专利名称：一种神经细胞的冻存液及冻存方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞的冻存液及冻存方法。
背景技术：
细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已深入广泛的应用。低温冷冻保存技术即将二甲亚砜和血清加入细胞悬液后放入冻存管中，置于-80°C冰箱内过夜后转入液氮中保存。对多种细胞来说，加入适宜的冷冻液，经过冻-融过程细胞仍可存活并可以继续培养。但多数情况适合于能在体外进行培养并长期存活的细胞，如骨髓瘤细胞、 杂交瘤细胞等。中国专利公告号CN 1164739C公开一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液，该发明配方为10% -30%的细胞培养液、60% -80%小牛血清和10%二甲基亚砜。所针对的细胞为普通动物组织细胞，甚至是肿瘤细胞，但是，对于神经细胞，因其中包含处于不同分化状态的细胞，在体外又不适于长期存活、生长、分化，对冻融损伤、能量缺乏的敏感性较强，将严重影响神经细胞复苏后的存活率和细胞活性。与其它细胞类型相比，神经细胞能量代谢快，能量需求量大，尤以细胞分化时更甚。葡萄糖是神经元能量代谢必需的能源物质，葡萄糖有利于神经元生长，但葡萄糖浓度太高，就容易增加污染的机会。神经细胞冻存复苏后存活率较差、细胞活性较低，目前还未探索出一种较为理想的神经细胞冻存液和冻存方法，其原因主要与冻存液毒性、细胞能量缺乏等有关。中国专利CN1966674A公开了一种冷冻保存神经干细胞的方法，该发明所采用的将15% 2XDMS0导入胶原培养基中冻干，二甲基亚砜(DMSO)是细胞冻存常用的保护剂，无色透明液体，有很强的极性，可显著改变细胞内多种酶类的活性，从而有利于细胞的冻存， 但二甲基亚砜使用浓度过高O 10%)，对冻存细胞产生严重的毒性作用，与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性。因此，神经细胞冻存液的研制应该致力于保证神经细胞的活性和提高复苏后的存活率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种保持神经细胞活性，且提高细胞冻存复苏后存活率的冻存液，同时，也提供一种应用此冻存液进行神经细胞冻存的方法。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是，一种神经细胞的冻存液，所述冻存液包括基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜、6-磷酸果糖和黄酮类物质，其中各组分的重量比为基础培养基20-70重量份胎牛血清20-50重量份二甲基亚砜3-8重量份6-磷酸果糖O. 1-1重量份
黄酮类物质O. 1-1重量份；
其中，所述基础培养基为Eagl^ 8]\^]\1、01^]\^12、或01^]\1与？12的按1 I的
重量比的混合培养基。其中，所述黄酮类物质为4'，5，7_三羟基黄酮、5，6_ 二羟基_7，4' -二甲氧基黄酮、5，8，2'-三烃基-7-甲氧基黄酮或3'，4'，5，7_四羟基黄烷酮。在本发明的神经细胞的冻存液中，黄酮类物质具有明确的抗氧化、可以抵御自由基对细胞的损伤。6-磷酸果糖具有在使冻存的细胞复原时提高活细胞率(有效细胞率)的功能，能在分子水平上调节细胞代谢中若干酶活性，恢复和改善细胞代谢，减轻细胞损伤， 能促进血液循环,增加ATP合成。本发明在神经细胞冻存液中含6-磷酸果糖、黄酮类物质和两种制剂。本发明含 6-磷酸果糖和黄酮类物质的混合物有较好的效果，6-磷酸果糖和的黄酮类物质有显著的协同作用，可以显著提高神经细胞的活性和复苏后的存活率。本发明还提供了一种神经细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。本发明还提供了一种神经细胞冻存方法，包括以下步骤A.冻存液制备制备所述的神经细胞冻存液；B.细胞悬液制备培养生长成单层的神经细胞一瓶，O. 25%胰蛋白酶液消化3分钟，弃胰酶液，加入RPMI-1640培养液10ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分， 弃上清，加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；C.冷冻先将冻存管在(TC下冻存30min，然后放入-30°C冻存lh，再放入-80°C冻存4h，最后移入液氣iip中保存；D.细胞复苏取出冻存管快速置于37°C水浴l_2min，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用10倍Hanks液稀释，1000r/min离心5min,离心,去除上清液,再重复3次。所述细胞悬浮浓度为IX 108细胞/ml 5X 1010细胞/ml，以深低温保藏。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果(I)本发明的神经细胞冻存液和冻存方法，复苏细胞存活率可达95% -99%以上， 较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高；(2)本发明的神经细胞冻存液和冻存方法可以长期保存神经细胞，并且在长期保存后神经细胞活性不发生变化，保证了神经细胞生物学活性。(3)本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，具有很强的实用价值。(4)本发明冻存液配方中二甲基亚砜浓度低于10%，对冻存神经细胞无毒性作用。
具体实施例方式实施例I神经细胞冻存液的制备一种神经细胞的冻存液，它由基础培养基，胎牛血清，二甲基亚砜，6-磷酸果糖和黄酮类物质组成。按如下四个配方所列的物质和重量称取各组分(单位为克)
权利要求
1.一种神经细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜、6-磷酸果糖和黄酮类物质，其中各组分的重量比为基础培养基20-70重量份胎牛血清20-50重量份二甲基亚砜3-8重量份6-磷酸果糖O. 1-1重量份黄酮类物质0.1-1重量份；其中，所述基础培养基为Eagle ; S MEM、DMEM、F12、或DMEM与F12的按I :1的重量比的混合培养基。
2.根据权利要求I所述的神经细胞的冻存液，其特征在于，所述黄酮类物质为 4’，5，7-三羟基黄酮、5，6-二羟基-7，4’-二甲氧基黄酮、5，8，2’_三烃基-7-甲氧基黄酮或3’，4’，5，7-四羟基黄烷酮。
3.—种神经细胞的冻存液的制备方法，将所述各组分混合摇匀即成。
4.一种使用权利要求I所述的神经细胞的冻存液的神经细胞冻存方法，包括以下步骤A.冻存液制备制备如权利要求I所述的神经细胞冻存液；B.细胞悬液制备培养生长成单层的神经细胞一瓶，O.25%胰蛋白酶液消化3分钟，弃胰酶液，加入RPMI-1640培养液10ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；C.冷冻先将冻存管在0°C下冻存30min，然后放入_30°C冻存lh，再放入-80°C冻存 4h，最后移入液氣iip中保存；D.细胞复苏取出冻存管快速置于37°C水浴l_2min，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用10倍Hanks液稀释，1000r/min离心5min,离心,去除上清液,再重复3次。
5.根据权利要求4所述的神经细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞悬浮浓度为 1X108细胞/ml 5X1010细胞/ml，以深低温保藏。
全文摘要
本发明公开了一种冻存神经细胞的细胞冻存液及冻存方法，用于冻存神经细胞，特别是新鲜分离的原代动物神经细胞，如海马神经细胞。本发明冻存液为在基础培养基中加入基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜、6-磷酸果糖和黄酮类物质，6-磷酸果糖(w/w)具有在使冻存的细胞复原时提高活细胞率(有效细胞率)的功能，黄酮类物质具有明确的抗氧化、可以抵御自由基对细胞的损伤。本发明提高神经细胞经过冻存的存活率以及细胞功能，复苏细胞存活率提高到95%以上，本发明神经细胞冻存液可以长期保存神经细胞，保证神经细胞生物学活性，具有很强的实用价值。
文档编号A01N1/02GK102578078SQ201210023539
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月2日 优先权日2012年2月2日
发明者孙晶 申请人:温州医学院附属第二医院