群体产生天然(野生型、非转化)或转基因单克隆植物细胞系的方法。该方法包括:首先提供该植物细胞群，例如形成源植物细胞(source plant cell)材料的植物悬浮细胞,所述源植物细胞材料可进行如本发明的方法所包括的后续步骤。通常，此植物细胞材料可容易地来源于例如异质性植物悬浮培养物，该培养物优选在受控及/或无菌条件下培养。源细胞可以是(稳定地/瞬时地)转化的转基因细胞或野生型(天然、未经转化)细胞，其能够生产并积聚期望产物。
[0012]由于本发明方法使用流式细胞分选(诸如FACS技术)来分离或离析单ー的、即个体化的原生质体，这些原生质体必须使用本领域已知的材料与方法由上面提供的植物细胞群制备。依据优选实施例，这些原生质体经转化且能够:(i)生产荧光标记蛋白质或多肽；(ii)生产期望产物；以及/或者(iii)在筛选剂存在的情况下存活。流式细胞分选的优选分选标准是作为如定性特征(例如细胞凋亡)的标记的细胞颗粒度与细胞大小。FACS的优选分选标准可以选自 包含遗传背景(例如倍性、非整倍性)、突变转基因(mutantstransgenics)、基因互换产物(gene exchange products)与突光(例如自发突光(叶绿体、代谢物)、荧光蛋白质或酶介导的荧光)的组。应了解，使用筛选剂不是必需的。因此，原生质体不是必需地被赋予适当抗性的核酸序列转化。
[0013]在利用流式细胞分选(诸如FACS)分离或离析单(转化)原生质体后，通过在饲养细胞材料存在情况下进行共培养，从而再生各个单ー的被转化的原生质体，直到形成小集落(小愈伤组织)。植物源的来源并未受到限制，但局限于原生质体具有再生直到形成小集落或小愈伤组织的潜力的细胞系、植物品种与物种。因此，本发明可应用于所有再生体系(regeneration protocol)已建立或将在未来提供的植物品种与物种。关于本发明涉及的将单克隆小集落或植物细胞系进ー步再生为完整可育性植株的特征，应了解此特征可在所有再生系统已建立或将在未来提供的植物品种与物种中进行。
[0014]之后，从饲养细胞材料中分离或转移小集落，并对该小集落进行培养，直到形成单克隆植物细胞系。
[0015]依据优选实施例，本发明方法所包括的下一个步骤关于通过如下步骤产生单克隆愈伤组织:(i )将小集落或小愈伤组织转移至固体培育培养基；以及(ii )在至少ー筛选剂存在情况下培养小集落或小愈伤组织直到形成转基因愈伤组织，通过将愈伤组织转移至液体培养基，能够由该转基因愈伤组织建立转基因单克隆植物细胞系。如本领域本领域技术人员所知，小集落亦可通过机械方法(诸如通过克隆挑取)从饲养细胞材料转移或分离。在此情况下，不需要筛选剂且由小集落所包含的细胞不需要显示出对任何筛选剂的抗性。
[0016]依据优选实施例，植物细胞的异质性群体所包含的细胞是天然(例如野生型)或非转基因细胞，这些细胞在进行流式细胞分选之前被至少一种含有至少一个异种核酸序列(可操作地连接至功能性启动子)的表达载体稳定地或瞬时地进行转化，其中该至少一个异种核酸序列编码期望产物。依据进一步的实施例，该至少一种表达载体含有可操作地连接至一个或多个功能性启动子的至少两个异种核酸序列，其中该至少两个异种核酸序列编码荧光标记蛋白质或多肽以及对筛选剂的抗性或期望产物。若需要的话，上述细胞还可包含编码如本发明所提供的转基因单克隆植物细胞系中积聚的期望产物的异种核酸序列。
[0017]这里使用的术语“异种”表示，所述的基因/核苷酸序列已通过使用基因工程(亦即通过人为干预)引入植物细胞。为实现本发明的目的，核苷酸的异种序列可包括由融合伴侣(fusion partner)所组成的融合蛋白的编码序列，该融合蛋白例如可部分地由可融合至非植物蛋白的植物蛋白形成，所述融合蛋白可以被称为杂交的植物:非植物融合蛋白。可选地，融合蛋白可以是由非植物源的融合伴侣所形成。异种基因可提高内源性等效基因(endogenous equivalent gene)对感兴趣的蛋白质的表达,该内源性等效基因一般表现相同或类似的功能，或者其插入序列是内源性基因之外的序列或其他序列。细胞的核酸异种可以非天然地发生于所培养的细胞型、品种或物种中。因此，异种核酸可包括特定类型生物体或从其衍生的编码序列，特定类型生物体为诸如植物或哺乳动物物种，例如人类、绵羊、牛、马或猪物种，所述异种核酸位于所培养的细胞(诸如衍生自烟草的BY2细胞)中。另一可能性为位于所培养的目标细胞内的核酸序列在所培养的目标细胞中，异质性核酸或其或其同源物是天然存在，但其中所述核酸序列连接及/或相邻于在该类型、物种或品种的植物的细胞内非天然存在的核酸，该非天然存在的核酸诸如可操作地连接至一或多个调控序列(例如启动子序列)以控制表达。此外，亦可使用合成(人工)核酸序列。
