专利名称：：整合O型口蹄疫病毒shRNA转基因克隆猪的制备方法
技术领域：
：本发明涉及ー种整合O型ロ蹄疫病毒shRNA转基因克隆猪的制备方法，具体是通过shRNA的设计和制备、细胞的转染和攻毒、RT-PCR、实时定量PCR等过程筛选出高效抑制O型ロ蹄疫病毒的小干扰片段，并构建抗ロ蹄疫病毒shRNA表达载体，将优秀干扰片段转染至猪胎儿成纤维细胞，利用体细胞核移植和胚胎移植技术获得抗O型ロ蹄疫病毒转基因克隆猪，属于动物转基因
技术领域：
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背景技术：
：ロ蹄疫(foot-and-mouthdisease,FMD)是由小RNA病韋科的ロ蹄疫病韋(foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的严重危害偶蹄动物的高度接触性、急性、发热性传染病，发病率几乎100%，动物发病后，主要症状为口腔黏膜、蹄、乳头及乳房皮肤发生水疤。该病流行于欧洲、非洲、拉丁美洲的近60个国家，某个国家一旦爆发ロ蹄疫，老百姓要么拒买肉类食品，要么哄抢食品，发病国与世界其他国家的肉食品贸易将停止，因此往往造成社会动荡或政治纠葛。同时，该病给经济造成巨大的损失，2001年英国暴发ロ蹄疫，为处理本次疫病，花费近50亿美元。ロ蹄疫对全球的社会稳定及经济发展影响巨大，因此，世界动物卫生组织(OIE)把该病定为A类家畜传染病之首，中华人民共和国农业部也将其定为ー类动物疫病的第一位。ロ蹄疫病毒有A、0、C、Asial和南非I、2、3型7个血清型，不同亚型有70多个。对ロ蹄疫的防治，发达国家大多采取扑杀销毁的措施，发展中国家主要依靠疫苗免疫接种，但此种方法存在疫苗毒カ反强、活病毒逃逸生产车间、灭活不彻底及疫苗研制滞后于病毒的变异等弊端，从而限制了此类疫苗的广泛应用。同吋，由于FMDV是ー种高度变异性的RNA病毒血清型，而各型间不存在交叉保护作用，通过免疫接种来预防和控制ロ蹄疫的流行变得越来越困难。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是最早发现于植物细胞中的一种转录后的基因沉默技术，它是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，也即通过对目的基因转录后产生的mRNA的降解而使目的基因不能表达，即所谓的基因沉默，其原理是通过导入或细胞内产生与靶mRNA序列特异互补的小分子双链RNA，这种RNA称为小分子干扰RNA(S卩siRNA)。siRNA产生后，通过siRNA中的一条链与靶mRNA序列互补配对，再在一系列酶的作用下将靶mRNA降解，从而使靶mRNA不能翻译、表达，使其表型沉默。RNAi发现后，人们利用它来分析基因功能、设计药物，因效果理想得到广泛的认可，同时它已经被用于代谢病、肿瘤、感染性疾病等各种病症的预防和治疗。丙型肝炎病毒、こ型肝炎病毒、人的免疫缺陷病毒流感A病毒、人的乳头瘤病毒以及冠状病毒已被人们通过RNAi得到抑制或消除，研究者表明RNAi是当前抗病毒感染比较有效的方法之一，对防治严重的动物传染病意义十分重大。将体外重组基因导入早期胚胎或受精卵的基因工程技术称为转基因动物技术，被整合的外源结构基因称为转基因，该技术被公认是继连锁分析、体细胞遗传、基因克隆之后的第四代技木。转基因动物(Transgenicanimals)是指将外源基因通过基因工程方法导入动物基因组内或者是通过人为的方法改变动物基因组序列的表达方式，这种改变后的基因组能够稳定地遗传其后代的遗传工程动物。Gordon等人在1980年首先育成转基因小鼠，此小鼠体内带有人的生长激素基因，它的生长速度比实验对照组小鼠快24倍，人们称其为转基因“硕鼠”，自此，转基因动物技术开始受到生命科学界的广泛关注。转基因动物技术是综合活体动物水平、细胞水平、分子水平的一种技术体系，也是实验动物学、发育生物学、生殖生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学等学科的技术和理论知识的综合应用。转基因动物研究经历了几十年探索及发展历程，得到了不断的完善，在生命科学中的许多领域得到广泛应用，目前转基因动物技术已经在病毒性疾病研究、心血管疾病研究、免疫学研究、肿瘤学研究、遗传病研究、基因治疗、器官移植、建立新药筛选及检测和治疗人类疾病的动物模型中得到广泛应用。建立转基因动物的方法或者是按导入外源基因的方式有多种，显微注射法是发展最早、最为有效也是目前应用最广的构建转基因动物的方法，Gorden等和Palmiter等先后通过显微注射法获得转基因动物，后来用此法得到了第一头转基因牛。反转录病毒感染法是将反转录病毒载体重组上目的基因后，制成病毒颗粒，然后感染受精卵或着床前的胚胎。精子载体法是将脂质体包埋过的外源目的基因和精子共同孵育后融合，然后精子将外源目的基因携入卵母细胞，从而制备转基因动物。除了以上方法外，还有脂质体介导法、电转移法、激光导入法、定位整合技术、胚胎干细胞介导法、体细胞核移植法等方法。