专利名称：产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法
技术领域：
本发明涉及ー种植物生物技木，即离体诱导和増殖的培养方法，尤其涉及ー种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和増殖的培养方法。
背景技术：
Huperzia serrata(Thunb. ex Murray)Trev. , X^i =^B.^^Si^fk^ 蛇足草等，为石杉科石杉属蕨类植物，全草入药。自1972年国内首次报道该植物中的生物碱-石杉碱甲(hupenine A，Hup-A)具有横纹肌松驰作用，以后深入研究发现该生物碱是一种强效、可逆和高选择性乙酰胆碱酯酶抑制剂。在低剂量Hup-A下对乙酰胆碱酯酶(Ach E)有強大的抑制作用，使分布区内神经突触间隙的乙酰胆碱(Ach)含量明显升高，从而增强神经元兴奋传导，强化学习与记忆脑区的兴奋作用，起到提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用。是目前国内最为成功的治疗阿尔茨海默病(老年性痴呆症)的药物。石杉碱甲Hup-A药物主要来源于天然蛇足石杉全草，由于石杉碱甲的特殊疗效，国内外学者对它的全合成、衍生物及类似物的合成作了大量的工作，亦因Hup-A特殊的分子结构， 人工合成费时费力，代价高，至今几乎没有得到活性比天然Hup-A更好的衍生物和类似物， 因此人工合成的Hup-A及其类似物离商品化生产还有较长距离，随着老年化社会到来，阿尔茨海默病(老年性痴呆症)已成为人类的第四大病魔，直接导致国际市场上Hup-A的供应缺ロ越来越大，自然千层塔资源匮乏凸显。由于蛇足石杉等石杉科植物生长于深山密林，生境条件特殊，很难解决石杉科植物大面积的人工栽培。采取石杉科植物离体组织培养能开发石杉属植物中Hup-A资源，但因外植体消毒及其生长分化困难，目前国内外尚未突破其有效的技木。而蛇足石杉离体培养是开发其原植物快繁或生物技术生产天然石杉碱甲(Hup-A)资源的重要技术平台，必须首先建立有效的离体培养无性増殖体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和増殖的培养方法，该方法简单，便于大规模生产使用。本发明是这样实现的，方法步骤为(1. 1)材料蛇足石杉(Huperzia serrata (Thunb. ex Murray) Trev.,选择健壮无病虫害的庐山野生蛇足石杉植株，取当年抽生约3cm长的新枝；(1. 2)对外植体清洗消毒；(1. 3)外植体接种在叶状体分化启动培养基上培养至切ロ处出现緑色小凸点，继续在叶状体分化启动培养基上培养10 15天，緑色小凸点发育成可辨的叶状体组织，此时的叶状体组织迅速増殖；叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+NAA0. 1 1. Omg/L，蔗糖用量 20 30g/L ；(1. 4)将诱导増殖的叶状体组织分割成小块，每瓶45ml左右培养基接种1. Og
3至1. 5g，转接到叶状体继代增殖培养基上培养，叶状体继代增殖培养基6，7-V+NAA0. 1 1. 5mg/L 或 IΑΑ0. 1 1. Omg/L，蔗糖用量 20 30g/L ；(1. 5)叶状体分割继代；一小部分叶状体切割作继代小块，接种到继代増殖培养基上继代培养，以后每40 50天转代一次，每世代叶状体生物量鲜重比接种量增加8 13 倍，建成叶状体无性繁殖系；另一大部分叶状体收获可提取石杉碱甲。本发明方法所用的培养基如下(1)适用的基本培养基6，7-V，并蔗糖用量范围20 30g/L，(2)叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+NAA0. 1 1. Omg/L ；(3)叶状体继代增殖培养基6, 7-V+NAA0. 1 1. 5mg/L 或 IΑΑ0. 1 1. Omg/L ；以上培养基的pH值5. 8 6. 0、琼脂粉质量分数0. 6%，并在温度118 120°C暨压カ0. 8 1. 0公斤/平方厘米的高温高压下灭菌25min。本发明的培养条件如下(1)培养參数恒温对士2で，相対湿度60% 70%，光照强度为1000 15001x， 日照时长11 14h/d ；(2)技术參数外植体污染率低于10% 20%;叶状体诱导率50% 80%;每世代叶状体生物量鲜重比接种量增加8 13倍；继代周期40 50d ；本发明建立了生产石杉碱甲的蛇足石杉原植物再生叶状体组织的离体无性増殖系，该叶状体能生产积累石杉碱甲。本发明方法中对外植体消毒过程中用自来水洗去枝叶上的灰尘后，再用洗衣粉液浸泡6 lOmin，然后用软毛笔刷洗枝叶，自来水細流水中漂洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器；再以质量分数75%的乙醇消毒0. 5min--lmin，无菌水洗浄，吸干水后，再以质量分数0. 0. 5% HgCl2加1滴吐温80浸泡消毒材料6 lOmin，倾去药液后，用无菌水冲洗6-8次。本发明的技术效果是蛇足石杉离体培养叶状体再生未有成功报道。鉴于蛇足石杉离体培养是开发其原植物快繁或生物技术生产原植物性药用石杉碱甲(Hup-A)资源的重要技术平台，本发明建立了生产石杉碱甲的蛇足石杉原植物再生叶状体组织的离体无性増殖系，突破了同类研究的一项关键技木。本发明的培养方法及基质配方为蛇足石杉离体繁殖原植物叶状体组织无性増殖提供了必需的条件。用本发明的方法进行蛇足石杉离体培养，可获得大量的蛇足石杉叶状体药用植物资源。利用这项发明扩大规模离体培养叶状体提取生产的药物石杉碱甲(Hup-A)将产生极为重大的经济价值。