[0018]“载体”定义为，除了其他以外，特别包括任意的双链或单链、线形或环状形式的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，其可以是或不是可自身传递(transmissible)或移动，且其可转化原核生物或真核生物宿主并存在于染色体以外(例如具有复制原点的自发复制质粒)。特别包括穿梭载体，其表示一种能够天然地或通过设计在两种不同宿主生物中复制的DNA媒介物，其可选自于放线菌及相关物种、细菌以及真核生物(例如高等植物、藓、哺乳动物、酵母菌或真菌)细胞。
[0019]“表达载体”是指一种载体，在其中，核酸受控于并可操作地连接至适当启动子或其他调控要素以供在宿主细胞(诸如微生物或植物细胞)中的转录。载体可以是双功能性表达载体，其在多种宿主中发挥作用。在基因组或亚基因组DNA的情况下，可含有其自身的启动子或其他调控要素，而在cDNA的情况下，可受控于适当启动子或其他调控要素以供在宿主细胞中的表达。
[0020]“启动子”是一种核苷酸序列，可以从其开始可操作地连接于下游的DNA (亦即在双链DNA的有义链的3’方向)的转录。
[0021]“可操作地连接”是指作为同一核酸分子的一部分被连接，适当定位，并确定从启动子开始转录的方向。
[0022]术语“诱导型”当应用于启动子时应为本领域技术人员所充分了解。实质上，在诱导型的启动子控制下的表达是响应于施加的刺激而“开始”或增加。刺激的性质会随着启动子而不同。在不存在适当刺激的情况下，一些诱导型启动子产生微小或无法检测到的表达水平(或无表达)。在不存在刺激的情况下，其他诱导型的启动子会产生可检测到的基本表达。在不存在刺激的情况下不论表达水平如何，任何诱导型启动子的表达在存在正确刺激的情况下都会増加。
[0023]本发明亦包含任何此等序列的变异体的用途。变异体蛋白质与上述序列的全部或部分具有同源性、或相同。
[0024]为了重组蛋白质的表达，将含有感兴趣蛋白质的基因信息的重组土壤杆菌或病毒(载体)的悬浮物以本领域公知的方式施用于上述植物悬浮细胞。载体侵染植物细胞并且传递基因信息。优选地，待转化的植物细胞材料是以高密度并仅有少量培养基存在的方式提供，使得载体悬浮物可以仅通过滴落或喷洒而施用。这个转化的优选实施例在操作、自动化、控制(containment)、倍增以及废料和转移方面有多个实用性优势。可选地,可使用本领域中公知的已知技术，诸如粒子轰击、电穿孔等类似技木。
[0025]适当的启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)。启动子可选定具有赋予发育表达以及/或者组织特异性调控表达的ー个或多个序列基元(sequence motif)或要素。
[0026]如已提及的，该至少ー个可选择的基因标记物(可以是期望要制造的)可包括在构建体中或在第二构建体中被提供，诸如赋予可选择的显型基因标记物(诸如对抗生素或除草剂(包括但不限于例如卡那霉素、潮霉素、草丁膦(phosphinotricin)、氯磺隆、氨甲叶酸、庆大霉素、奇霉素、咪唑啉酮与草甘膦)的抗性)。
[0027]另外，用于制备原生质体的植物悬浮细胞亦可由已转基因的异质性植物悬浮培养物(含有转基因细胞)所提供。
[0028]依据本发明所建立的(转基因)单克隆植物细胞系可在下述条件下进行处理或培养以生产重组蛋白或代谢物，所述条件为，除了载体悬浮物以外或取代载体悬浮物，还存在前体、诱导物、激素、稳定剂(例如相容性溶质)、抑制剂、RNAi/siRNA分子、信号传导化合物(signaling compound)、酶(例如果胶酶)、及/或激发子。
[0029]依据优选实施例，期望产物是选自由异种蛋白质或多肽(例如，血液产物、细胞因子、生长激素、治疗性/诊断性/エ业用酶、疫苗、完整抗体(full-size antibody)或各种抗体衍生物)、次级代谢产物(例如苯丙素、生物碱、萜类、醌类或类固醇)及用于气体、固体或液体(化学)化合物与物质的诊断或分析的标记物所组成的组。
[0030]感兴趣基因包括编码本身是天然药品的蛋白质的基因，所述天然药品诸如为药物或兽医用产品。此外，感兴趣基因亦包括任何其他重组蛋白质，诸如エ艺酶(technicalenzyme)、毒素或赋予新的农艺投入产出性状(agronomic input and output trait)的重组蛋白质。