參考文献1.BlancouJ.2002.History01thecontroloffoot-and-mouthdisease.ComparativeImmunology,Microbiology&InfectiousDiseases，25:2832962.SutmollerP，BartelingSS，OlascoagaRC，etal.2003.Controlanderadicationoffoot-and-mouthdisease.VirusResearch，91:101丄443.ChenWjYanWjDuQ，etal.RNAinterferencetargetingVPlinhibitsfoot-and-mouthdiseasevirusreplicationinBHK—21cellsandsucklingmice.JVirol,2004，78(13):6900-6907.4.GrubmanjM.J.andBaxtjB.2004.Foot-and-mouthdisease.Clin.Microb.Rev.Inpress.5.WuLGjFanJHjBelascoJG.MicroRNAsdirectrapiddeadenylationofmRNA[J]·ProcNatlAcadSciUSA,2006，103(11):4034-4039.6.BumcrotjD.,ManoharanjM.,KotelianskyjV.,andSahjD.W.RNAitherapeutics:apotentialnewclassofpharmaceuticaldrugs.Nat.Chem.Biol.2006.2:711-719.7.Grimm,D.,andKayjM.A.TherapeuticshorthairpinRNAexpressionintheliver:viraltargetsandvectors.GeneTher.2006.13:563-575.8.WuRH，ChengTL，LoSR，etal.AtightlyregulatedandreversiblyinduciblesiRNAexpressionsystemforconditions丄RNAimediatedgenesilencinginmammaliancells.JGeneMed.2007;9:620-634.9.HenriksenJRjLokkeC，HammeroM，etal.ComparisonofRNAiefficiencymediatedbytetracycline-responsiveHlandU6promotervariantsinmammaliancelllines.NucleicAcidsRes2007;35:59-67.10.PfefferjS.etal.2005.IdentificationofmicroRNAsoftheherpesvirusfamily.Nat.Methods2，269-27611.Cullen,B.R.2005.RNAithenaturalway.Nat.Genet.37，1163-1165.12.Davidson,B.L.,andBoudreau,R.L.RNAinterference:atoolforqueryingnervoussystemfunctionandanemergingtherapy.Neuron.2007.53:781-788.13.Shultz,LD;IshikawajF;Greiner,DL.Humanizedmiceintranslationalbiomedicalresearch.NatRevImmunol.2007;7:118-130.14.GABBINEWEED-BKjBONG-SEOKS0NG，JI-SUKIMjMAN-JONGKANG,SEUNG-JUMOON,Y0NG-K00KKANGjKYUNG-KWANGLEEjANDY0NG-MAHNHAN.InheritableHistoneH4AcetylationofSomaticChromatinsinClonedEmbryos[J].Thejournalofbiologicalchemistry,2006，281:6048-6057.15.GHANEMMENT,NISHIBORIM.Deficiencyofuridinemonophosphatesynthase(DUMPS)andX-chromosomedeletioninfetalmummificationincattle.[J].AnimReprodScij2006，91(1-2):45-54.16.VajtaG，ZhangYHjMachatyZ.Somaticcellnucleartransferinpig:recentachievementsandfuturepossibilities.ReprodFertilDevj2007，19(2):403-423.17.XuX，GuoH，XiaoCjet.al.InvitroinhibitionofclassicalswinefevervirusreplicationbysiRNAstargetingNproandNS5Bgenes.AntiviralRes.2008;Jun;78(3):188-93.18.THUKLVEjKENNETTJYjHERYETCjBROWNCJjLAMWLjWILSONIM.MethylatedDNAimmunoprecipitation[J].JVisExpj2009.19.SANTENARDAT-PM.Epigeneticreprogramminginmammalianreproduction:Contributionfromhistonevariants.[J].Epigeneticsj2009，4(2).20.HUAWENJUNjLIUXIMEIjCHENGNI，etal.DeterminationofphysiologicalbiochemicalparametersandreproductiveperformanceintransgenicsFat-1genepigs[J].AgriculturalScience&Technology,2010，11(5):106-108。
