专利名称：一种大蒜试管鳞茎的诱导方法
技术领域：
本发明属于农业生物工程技术领域，涉及大蒜组织培养与快繁的方法，更具体的说是一种诱导大蒜的试管鳞茎培养基及其快繁的方法。
背景技术：
大蒜(Alliumsatira )是无性繁殖植物，由于长期的无性繁殖,大蒜积累了大量的病毒，严重影响了大蒜的品质、产量以及商品性。以色列科学家通过低温诱导、光周期调控和营养控制促使大蒜开花，获得大蒜种子，通过种子繁殖和改良大蒜品种取得了可喜进展，然而，由于大蒜种子的生物量小，获得实生苗的数量有限，加上种子获得要求条件高，所以通过大蒜开花接种子来繁殖大蒜仍然处于探索阶段。到目前为止，大蒜的快繁、脱毒、种质创新主要靠离体培养的方法。大蒜离体脱毒快繁主要有三种途径
第一是愈伤组织途径大蒜通过外植体(茎尖、茎盘等)诱导愈伤组织培养，继而诱导再生苗是一种重要快繁手段，但愈伤组织途径快繁，由于需要经过细胞脱分化和再分化过程获得组织培养苗，大量的遗传变异和组培苗难以移栽成活严重影响了人们对这种方法在生产实践中的推广；
第二，离体诱导丛生苗途径该方法不通过愈伤组织诱导培养，而是直接用大蒜外植体诱导不定芽，不定芽培养成丛生苗，丛生苗通过诱导生根形成试管苗，该方法避免了细胞脱分化和再分化对大蒜遗传变异的影响，对大蒜种质保持有重要的积极作用(徐培文等，山东农业科学，1998)。上述两种方法制约大蒜繁殖系数的瓶颈问题是试管苗移栽成活率不高(宋淑敏等，黑龙江八一农垦大学学报，2012)；
第三是利用气生鳞茎和试管鳞茎途径
(1)气生鳞茎繁殖法研究表明，有些工作者用大蒜的气生鳞茎(天蒜)做种子进行大蒜的脱毒、快繁，取得了一定的进展，且早在1964年吴鹏(1964，中国农业科学)通过精细挑选和合理栽培，实现了气生鳞茎第一年结出分瓣大蒜。更多的报导是，利用天蒜做种子繁殖大蒜，由于只有成熟的天蒜才能做种子，不成熟或幼嫩的天蒜(确切的说是气生鳞芽)做种子，因其营养不足，出苗率降低，降低了繁殖效率。同时，为了获得更多的成熟的、可以用作种子的天蒜，人们不得不让留天蒜的蒜薹充分生长，这样，其生长必然会争夺地蒜的营养，影响地蒜的产量，降低种蒜的收益。张绍文等(中国蔬菜，1994)对大蒜气生鳞茎利用价值进行研究，用的是成熟的天蒜，用天蒜作播种材料其增殖倍数均在30倍以上，但留天蒜植株的地蒜重量较不留株减产22. 6%-33% ；
(2)试管鳞茎繁殖法
由于试管苗(不管是从愈伤组织中还是丛生苗中获得的)驯化作为微繁殖与大田生产相衔接的关键环节，需要非常严格的驯化条件和管理操作，驯化过程中试管苗在离体条件下形成的根系往往不能发挥作用，需要发生新根系，导致恢复生长缓慢，死苗率高，而试管鳞茎具有较强的抗逆性，不需驯化即可直接移栽到大田，并且试管鳞茎具有较好的贮藏性，可以不受大田生长季节的限制，所以试管鳞茎的培育为大蒜脱毒种苗商品化生产提供有效途径(刘高琼等，南京农业大学学报，1996;万丽，南京农业大硕士论文，2004;)。张素芝等(2007，山东农业大学学报)建立了大蒜花苞不定芽再生体系，他们用大蒜花苞为外植体，在不同的激素配比条件下(MS+NAA+KT)，体外诱导不定芽，平均每个花苞诱导不定芽的个数最多为19. 2，在不加激素的培养基上，这些不定芽诱导成试管鳞茎的频率最高可达82. 9%。这种方法有效地利用了大蒜花苞具有诱导不定芽能力强的特点，同时借鉴了前人利用试管鳞茎快繁效率高的优点。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种大蒜试管鳞茎的诱导方法，它是按如下的步骤进行
(1)大蒜花苞采摘及处理 田间种植的大蒜甩辫后7-10天，采摘花苞200个，每个花苞带15-20cm的假茎，置太阳下晾晒，将花苞平均分成2份，用硫酸纸将带假茎的花苞包好，外套敞口的塑料保鲜袋；
(2)低温诱导气生鳞芽
将幼嫩大蒜花苞在4-6°C冰箱中低温诱导30天，待长出气生鳞芽后将将外衣和假茎去除备用；