[0031]异种核酸特别可以使细菌、真菌、植物或非植物源(诸如上文略有提到的融合蛋白)或动物源的基因编码。所生产的多肽可用于生产可自其中纯化以供其他用途的多肽。可在本发明方法中生产的蛋白质包括异源二聚体，诸如FSH、免疫球蛋白、融合抗体与单链抗体。此外，可改变上面的基因以生产具有特性发生改变的蛋白质，诸如被改变的glycane结构。但是，本发明还允许使用合成基因，诸如自然界中不存在的人工序列。
[0032]此等蛋白质包括但不限于:视网膜母细胞瘤蛋白质、P53、血管生成抑制素(angiostatin)及瘦素(leptin)。同样地,本发明方法可用于生产哺乳动物调节性蛋白质。其他感兴趣的序列包括蛋白质、激素(诸如促卵泡激素)、生长因子、细胞因子、血清白蛋白、血红素、股原蛋白、奇甜蛋白(thaumatin)、奇甜蛋白样蛋白质、表皮生长因子(诸如VEGF) 等。[0033]如本领域技术人员所知，本发明能够生产多样化蛋白质及多肽，包括与药剂相关的(重组)蛋白质(诸如疫苗、抗体、治疗性酶、过敏原与低过敏原、抗微生物肽、结构蛋白质(诸如作为生物相容性涂覆材料的弹力蛋白与胶原蛋白)、病毒样颗粒、蛋白粒等)、具有营养价值的(重组)蛋白质(食品与饲料添加物)、用于诊断用途的(重组)蛋白质(诸如酶、抗体与工程抗体、其他酶或荧光融合蛋白、用作为阳性对照的抗原、用于蛋白质阵列的结合配体)、与工艺相关的(重组)蛋白质(诸如用于亲和吸附剂的结合配体、高价值酶、生物催化剂)、以及增进农艺投入产出性状的重组蛋白质。
[0034]一般而言，异种核酸可以通过本领域中所用的任何适当方法被表达，或它们可如下转录或表达:
[0035](i)例如含有可操作地连接至感兴趣异种序列的启动子的“裸”DNA的瞬时表达，
[0036](ii)表达载体(诸如复制载体)的表达。一般而言,本领域本领域技术人员能够妥善构建载体并设计用于瞬时重组基因表达的实验。可选择或构建含有适当调控序列的适当载体，所述调控序列包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因与合适的其他序列。关于更多细节参见，例如Molecular Cloning:a LaboratoryManual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al, eds., Johnffiley&Sons, 1992。
[0037](iii)非整合载体的表达。
[0038]应了解的是，上述各类别并不互不包含，例如因为非整合载体亦可以是表达载体
坐寸ο
[0039]如本领域技术人员所知，编码荧光标记蛋白质或多肽或编码生产荧光分子的酶和编码感兴趣的异质性蛋白质(期望产物)的至少两个异种核酸序列可以下列形式提供:(i)由同一载体上的单一表达盒所构成的多顺反子构型；(ii)具有同一载体上的至少两个不同表达盒的串接构型(tandem configuration);或(:[;[；0不同载体上的至少两个不同表达盒，其中串接构型为优选。
[0040]因此，依据又一个方面，本发明亦提供一种生产至少一种期望产物的方法，该至少一种期望产物优选地是选自由异种蛋白质或多肽、次级代谢产物与标记物所组成的组。该方法包含使用如依据本发明建立的(转基因)单克隆植物细胞系来生产并积聚至少一种期望产物，然后从生产细胞或从培养基获得或分离该期望产物。
[0041]因此，在本发明的一个方面中，公开了能够产生编码期望产物的mRNA的优选稳定转化的单克隆植物细胞系的用途，所述期望产物诸如是通过由引入的核酸构建体转录而产生的异种目标蛋白质，该核酸构建体包括可操作地连接至启动子的目标核苷酸序列。
[0042]因此，“引入的核酸”包括以构建体形式提供的异种核酸序列作为DNA序列，所述异种核酸序列能够产生并累积期望产物。