图1蛇足石杉原植物材料及其离体培养诱导叶状体发生与增殖图；图2离体培养的叶状体提取物与石杉碱甲标准品、原植株提取物対照的薄层层析图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1 < 一 >选择健壮无病虫害野生蛇足石杉植株，取当年抽生约3cm长的新枝；
< ニ >用自来水洗去枝叶上的灰尘后，再用洗衣粉液浸泡6 lOmin，然后用软毛笔刷洗枝叶，自来水細流水中漂洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器中进行表面灭菌处理；转至超净工作台上，再以质量分数75%的乙醇消毒0. 5min--lmin，无菌水洗浄，吸干水后，再以质量分数0. 0.5% HgCl2加1滴吐温80浸泡消毒材料6 lOmin，倾去药液后，用无菌水冲洗6-8次。然后在无菌条件下，将蛇足石杉新枝分割切成长度为0. 5 Icm 左右的茎小段，接种到准备好的叶状体分化启动培养基上培养；<三 > 外植体培养至切ロ处出现緑色小凸点，继续在叶状体分化启动培养基上培养10 15天，緑色小凸点发育成可辨的叶状体组织，此时的叶状体组织迅速増殖，生长的叶状体逐渐包围了外植体，长成一団3cm直径的叶状体组织块；将诱导増殖的叶状体组织分割成小块，每瓶45ml左右培养基接种l.Og至1.5g，转接到叶状体继代增殖培养基上，培养40 50天；<四 > 叶状体分割继代培养，一小部分叶状体切割作继代小块，接种到继代増殖培养基上继代培养，以后每40 50天转代一次，每代増殖的叶状体鲜重比接种量增加8 13 倍，建成叶状体无性繁殖系；另一大部分叶状体收获可提取石杉碱甲。<五 > 培养条件1.培养基配方对培养基中的大量元素、微量元素、有机成分、植物激素、糖类等各个组成成分进行多次正交设计及梯度试验的基础上得到。本发明适用的基本培养基6，7-V，(1)叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+NAA0. lmg/L，蔗糖用量25g/L(其它实施例的叶状体分化启动培养基蔗糖用量皆同)；( 叶状体继代增殖培养基6，7-V+NAA0.5mg/L，蔗糖用量25g/ し以上培养基的pH值5. 8 6. O、琼脂粉质量分数0. 6%，并在温度118 120°C暨压カ 0. 8 1. O公斤/平方厘米的高温高压下灭菌25min。2.培养环境提供培养环境恒温( 士 1) °C，相対湿度60% 70%，光照强度为1000 15001x左右，目照时长11 14h(小吋)/d(天)。实施例2 选择健壮无病虫害野生蛇足石杉植株，取当年抽生约3cm长的新枝，对外植体清洗消毒后在无菌条件下，将蛇足石杉新枝分割切成长度为0. 5 Icm左右的茎小段， 接种到准备好的叶状体分化启动培养基上培养。(1)叶状体分化启动培养基1/2(6， 7-V)+IAA0. 5mg/L(单位下同)；⑵叶状体继代增殖培养基6，7_V+NAA0. 5，蔗糖用量20g/ L，其它与实施例1相同。实施例3 (1)叶状体分化启动培养基1/2 (6，7-V)+IAA1. Omg/L (单位下同)；⑵叶状体继代増殖培养基6，7-V+NAAl. 0，蔗糖用量25g/L，其它与实施例1相同。实施例4 (1)叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+IAA2. Omg/L(单位下同)；⑵叶状体继代増殖培养基6，7-V+NAAl. 5，蔗糖用量30g/L，其它与实施例1相同。实施例5 (1)叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+IAA0. lmg/L(单位下同)；⑵叶状体继代増殖培养基6，7-V+NAA2. 0，蔗糖用量30g/L，其它与实施例1相同。实施例6 (1)叶状体分化启动培养基1/2 (6，7-V) +NAAO. 5mg/L (单位下同)；O)叶状体继代増殖培养基6，7-V+IAA0. 1，蔗糖用量25g/L，其它与实施例1相同。实施例7 (1)叶状体分化启动培养基1/2 (6，7-V)+NAA1. Omg/L (单位下同)；O)叶状体继代増殖培养基6，7-V+IAA0. 5，蔗糖用量25g/L，其它与实施例1相同。