发明内容本发明的目的在于提供了ー种整合0型ロ蹄疫病毒shRNA转基因克隆猪的制备方法，其利用RNA干扰和转基因克隆技术制备抗O型ロ蹄疫病毒复制转基因克隆猪的方法，针对O型ロ蹄疫病毒VPl和3D基因共设计了16对shRNA，构建干扰载体16个；将干扰载体转染BHK-21细胞并对转染细胞攻毒，提取攻毒后細胞的RNA，反转录为cDNA，通过Real-timePCR筛选出两个表达质粒抑制ロ蹄疫病毒复制的效率最好；用组织块法分离了猪胎儿成纤维细胞，线性化的优秀表达质粒转染猪胎儿成纤维細胞，筛选出阳性细胞作为核移植的供体細胞；成功培养猪卵母細胞，通过核移植构建了含有抗ロ蹄疫病毒复制干扰片段的重构胚胎；利用胚胎移植将重构胚胎移入受体母猪子宮，受体母猪自然分娩获得抗ロ蹄疫转基因克隆仔猪，检测结果表明转基因克隆仔猪具有抑制O型ロ蹄疫病毒复制的能力。本发明的技术方案是这样实现的ー种整合O型ロ蹄疫病毒，其特征在于16对抗猪O型ロ蹄疫病毒病ShRNA的序列如下；PXL-EGFP_NE0-FMDV-VP「0正义链GATCCAATTACTCAGACACTTGCAGTTTCAAGAGAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAATTACTCAGACACTTGCAGTTCTCTTGAAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP「1正义链GATCCAAGTTAATGTGTTGGACCTGATTCAAGAGATCAGGTCCAACACATTAACTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATCTCTTGAATCAGGTCCAACACATTAACTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP「2正义链GATCCAATGTGTTGGACCTGATGCAGTTCAAGAGACTGCATCAGGTCCAACACATTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAATGTGTTGGACCTGATGCAGTCTCTTGAACTGCATCAGGTCCAACACATTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP「3正义链GATCCAACAGCTTACCACAAGGAACCTTCAAGAGAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAACAGCTTACCACAAGGAACCTCTCTTGAAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP「4正义链GATCCAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTTCAAGAGAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTCTCTTGAAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP「5正义链GATCCAACTCTGCCTACCTCCTTCAATTCAAGAGATTGAAGGAGGTAGGCAGAGTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAACTCTGCCTACCTCCTTCAATCTCTTGAATTGAAGGAGGTAGGCAGAGTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP「6正义链GATCCAAGGCAACTCGTGTTACTGAATTCAAGAGATTCAGTAACACGAGTTGCCTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATCTCTTGAATTCAGTAACACGAGTTGCCTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP「权利要求1.