[0043]因此，在本发明的一个优选方面中，公开一种在单克隆植物细胞系中异种核苷酸序列达到稳定表达的方法，该方法包括将至少一种第一核酸序列稳定地引入目标细胞的步骤，该第一核酸序列含有编码期望产物的异种核苷酸序列。[0044]在一个实施例中，提供一种产生至少ー种细胞外异种蛋白质的方法，该方法包括以下步骤:[0045](i)将包括编码异种蛋白质或期望产物的核苷酸序列的第一核酸稳定引入至由起始的植物细胞群体所组成的目标细胞中；[0046](ii)由该植物悬浮培养提供的植物悬浮细胞制备原生质体，其中该原生质体被转化且能够:(a)生产荧光标记蛋白质或多肽；以及(b)在筛选剂存在的情况下存活；[0047](iii)通过将原生质体制备物进行FACS而分离单ー转化原生质体；[0048](iv)在饲养细胞材料存在的情况下，通过共培养而再生分离的单ー转化原生质体，直到形成小集落或小愈伤组织；[0049](V)通过(a)将小集落或小愈伤组织转移至固体培养基、与(b)在至少ー种筛选剂存在的情况下培养小集落或小愈伤组织直到形成转基因愈伤组织，从而产生单克隆愈伤组织；[0050](vi)通过将愈伤组织转移至液体培养基而建立转基因单克隆植物细胞系；以及[0051](Vii)通过提供适当培养条件而引起或容许由异种蛋白质或期望产物的核酸进行表达，以及[0052](viii)自生产细胞收取积聚的异种蛋白质或期望产物。[0053]可通过完全传统的方法进行分离，并且可以部分或完全纯化，或者可以不必部分或完全纯化。[0054]当然，本领域技术人员将认知到，在所述构建体或各构建体中可使用ー个以上基因。可以将多个载体(各载体包括一个或多个编码所选异种蛋白质的核苷酸序列)引入如这里或他处所述的目标细胞中。例如,这对于生产例如酶的多个亚单元是有益的。[0055]荧光标记蛋白质或多肽可以是任何可通过荧光检测到的蛋白质，诸如GUS、荧光蛋白质(诸如GFP或DsRed)、荧光素酶等。优选地，报导子(reporter)为非侵入性标记，诸如DsRed 或 GFP。[0056]依据另ー个方面，本发明提供一种通过细胞分选鉴别高表达插入位点的方法，其包括以下步骤:利用含有荧光蛋白质I的构建体转化细胞的步骤(例如，如下面实施例1B中所迷);以及通过FACS鉴别并分离单一高荧光蛋白质I生产细胞的步骤，该步骤包括再生直至形成小集落和悬浮培养以及例如与荧光蛋白质2基因互換，鉴别与分开罕见基因互换产物的步骤。[0057]现将參考下列非限制性的附图与实施例来进ー步说明本发明。本发明的其他具体例会因为这些实施例而被本领域技术人员所想到。
【专利附图】
【附图说明】[0058]图1为示意图，其说明用于制备如本文所述的转基因MTED BY-2系的表达盒(expression cassette)的结构。具体而言，图1说明用于转化BY-2悬浮细胞的pTRAkc::MTED植物表达载体的T-DNA。[0059]LB与RB =T-DNA的左边界与右边界；Pnos与pAnos:胭脂碱合成酶基因(nopalinesynthase gene)的启动子与终止子；nptll:新霉素磷酸转移酶基因的编码序列；SAR:核骨架附着区；P35SS与pA35S:花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S基因的具有两个增强子的启动子与终止子；CHS:香芹的查尔酮合酶的5’-UTR ；SP:信号肽；HC与LC:M12抗体的重链与轻链的编码序列:TL:烟草蚀纹病毒(TEV)的5，-UTR ；TP:转运肽；DsRed:珊瑚(Discosoma spec)的红色突光蛋白质的编码序列。
【具体实施方式】
[0060]实施例1
[0061]在转化后快速产生生产良好的单克隆细胞系[0062]A.烟草细胞培养
[0063]在100ml玻璃维形瓶中加入50ml试样、即烟草BY2 (Nicotiana tabacumcv.Bright Yellow2)的野生型悬浮培养物,将其维持在26°C的黑暗、无菌条件下，以180rpm进行恒定轨道搅拌。培养基含有基础MSMO培养基(pH5.8)，并补充有蔗糖(3%，w/v)以及lmg/12, 4- 二氯苯氧こ酸。以7天为间隔通过将5% (v/v)细胞转移至50ml新鮮培养基而完成继代培养。
[0064]关于原生质体制备,通过将2% (v/v)转移至50ml新鲜培养基来对悬浮细胞培养物进行继代培养。
[0065]B.加速产生转基因结果(event)以供后续分选