实施例8 (1)叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+NAA2. Omg/L(单位下同)；O)叶状体继代増殖培养基6，7-V+IAAl. 0，蔗糖用量25g/L，其它与实施例1相同。实施例9 (1)叶状体分化启动培养基:l/2(6，7-V)+6-BA1.0mg/L (单位下同)+IAA0. 5 ； (2) 叶状体继代增殖培养基6，7-V+IAA2. 0，蔗糖用量25g/L，其它与实施例1相同。实施例10 (1)叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+ZTl. Omg/L(单位下同)+IAA0. 5 ； (2)叶状体继代增殖培养基6，7-V+IAA0. 5，蔗糖用量30g/L，其它与实施例1相同。实施例11 (1)叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+ZTl. Omg/L(单位下同)+NAA0. 5 ； (2)叶状体继代增殖培养基6，7-V+IAA0. 5，蔗糖用量35g/L，其它与实施例1相同。实施例12 (1)叶状体分化启动培养基1/2 (6，7-V) +ZT2. Omg/L (单位下同)+NAA0. 5 ； (2)叶状体继代增殖培养基6，7-V+IAA0. 5，蔗糖用量20g/L，其它与实施例1相同。实验结果如表1、表2:表1 激素对蛇足石杉叶状体启动的影响
权利要求
1.一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和増殖的培养方法，其特征在于包括以下步骤(1. 1)材料蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb. ex Murray)Trev.,选择健壮无病虫害的庐山野生蛇足石杉植株，取当年抽生约3cm长的新枝；(1. 2)对外植体清洗消毒；(1. 3)外植体接种在叶状体分化启动培养基上培养至切ロ处出现緑色小凸点，继续在叶状体分化启动培养基上培养10 15天，緑色小凸点发育成可辨的叶状体组织，此时的叶状体组织迅速増殖；叶状体分化启动培养基l/2(6，7-V)+NAA 0. 1 1. Omg/L，蔗糖用量 20 30g/L ；(1. 4)将诱导増殖的叶状体组织分割成小块，每瓶45ml左右培养基接种1. Og至1. 5g， 转接到叶状体继代增殖培养基上培养，叶状体继代增殖培养基6，7-V+NAA0. 1 1. 5mg/L 或 IΑΑ0. 1 1. Omg/L，蔗糖用量 20 30g/L ；(1.5)叶状体分割继代；一小部分叶状体切割作继代小块，接种到继代増殖培养基上继代培养，以后每40 50天转代一次，每代叶状体生物量鲜重比接种量增加8 13倍，建成叶状体无性繁殖系；另一大部分叶状体收获可提取石杉碱甲。
2.根据权利要求1所述的产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和増殖的培养方法， 其特征在于培养条件如下(2. 1)培养參数恒温对士2で，相対湿度60% 70%，光照强度为1000 15001x，日照时长11 14h/d ；(2. 2)技术參数外植体污染率低于10% 20% ；叶状体诱导率50% 80% ；继代周期40 50d，建立蛇足石杉原植物再生叶状体组织的离体无性増殖系；每代叶状体生物量鲜重比接种量增加8 13倍，离体培养的蛇足石杉叶状体能生产积累石杉碱甲。
3.根据权利要求1所述的产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和増殖的培养方法， 其特征在于对外植体消毒过程中用自来水洗去枝叶上的灰尘后，再用洗衣粉液浸泡6 lOmin，然后用软毛笔刷洗枝叶，自来水細流水中漂洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器； 再以质量分数75%的乙醇和质量分数0. 0. 5% HgCl2加1滴吐温80先后分次消毒。
全文摘要
本发明公开了一种产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体诱导和增殖的培养方法，包括以下步骤选择健壮无病虫害野生蛇足石杉植株，取当年抽生约3cm长的新枝为外植体；诱导产生叶状体并增殖成一团3cm直径的叶状体组织块，(1)叶状体分化启动培养基，(2)叶状体继代增殖培养基；叶状体分割继代培养。本发明的培养方法及基质配方为产石杉碱甲的离体蛇足石杉叶状体的诱导和增殖提供了必需的环境条件。用本发明的方法进行蛇足石杉离体培养，可获得大量的蛇足石杉叶状体药用植物资源。利用这项发明扩大规模离体培养叶状体提取生产的药物石杉碱甲(Hup-A)将产生极为重大的经济价值。
文档编号A01H4/00GK102550416SQ201210005499
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者丁明华, 涂艺声 申请人:江西师范大学