(3)复壮气生鳞芽
A.以MS培养基为基本培养基，在IL培养基中加a-萘乙酸0.5mg，激动素2.5mg，蔗糖30g，琼脂7. 5g，定容至1000ml，pH值调为5. 8，在121 °C、I. Ikg / cm高温高压灭菌20min，待灭菌后的培养基冷却至60°C时，分装到IOOml的培养瓶中，每瓶20ml培养基，把口封好以防染菌，备用；
B.将低温诱导生出的气生鳞芽解剖，剥离单个气生鳞芽，流水冲洗5-10min，75%酒精消毒l_3min，10%安替福民消毒4-8min，蒸馏水冲洗3-5次，超净台上接种；在人工气候箱中复壮培养，培养条件25°C，光照12h/d，光强度2000LX ；
(4)试管鳞茎的诱导
以MS为基本培养基，在ILMS基本培养基中加入60g/L蔗糖，然后再将复壮的气生鳞芽直接接种到此培养基上，培养条件是25°C，光照12h/d，光强度2000LX，40天后统计试管鳞
茎诱导率。本发明所述的NAA是a_萘乙酸(1-naphthlcetic acid),简称NAA ；
KT是激动素(Kinetin)，简称KT ；
所述的MS基本培养基配方
每 IL基本培养基中含有KNO3 1900mg, NH4NO3 1650mg, MgSO4 7H20 370 mg, KH2PO4170 mg, CaCl2 2H20 440 mg, MnSO4 4H20 22. 3 mg, ZnSO4 7H20 8. 6 mg, H3BO3 6. 2mg, KI 0. 83 mg, Na2MO3 2H20 0. 25 mg, CuSO4 5H20 0. 025 mg, CoCl2 6H20 0. 025mg, Na2-EDTA 37. 7 mg, FeSO4 7H20 27. 8 mg,甘氨酸 2. 0 mg,盐酸硫胺素 0. 4 mg,盐酸批唆素0. 5 mg,烟酸0. 5 mg,肌醇100 mg。本发明用到的复壮气生鳞芽培养基为常规的培养基，主要用在大蒜不定芽诱导(张素芝，2004)；
试管鳞茎诱导的培养基，主要用于从试管鳞芽到试管鳞茎的诱导。
宝坻大蒜是天津市重要经济作物，具有独特的风味和重要的医用及商品价值。宝坻大蒜系早抽薹型大蒜，本发明通过适时摘取大蒜花苞，经过低温物理方法处理获得大蒜气生鳞芽，再在加激素培养基上(2. 5mg KT和0. 5mg NAA)复壮气生鳞芽，进而在无激素培养基上诱导试管鳞茎，提高了繁殖效率。下面本发明以典型的天津市宝坻大蒜快繁为代表，更加具体的说明实施方案
一、大蒜花苞采摘及处理
田间种植的天津宝坻大蒜(六瓣红)甩辫后7-10天，此时蒜薹尚嫩，气生鳞茎初步形成但没有成熟，这时采摘，既不影响气生鳞芽的形成率，也不会争夺地蒜的营养而影响地蒜的收益。采摘前一天用自来水仔细冲洗花苞去除灰尘和病虫等，上午晴好天气，10-12点采摘花苞200个，每个花苞带15-20cm的假茎，置太阳下晾晒以使假茎断口处水分蒸发并稍有萎蔫。将花苞平均分成2份，用硫酸纸将带假茎的花苞包好，外套敞口的塑料保鲜袋，一份放A 4°C冰箱中，低温诱导30d ;—份放在室温下做对照。 二、低温诱导气生鳞芽
在室温下放置的花苞，两周后假茎腐烂，连带花苞染菌腐烂，有较小的气生鳞芽长出，但由于染菌不再作为试管鳞茎诱导实验材料。经过低温诱导30天的花苞，在其所连带的假茎提供的营养下，继续生长、熟化，原来的幼嫩的花苞里面，挤满了饱满的气生鳞芽(
图1)，这时的气生鳞芽一部分已经发育成较为成熟的气生鳞茎(图I箭头I所示，红色的气生鳞芽)，但大部分的气生鳞芽没有成熟(图I箭头2所示，白色的气生鳞芽)，花苞外衣已被撑破，假茎营养已经消耗殆尽，黄化萎蔫，复壮培养前将花苞外衣和假茎去除。本发明用4°C低温诱导大蒜花苞100个，每一个花苞均有气生鳞芽诱导出来，诱导率为100%。每个花苞中平均诱导气生鳞芽25个。三、气生鳞芽复壮