[0066]如A部分中所述培养BY-2野生型悬浮细胞。同时，在轨道振动器(orbitalshaker)上以160rpm与27°C的条件，将带有在同一载体上含数个表达盒(參见图1)的构建体的转基因根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)在含有适当抗生素的YEB培养基(0.5%营养肉汤、0.1%酵母菌萃取物、0.5%蛋白胨、0.5%蔗糖、2mM MgS04,pH7.4)中培养，直至OD6tltol为I。继代培养后3天，在黑暗中将3ml BY-2野生型细胞、200nMこ酰丁香酮以及150 ill 土壤杆菌(OD6tltlnm=I洪培养于皮氏培养皿中。在室温下共培养3天后，将BY-2细胞再悬浮于补充有200mg/l头孢霉素的IOml的BY-2培养基中。将细胞转移至50ml无菌试管中并通过离心法洗涤2次(850g，5分钟)，以除去土壌杆菌。再悬浮细胞团后，使用补充有头孢霉素与适当筛选剂的20-50ml BY-2培养基，在100ml摇瓶中进行被转化的BY-2细胞的培养(180rpm，26°C)。在适当悬浮物(细胞压积约为50-60%)再生后，将细胞进行继代培养以供制备原生质体(參见C部分)。本方法需要14至21天以建立转基因悬浮培养物，该培养物可用于随后产生原生质体(C)以及流式细胞分选(D)。
[0067]C.原牛质体制各以及细朐壁再牛
[0068]在继代培养3天后，使用活跃生长的细胞培养物，通过在无菌锥形塑料离心管中以850g离心5分钟来沉淀细胞。除去上清液并将细胞再悬浮于含有1% (w/v)纤维素酶与
0.3% (w/v)离析酶的 IOml PNT 消化溶液(3.6g/1Kao Michayluk 基础盐(Duchefa)、0.4M蔗糖、0.5mg/l NAAUmg/1 BAP)中。将细胞-酶悬浮物置于6cm皮式培养皿中，以胶带密封。在26°C下于黑暗中以轻柔搅拌进行彻夜消化(16-18小时)。将原生质体滤过100-1im尼龙网井随后在离心(104g持续8分钟)过程中漂浮至表面。除去团块与培养基的界面并以PNT溶液洗涤原生质体2次。将原生质体再悬浮于W5溶液(154mM NaCl、125mM CaCl2,5mM KCl、5mM葡萄糖，pH5.6)中，通过以76g离心2分钟沉淀原生质体。轻柔地使其再悬浮后，将原生质体培养在经改良的再生培养基8p2c (參见下表1 ;从8p培养基优化而来)中。所述步骤的结果通常为每毫升7xl05个原生质体，平均74%的比例为有活力的原生质体。
[0069]在26°C下于黑暗中使原生质体再生3天，开始再生细胞壁。将所得的原生质体再次通过100-μπι尼龙网，然后转移至无菌样品导引试管，进行FAC分选。单一原生质体被分选至含有非转基因野生型饲养原生质体或细胞的96孔微量滴定板的各孔中(参见D部分)。
[0070]使用菲斯-罗森塔儿(Fuchs-Rosenthal)型计数板将用作饲养原生质体的ΒΥ-2野生型原生质体调整至约2χ103细胞/ml8p2c培养基。将50微升上述原生质体转移至96孔微量滴定板的各孔中，以使得约100个野生型饲养原生质体转移至各孔中。
[0071]表1:8p2c培养基的组分(ρΗ5.6)
[0072]-Kao&Michayluk 基础盐混合物(Duchefa)
[0073]-Kao&Michayluk 维生素溶液(Sigma)
[0074]0.02mg/l对氨基苯酸
[0075]2mg/l L-抗坏血酸
[0076]0.0 Img/1 生物素
[0077]lmg/1 D-泛酸钙
[0078]lmg/1氯化胆碱
[0079]0.4mg/l 叶酸
[0080]IOOmg/1 肌醇
[0081]lmg/1 烟酰胺
[0082]lmg/1盐酸维生素B6
[0083]0.2mg/l 核黄素
[0084]lmg/1盐酸硫胺素
[0085]0.0 lmg/1 维生素 A
[0086]0.02mg/l 维生素 B12
[0087]0.0 lmg/1 维生素 D
[0088]-有机酸(使用NH4OH, ρΗ5.5 )
[0089]20mg/l丙酮酸钠
[0090]40mg/l 苹果酸
[0091]40mg/l 柠檬酸
[0092]40mg/l延胡索酸
[0093]-糖与糖醇
[0094]0.25g/l 蔗糖
[0095] 250mg/l 甘露糖
[0096]68.4g/l 葡萄糖
[0097]250mg/l 鼠李糖
[0098]250mg/l 果糖
[0099]250mg/l 纤维二糖
[0100]250mg/l 核糖
[0101]250mg/l 山梨糖醇
[0102]250mg/l 木糖[0103]250mg/l 甘露醇
[0104]-激素
[0105]0.2mg/12.4_D
[0106]0.5mg/l 玉米素
[0107]1.0mg/1 NAA
[0108]-2% (v/v)椰子汁
[0109]_500mg/l酪蛋白氨基酸
[0110]D.流式细胞分析与分选