一种整合0型口蹄疫病毒，其特征在于16对抗猪0型口蹄疫病毒病shRNA的序列如下；PXL-EGFP_NE0-FMDV-VP「0正义链GATCCAATTACTCAGACACTTGCAGTTTCAAGAGAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAATTACTCAGACACTTGCAGTTCTCTTGAAACTGCAAGTGTCTGAGTAATTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP-1正义链GATCCAAGTTAATGTGTTGGACCTGATTCAAGAGATCAGGTCCAACACATTAACTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGTTAATGTGTTGGACCTGATCTCTTGAATCAGGTCCAACACATTAACTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP-2正义链GATCCAATGTGTTGGACCTGATGCAGTTCAAGAGACTGCATCAGGTCCAACACATTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAATGTGTTGGACCTGATGCAGTCTCTTGAACTGCATCAGGTCCAACACATTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP-3正义链GATCCAACAGCTTACCACAAGGAACCTTCAAGAGAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAACAGCTTACCACAAGGAACCTCTCTTGAAGGTTCCTTGTGGTAAGCTGTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP-4正义链GATCCAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTTCAAGAGAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAGAAAGAACTCTGCCTTCTCTTGAAAGGCAGAGTTCTTTCTGCCTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP-5正义链GATCCAACTCTGCCTACCTCCTTCAATTCAAGAGATTGAAGGAGGTAGGCAGAGTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAACTCTGCCTACCTCCTTCAATCTCTTGAATTGAAGGAGGTAGGCAGAGTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP-6正义链GATCCAAGGCAACTCGTGTTACTGAATTCAAGAGATTCAGTAACACGAGTTGCCTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGGCAACTCGTGTTACTGAATCTCTTGAATTCAGTAACACGAGTTGCCTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-VP-7正义链GATCCAAGAGAGCCGAGACATACTGTTTCAAGAGAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGAGCCGAGACATACTGTTCTCTTGAAACAGTATGTCTCGGCTCTCTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-3D-0正义链GATCCATAGCGTCACCGAAGTTACTATTCAAGAGATAGTAACTTCGGTGACGCTATTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAATAGCGTCACCGAAGTTACTATCTCTTGAATAGTAACTTCGGTGACGCTATGPXL-EGFP-NE0-FMDV-3D-1正义链GATCCAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTTCAAGAGAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGAGGACAAAGCGCTGTTTCTCTCTTGAAGAAACAGCGCTTTGTCCTCTTGPXL-EGFP-NE0-FMDV-3D-2正义链GATCCAACATCATGTTCGAGGAAGTGTTCAAGAGACACTTCCTCGAACATGATGTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAACATCATGTTCGAGGAAGTGTCTCTTGAACACTTCCTCGAACATGATGTTG正义链GATCCAAGCTACAGATCACTTTACCTTTCAAGAGAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTTTTTTTACGCGTG反义链AATTCACGCGTAAAAAAAAGCTACAGATCACTTTACCTTCTCTTGAAAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTG。2.根据权利要求I所述的一种整合O型口蹄疫病毒，其特征在于所述的抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA的序列以PXL-EGFP-NEO-VPi-3和PXL-EGFP-NE0-3D-6为优选。