低温诱导的气生鳞芽不适合直接用于种植，因为这样的鳞芽生物量小，很难成长为可以大田种植、收获大蒜的的幼苗。本发明以MS培养基为基本培养基，在IL培养基中加NAA
0.5mg, KT 2. 5mg,蔗糖 30g，琼脂 7. 5g，定容至 1000ml，pH值调为 5. 8，在 121°C、I. Ikg /cm高温高压灭菌20min。待灭菌后的培养基冷却至60°C时，分装到IOOml的培养瓶中，每瓶约20ml培养基，把口封好以防染菌，备用。将低温诱导的花苞解剖，剥离单个气生鳞芽，流水冲洗5min，75%酒精消毒lmin，10%安替福民消毒4min，蒸馏水冲洗5次，超净台上接种。其接种的方法用灭菌的镊子小心夹取气生鳞芽，轻轻按压到培养基中，然后迅速盖上培养瓶盖。每瓶中接种气生鳞芽5颗，共20瓶；在人工气候箱(德国MMM公司产，型号MC001640)中复壮培养，培养条件25°C，光照12h/d，光强度2000LX。四、试管鳞茎的诱导
复壮的气生鳞芽直接接种到试管鳞茎诱导培养基上，培养条件是25°C，光照12h/d，光强度2000LX。40天后统计试管鳞茎诱导率。试管鳞茎诱导培养基以MS为基本培养基，通过不同的激素配比和碳量供给，共设6组处理，表I是不同激素和碳配比对试管鳞茎诱导率的影响。结果发现，第I组培养基配比试管鳞茎的诱导率最高,为100%。由此得出结论，气生鳞芽在进行试管鳞茎诱导时不需要外加激素。
表I不同激素和碳配比对试管鳞茎诱导率的影响
权利要求
1.一种大蒜试管鳞茎的诱导方法，其特征在于按如下的步骤进行 (1)大蒜花苞采摘及处理 田间种植的大蒜甩辫后7-10天，采摘花苞200个，每个花苞带15-20cm的假茎，置太阳下晾晒，将花苞平均分成2份，用硫酸纸将带假茎的花苞包好，外套敞口的塑料保鲜袋； (2)低温诱导气生鳞芽 将幼嫩大蒜花苞在4-6°C冰箱中低温诱导30天，待长出气生鳞芽后将将外衣和假茎去除备用； (3)复壮气生鳞芽 A.以MS培养基为基本培养基，在IL培养基中加a-萘乙酸0.5mg，激动素2.5mg，蔗糖30g，琼脂7. 5g，定容至1000ml，pH值调为5. 8，在121 °C、I. Ikg / cm高温高压灭菌20min，待灭菌后的培养基冷却至60°C时，分装到IOOml的培养瓶中，每瓶20ml培养基，把口封好以防染菌，备用； B.将低温诱导生出的气生鳞芽解剖，剥离单个气生鳞芽，流水冲洗5-10min，75%酒精消毒l_3min，10%安替福民消毒4-8min，蒸馏水冲洗3_5次，超净台上接种；在人工气候箱中复壮培养，培养条件25°C，光照12h/d，光强度2000LX ； (4)试管鳞茎的诱导 以MS为基本培养基，在ILMS基本培养基中加入60g/L蔗糖，然后再将复壮的气生鳞芽直接接种到此培养基上，培养条件是25°C，光照12h/d，光强度2000LX，40天后统计试管鳞茎诱导率。
全文摘要
本发明公开了一种大蒜试管鳞茎诱导的新方法。主要用4℃低温处理大蒜幼嫩花苞诱导气生鳞芽，在MS+2.5mgKT+0.5mgNAA培养基上复壮气生鳞芽，在不加激素的MS+60g/L蔗糖培养基上诱导试管鳞茎，提高用气生鳞茎做种子进行大蒜快繁的繁殖效率，降低了成本。本发明的积极效果是，利用该方法气生鳞芽诱导率可达到100%(每个花苞均可以诱导出气生鳞芽)，每个花苞平均可诱导出25颗气生鳞芽，气生鳞芽全部可以诱导成试管鳞茎，试管鳞茎诱导率达100%。由于在整个诱导过程中，没有发生细胞脱分化和再分化，从而降低了遗传突变几率,该发明为大蒜快繁工厂化育苗提供重要的可能性。
文档编号A01H4/00GK102792887SQ201210263069
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者王振英, 李转春, 彭爱芳, 刘晓颖, 范宝莉, 陈宏 申请人:天津师范大学