[0111]使用具有488nm/635nm 気离子激光的 FACS Vantage (DIVA option, BDBioscience)仪器分选转基因植物原生质体。鞘液，即磷酸盐缓冲溶液(PBS pH7.4)经高压蒸气灭菌，并通过0.22 y m过滤器，从而进行灭菌。在分选之前，通过无菌鞘液的传代(passage)来清除样品管的残余こ醇。细胞计数系统/分选设定是使用商业标准的自发荧光校正粒子来校准。流式细胞分选仪在488nm下操作，并且具有175mW的激光输出。在分选之前，为了定义强烈荧光的群体，电子分选窗基于所收集的原生质体培养物样品的前向散射光、侧向散射光与荧光信号来定位。使用DIVA软件(BD Bioscience)将信号显示为点状图。分选区是通过建立门(gate)来进行限定，第一个门围绕有活力的原生质体的群体，第二个门依据第一个门而围绕强烈荧光的原生质体。分选是使用4-6psi的系统鞘压(systemsheath pressure)、约7kHz的降频以及约1.000事件数/秒(events/sec)的样品流量,通过200 ii m的流动尖端(flow tip)来进行。
[0112]使用所描述的分选參数，可达到约20%的平板效率(plating efficientcy)(即，20%的孔含有完整及有活力的单一分选的原生质体)。
[0113]E.通过与看护/饲养原生质体共培养再生单一分选的原生质体
[0114]在分选高荧光単一原生质体之前，将96孔微量滴定板的各孔填充含有约100个烟草BY-2野生型原生质体作为饲养细胞的50 Ul无菌8p2c再生培养基。通过倒立式荧光显微镜在不同时间点分析单一分选的转基因原生质体，以在分选步骤之后确认单ー细胞沉积以及监控转基因原生质体的増殖与小集落形成(分选14至20天后)。分选的原生质体在96孔板中以26°C至27°C在黑暗中培养，将96孔板以无菌盖阖上并使用胶带密封。
[0115]接着，将转基因小集落转移至含有抗生素筛选标记(例如卡那霉素)的固体再生培养基(0.8% (w/v)琼脂)。因此，通过吸移来轻柔地再悬浮存在于孔中的含有饲养细胞的小愈伤组织，并且使用具有宽吸管端的吸管转移。其后，通过倒立式荧光显微镜分析孔以及固体再生培养基上的经转移的小愈伤组织，以确认成功转移转基因与荧光小集落。在转移之后，使转基因小愈伤组织生长14至20天，并转移至含有固体再生培养基(具有筛选标记)的新鮮板。具有直径大小约2cm的愈伤组织通过将细胞材料转移至50ml塑料组织培养烧瓶中的5ml培养基而被用于建立悬浮培养物(A部分中所述)。如A部分中所述对这些烧瓶进行培养，直到细胞悬浮物生长至细胞压积约为50至60%，以供转移至100ml锥形瓶内。如A部分中所述进行转基因单克隆悬浮培养物的培养。
[0116]所述饲养细胞策略容许约50%最初分选的完整且有活力的单一原生质体再生(即，约10%被分选至96孔微量滴定板的孔中的単一原生质体发育成小愈伤组织)。
[0117]F.确认在经分选的単一原生质体再生期间成功排除饲养细胞存活[0118]已开一种发能够将单一的FACS选择的原生质体可靠地再生成单克隆悬浮培养物的工序。因为单一原生质体必须在分选之后进行再生，所以，需要饲养细胞支持经筛选的单一原生质体的再生与增殖。由于饲养原生质体暂时与经分选的突光目标原生质体共培养，故在单克隆培养物再生期间强制排除饲养原生质体的存活。
[0119]已研究过单一经分选的转基因BY-2细胞及荧光BY-2细胞因为饲养原生质体的潜在污染。已使用含有GFP-KDEL表达盒以及AHAS筛选标记(赋予咪唑乙烟酸抗性)的构建体转化转基因细胞。经此构建体转化并生产GFP的单一 BY-2原生质体被分选至含有转基因细胞系的原生质体的96孔板，其中，转基因细胞系含有DsRed表达盒与nptll筛选标记(赋予卡那霉素抗性)。在第二个实验中，经DsRed表达盒与nptll筛选标记转化的单一 BY-2原生质体被分选至含有生产GFP的转基因细胞系的原生质体的96孔板中。再生后，针对对抗咪唑乙烟酸或卡那霉素的抗性及其荧光(绿色对红色)，分析所得到的GFP及DsRed荧光培养物。由两种方法而来的愈伤组织在含有1.5 μ m咪唑乙烟酸或100mg/L卡那霉素的筛选培养基上平板接种。培养14天后以视觉评价细胞生长。所有的被测试的愈伤组织(总计20个)特定生长在含有其特定筛选剂的培养盘上。简言之，经GFP/AHAS转化的愈伤组织生长在含咪唑乙烟酸而非含卡那霉素的板上，而经DsRed/卡那霉素转化的愈伤组织仅生长在卡那霉素板上。这个观察结果清楚地证明再生的转基因细胞系未受到个别饲养细胞系污染。饲养细胞的潜在污染另外由流式细胞分析来评价。针对分别由荧光蛋白质GFP或DsRed所产生的光学特性，分析再生的GFP及DsRed悬浮培养物。这个观察结果清楚地证明再生的转基因细胞系未因为个别饲养细胞系而污染。所有测试的BY-2培养物显示特定的预期荧光形态(pattern)。分选GFP转化的细胞后所建立的培养物仅显示绿色荧光，而生产DsRed的培养物仅检测到红色荧光波段。在饲养细胞污染的情况下，预期在两个波段中有荧光信号。细胞分析结果确认如先前抗性试验所证实的有效率地移除筛选板上的饲养细胞。