3.根据权利要求I所述的一种整合O型口蹄疫病毒，其特征在于所述的具有O型口蹄疫病毒病shRNA转基因克隆猪的构建方法如下I)、根据GenBank中公布的O型口蹄疫病毒基因组序列，选择VPl和3D基因中的保守区段，选取一段21bp长的核酸序列，此序列是特异性的只针对猪O型口蹄疫病毒目的基因，人工合成发卡结构shRNA对应的DNA序列共16对；.2)、将上述人工合成的单链DNA退火合成双链，合成的双链与载体PXL-EGFP-NEO混合连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a;经单酶切及测序结果表明，构建的16个干扰载体完全正确，16个载体分别命名为PXL-EGFP-NEO-VPI-O、PXL-EGFP-NEO-VPI-1、PXL-EGFP-NE0-VP1-2、PXL-EGFP-NEO-VPI-3,PXL-EGFP-NEO-VPI-4,PXL-EGFP-NEO-VPI-5,PXL-EGFP-NEO-VPI-6、PXL-EGFP-NEO-VPI-7,PXL-EGFP-NE0-3D-0、PXL-EGFP-NE0-3D-1、PXL-EGFP-NE0-3D-2、PXL-EGFP-NE0-3D-3、PXL-EGFP-NE0-3D-4、PXL-EGFP-NE0-3D-5、PXL-EGFP-NE0-3D-6、PXL-EGFP-NE0-3D-7；.3)、将构建好的表达载体扩大培养，大剂量提取质粒，在24孔板上设转染表达质粒组、阴性对照组(乱序干扰片段)、不转染组和空白正常细胞组，按照TransfectamindOOOReagent试剂说明书操作步骤将线性化的表达质粒转染到各组BHK-21细胞中；转染2d后，取用Reed-Muench公式及原理测过TCID5tl的原病毒液，以2XIO3TCID50/孔感染转染后的细胞，分别于接毒后10、20、40、80h观察CPE情况并收集细胞毒液；.4)、用TRIZOL试剂提取不同时间点细胞毒液的RNA，用反转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA;以克隆正确的VP1、3D质粒为模板，绘制目标基因和3-actin内参基因标准曲线，目标基因和内参基因样品各做三次重复，通过一系列的计算过程得出样品表达量，分析计算结果，从结果中选出PXL-EGFP-NEO-VPI-3和PXL-EGFP-NE0-3D-6两个表达质粒抑制0型口蹄疫病毒复制效率最好；.5)、分离猪胎儿成纤维细胞时先将子宫中的胚胎取出，除去胚胎包膜，再去除胎儿内脏、头、尾、脊柱、四肢及骨头，剩下的部分在PBS中清洗后放入平皿中剪成Imm3大小的组织块，然后加入细胞消化液，消化充分后离心去除消化液并加入细胞培养液，等细胞培养至长满度90%时冻存备用；载体PXL-EGFP-NEO-VPI-3、PXL-EGFP-NE0-3D-6扩大培养后，大剂量提取质粒，酶切线性化后用乙醇沉淀，按照Transfectamine2000Reagent试剂说明书操作步骤将其转染到猪胎儿成纤维细胞中；通过G-418抗生素筛选后形成阳性克隆，经PCR检测，阳性细胞中含有目的基因片段；.6)、从本市屠宰场收集母猪卵巢在31-37°C含有双抗生理盐水的保温瓶中送回实验室，用20mL注射器抽吸卵泡中的卵泡液，收集50ml并沉淀15min后做一系列的处理，最后将卵母细胞在洗卵液中洗3次，再在成熟培养液中洗3次后放38.5°C,5%CO2培养箱中成熟培养；.7)、卵母细胞成熟后，在显微操作仪下先用盲吸法将卵母细胞去核，再用注核针吸取阳性猪胎儿成纤维细胞，用固定针固定卵母细胞，将供体细胞注到卵周隙的透明带下，经电融合后培养；培养成功后，选择合适的发情母猪，经麻醉后暴露手术部位，找到卵巢将重构胚胎吹入输卵管内，暴露的内脏及手术部位敷上抗生素后缝合腹腔；本发明共做受体母猪54头，经114d受体母猪自然分娩，共得到转基因克隆仔猪12头；.8)、取12头转基因克隆仔猪的尾组织，分离成纤维细胞，细胞传代培养后显示有5头转基因克隆仔猪的成纤维细胞带有绿色荧光；以出生的12头转基因克隆仔猪耳组织基因组DNA为模板进行PCR及目的条带测序，有5头转基因克隆仔猪基因组DNA的PCR结果有402bp的目的条带；同时对分离的成纤维细胞攻毒，攻毒后做Real-timePCR，结果有5头转基因克隆仔猪成纤维细胞具有抑制O型口蹄疫病毒复制的能力。全文摘要本发明涉及一种整合O型口蹄疫病毒shRNA转基因克隆猪的制备方法，其特征在于利用RNA干扰和转基因克隆技术制备抗O型口蹄疫病毒复制转基因克隆猪的方法，针对O型口蹄疫病毒VP1和3D基因共设计了16对shRNA,构建干扰载体16个；将干扰载体转染BHK-21细胞并对转染细胞攻毒，提取攻毒后细胞的RNA，反转录为cDNA，通过Real-timePCR筛选出两个表达质粒抑制口蹄疫病毒复制的效率最好；用组织块法分离了猪胎儿成纤维细胞，筛选出阳性细胞作为核移植的供体细胞；成功培养猪卵母细胞，利用胚胎移植将重构胚胎移入受体母猪子宫，受体母猪自然分娩获得抗口蹄疫转基因克隆仔猪，检测结果表明转基因克隆仔猪具有抑制O型口蹄疫病毒复制的能力。文档编号A61D19/04GK102703392SQ201210192040公开日2012年10月3日申请日期2012年6月12日优先权日2012年6月12日发明者乔军,欧阳红生,王鹏燕,赛务加甫,陈创夫,马铈委申请人:石河子大学