[0120]G.分析单克隆转基因悬浮培养物
[0121]首先分析单克隆悬浮培养物的高度荧光细胞的百分比。因此，如C部分中所述制备原生质体。关于荧光原生质体部分的流式细胞测定，使用FACSCalibur仪器(BDBioscience)。依据BY_2 野生型原生质体，调整设定参数(例如光线与荧光散射放大器的放大倍率)并测量样品。在圈选有活力群体后，使用此群体在荧光波段中的分布来设定阈值，其排除所有由野生型自发荧光所造成的背景信号。根据这个阈值，计算出来源于单一原生质体的改良原生质体培养物中荧光原生质体的百分比。生产重组DsRed蛋白质的单克隆悬浮培养物的流式细胞分析显示出具有类似且强烈的荧光强度(窄荧光峰)的同源分布的细胞。DsRed荧光细胞部分的计算结果为百分比介于78-88%的强荧光细胞。
[0122]重组蛋白质的积聚水平可通过不同方法(例如酶联免疫吸附法(ELISA))来测定。因此，将细胞离心(850g，5分钟)、再悬浮于3倍体积萃取缓冲液(PBS pH6，5mM2_巯基乙醇、5mM EDTA、IOmM抗坏血酸)并由超音波破坏。透过另一个离心步骤(20分钟，16000g)由细胞碎片分离萃取物并用于分析。对在5dpi由pTRAkc:MTED转化的悬浮培养物的细胞萃取物中积聚的M12抗体进行免疫学分析，显示积聚至118±20μ g/g鲜重(高出使用传统产生方法(即愈伤组织产生与筛选)1.5倍)。
[0123]实施例2
[0124]从异质性转基因悬浮培养物产生单克隆细胞系[0125]A.烟草细胞培养物
[0126]在100ml玻璃锥形瓶中加入50ml生产ER延迟人类完全IgGl(ER_retarded humanfull-size IgGl)抗体M12及指向荧光蛋白质DsRed的质粒的转基因烟草BY-2悬浮培养物MTED#18，维持在无菌、26°C下的黑暗条件下，并使用180rpm的恒定轨道搅拌。在控制的相同条件下培养BY-2野生型细胞。培养基含有pH5.8的基础MSMO培养基，并补充有蔗糖(3%,w/v)以及lmg/12, 4- 二氯苯氧こ酸。以7天间为_通过将5% (v/v)细胞转移至50ml新鮮培养基而完成继代培养。
[0127]通过由土壤杆菌介导转化的烟草BY-2细胞产生转基因悬浮培养物，接着进行基于抗生素的筛选以及随后分离转化的愈伤组织。通过免疫学分析(DotblotlELISA)依据愈伤组织的抗体生产来筛选愈伤组织，而最佳候选者用于悬浮培养物的建立(=细胞系MTED#18)。MTED#18母培养物的特定M12抗体生产为13 μg/g细胞鲜重(10mg/L)。流式细胞分析掲示，转基因培养物由两个亚群体所组成，所述两个亚群体仅有24%用于生产荧光标记蛋白质DsRed的有活力的群体。
[0128]关于原生质体制备,通过将2% (v/v)转移至50ml新鲜培养基来对悬浮细胞培养物进行继代培养。
[0129]B.原牛质体制各及细朐壁再牛
[0130]參见实施例1，C部分。
[0131]通常，所述エ序的结果为每毫升产生5x10s个原生质体，平均具有62.2%的有活力的转基因原生质体。
[0132]C.流式细胞分析与分选
[0133]如实施例1，D部分中所述完成仪器设定以及预先安排。
[0134]以单细胞模式将单ー强烈荧光的植物原生质体(全部所分选的原生质体的1-2%)分选至细胞沉积装置(亦即微量滴定板)中。每孔I个原生质体，与第二次圈选标准相同，分选至96孔微量滴定板中，其中填充含有约100个野生型原生质体作为饲养细胞的50 ill无菌8p2c再生培养基。将96孔板以无菌盖阖上并使用胶带密封。回收原生质体的确切数目由倒立式荧光显微镜測定。单细胞模式下的原生质体的流式细胞分选结果是，平板效率为约20%的孔每孔含有I个完整且有活力的原生质体。
[0135]D.以低密度再生经分选的原生质体
[0136]单一分选原生质体的再生按照如实施例1，E部分中所述进行。
[0137]单细胞模式下的高荧光原生质体的流式细胞分选结果是，约20%的孔含有仅I个分选的原生质体。这些单一原生质体的50%开始增殖且可用于建立悬浮培养物。
[0138]E.分析单克隆转基因悬浮培养物
[0139]为测定衍生自単一原生质体的改良悬浮培养物中荧光原生质体的百分比，如先前所述进行流式细胞分析(实施例1，D部分)。M12抗体积聚水平是通过酶联免疫吸附法(ELISA)来測定。因此，将悬浮细胞离心(850g，5分钟)、再悬浮于3倍体积的萃取缓冲液(PBS pH6，5mM2-巯基こ醇、5mM EDTA、IOmM抗坏血酸)并通过超音波破坏。通过离心步骤(20分钟，16000g)由细胞碎片分离萃取物并用于分析。由于所选的设定(Fe捕获及LC检測)的原因，仅能检测到完全组装的抗体。
[0140]在1轮FACS后，单克隆悬浮培养物显示两个重组蛋白质的积聚水平明显提高，所述两个重组蛋白质为:与母悬浮培养物相比具有3.7倍富集百分比的DsRed荧光细胞(90%);与母悬浮培养物相比增加11倍的M12抗体(145 μ g/g鲜重或以mg/L水平为9.3倍(93mg/L))。
[0141]F.重复悬浮培养物改良
[0142]为了进一步增进并稳定转基因单克隆悬浮培养物的重组蛋白质生产率，可重复步骤B至E。应用先前所述的相同条件产生、分选以及再生原生质体。
[0143]第2轮分选使得抗体积聚更为增加:182 μ g/g鲜重或113mg/L，相较于母培养物增加14倍与11.3倍。
[0144]最佳生产第2代单克隆的第三轮分选得到第三代单克隆培养物，其产生类似的积聚水平，这显示达到最大水平。[0145]G.优异生产单克隆培养物就目标蛋白质生产率方面的稳定性
[0146]由FACS得到的单克隆细胞系的稳定性例如针对3个单株来进行研究。以7天为周期继代培养单克隆细胞系(参见实施例1，A部分)，同时以2个月为间隔在每当继代培养后的第5天测定两种重组目标蛋白质。就第I代单克隆培养物而言，已证明在12个月期间这些培养物仍然生产高且稳定数量的M12抗体/g鲜重。仅在双月取样间隔观察到抗体水平略有变化(由细胞培养改变所致)。
[0147]第2代单克隆的分析显示，与其所来源的第一代单株培养物相比，两种重组蛋白质M12抗体有类似或略为增加的积聚水平，由此证明细胞系稳定性。在所有被分析的第2代单克隆培养物中显示，相较于第一代单克隆培养物，目标蛋白质生产更为稳定(在双月取样间隔的变异较少)。在12个月期间，3个被分析的单株培养物中的两者被发现，DsRed荧光细胞在总群体中的百分比以及M12抗体积聚皆为高度稳定。
【权利要求】
1.ー种由植物细胞的异种群体产生单克隆植物细胞系的方法，其包含下列步骤: (a)提供植物细胞的异种群体； (b)由该植物细胞的异种群体制备原生质体； (c)通过将原生质体制备物进行流式细胞分选而分离单一原生质体； (d)在饲养细胞材料存在的情况下，通过共培养对被分离的单ー转化原生质体进行再生，直到形成小集落；以及 (e)将小集落从饲养细胞材料中转移，并培养小集落直到形成单克隆植物细胞系。
2.如权利要求1所述的方法，进ー步包含使步骤(e)中所得到的单克隆植物细胞系再生，直至形成完整可育性植株。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(b)中所制备的原生质体被转化，并且能够:(i )生产荧光标记蛋白质或多肽；(i i )生产期望产物；以及/或者(i i i )在选择剂存在的情况下存活。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述期望产物选自由异种蛋白质或多肽、次级代谢产物及用于诊断或分析的标记物所构成的组。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(c)中的单一原生质体的分离通过将原生质体进行FACS。
6.ー种单克隆植物细胞系，其由执行如权利要求1至5项中任一项所述的方法而可获得或获得。·
7.一种完整可育性植株，其由执行如权利要求2至5项中任一项所述的方法而可获得或获得。
【文档编号】A01H4/00GK103596423SQ201180071503
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2011年6月7日 优先权日:2011年6月7日
【发明者】珍娜·基尔霍夫, 史蒂芬·雪勒伯格, 安德烈斯·席尔迈尔, 海尔格·辛克尔, 莱纳·费希尔 申请人:弗劳恩霍夫应用研究促进协会