专利名称：一种与玉米gpat基因连锁的snp位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米油份含量相关的SNP位点的应用，属于玉米育种和分子生物学领域。
背景技术：
玉米油份的品质育种主要包括含油量的选择和油品质的改良。通常，玉米油主要以三酰甘油(TAG)的形式储存于玉米籽粒的油体中。普通玉米的脂肪酸成分一般为11%的软脂酸(16:0)、2%的硬脂酸(18:0)、24. 1%的油酸(18:1)、61. 9 %的亚油酸(18:2)、
O.7%的亚麻酸以及含量不到I %的月桂酸(12:1)、豆蘧酸(14:1)、棕榈油酸(16:1)、花生酸(20:1)、三嵛酸(22:1)、芥子酸(22:2)、甘四烷酸(24:1)(周洪生，2002 ；Lambert,2001)。玉米油中最具有商品价值的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分别为软脂酸(16:0)、硬 脂酸(18:0)和油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)，而决定玉米油质量的因素主要为亚油酸的含量以及油酸与亚油酸的比值。玉米含油量是由多基因控制的数量性状，具有较高的遗传力。玉米含油量的广义遗传力一般为O. 74 O. 98，而软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸的广义遗传力分别为O. 39,0. 72,0. 85,0. 83,0. 67 (Alrefai et al，1995)。在玉米含油量的遗传方差中，加性方差是主要方差(刘仁东，1992 ;Miller et al，1981;Moreno-Gonzalez etal，1975)。与玉米含油量相关的基因有大胚面基因、含油量基因、不同脂肪酸含量基因等。最早的研究表明玉米籽粒含油量由20 40个基因控制(Winter，1929 ；Student, 1933,1934 ；Sprague et al, 1948) oDudley和Lambert (1992)利用 IHO不同世代的品系，估计在选择28轮、76轮、90轮，控制含油量的位点分别为33、20 40、60个。而最近的玉米含油量QTL研究表明控制玉米含油量大约有50个座位(Laurie et al，2004 ;Clark etal, 2006)。Poneleit和Alexander (1965)认为高油玉米的亚油酸和油酸的比率由Iinoleicacidl (Inl)基因控制，并于1976年利用常规的方法将此基因定位在第6染色体的长臂上。Alrefai等(1995)用QTL的方法验证了这个结果。但de la Roche等(1971)认为控制油酸与亚油酸含量的基因座位多于2个位点。Plewa (1975)，Shadley (1980)，Widstrom和Jullum(1984)将与油酸/亚油酸有关的基因分别定位在2L、4L、1S、5L。脂肪酸的生物合成途径是乙酰辅酶A—月桂酸一十四酸一软脂酸一硬脂酸一油酸一亚油酸(Ohlrogge, 1995,1997 ;Buchanan, 2002)。由此可见，在油酸和亚油酸之间、饱和和不饱和脂肪酸之间存在着相互转化关系。Poneleit和Alexander (1965)的研究表明，软脂酸、油酸和亚油酸的转化是由高亚油酸单基因控制的。Widstrom等(1975)证明，油酸和软脂酸含量的不同是由单基因控制的，而决定亚油酸含量的基因为两个或多个，一个呈部分显性，另一个为隐性。Wright等(1995)把EMS诱变B73得到的高油单隐性突变体Olcl定位在第一染色体的长臂上。近年来，随着模式植物全基因组测序的完成，植物基因组学的研究已经呈现出由简单质量性状向复杂的数量性状转移的趋势，特别是大量SNP标记的开发以及生物信息学的迅猛发展，应用关联分析方法发掘植物数量性状基因已成为目前国际植物基因组学研究的热点之一。关联分析(Association Analysis),又称连锁不平衡作图(LDMapping)或关联作图(Association Mapping),是一种以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法(Flint-Garcia et al，2003)。跟连锁分析相比，关联分析具有以下优点(I)连锁分析需要构建基于两亲本杂交的Fl衍生群体(F2、BC、RIL等)，关联分析可用现有的群体，大大缩短研究年限；(2)连锁分析每次只能分析同一位点的2个等位基因，关联分析可以同时分析同一位点的多个等位基因；(3)连锁分析所用的群体小，加上群体来自两亲本，在群体内发生的重组次数少，这样往往导致连锁作图的精度低，例如玉米的作图精度一般为10 30cM(Salvi，2005 ;Flint_Garcia，2005，而关联分析的精度可大大提高，例如玉米自交系的精度为1500bp，达到单基因水平(Remington，2001)。总之，关联分析数量性状的剖分在精度和研究时间上是优于连锁分析的
发明内容
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的AM508群体由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成(所述的群体材料，均为常见的玉米市售材料，可通过常规商业渠道购买得到)。候选基因重测序材料155份我国骨干自交系材料。从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系，构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始数据。全基因关联分析以AM508群体为材料，利用IlluminaMaizeSNP50BeadChip对56，110个位点进行了基因型检测。从授粉15天后的508份材料中随机选择的368份材料则构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序，每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始序列。使用高质量的SNP，分别对这两个群体采用线性混合模型校正群体层化效应和亲缘关系后与油脂相关性状进行了高密度标记的全基因组关联分析。为了综合这两个群体的结果，本研究研究使用了统一的阈值筛选显著性的位点(建议水平显著性阈值为1/N =
I.78X10-6以及5%基因组显著性阈值为0. 05/N = 8. 94X10-8)。为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点间两两的连锁不平衡，过滤掉r2小于0. 02的标记。在定位到的单一的显著性信号中。利用368份材料关联分析结果发现，位于玉米基因组chr3. S_178136002的SNP位点，突变为G/C，其中G为主要等位基因，C为最小等位基因，最小等位基因频率为0. 06，该位点与玉米油分含量显著关联该位点与玉米功能候选基因(GPAT)紧密连锁。
具体实施例方式AM508群体由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成，已在参考文献 Yang, X. H. et al. Characterization of a global germplasmcoI lection and itspotential utilization for analysis of complex quantitativetraits in maize. Mol.Breeding 121，417-431 公开过。 候选基因重测序材料155份我国骨干自交系材料，已在参考文献Yang,X. H. et al.Genetic analysis and characterization of a new maizeassociationmapping panel for quantitative trait loci dissection. Theor. Appl. Genet. 121，417-431 (2010a).公开过。转录组测序材料从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系，构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序。每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始数据。表型变异AM508群体包含508个自交系(其中包括35个高油品系)油含量相关的变异丰富，软脂肪酸含量差异2. 3倍，硬脂肪酸含量差异达8倍。软脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亚麻油酸(18:2,51. 2% )和亚麻酸(18:3,1.4%)这五种脂肪酸占98. 4%的油含量。4个环境联合检测发现十个油份相关性状的遗传力均在90%以上。全基因关联分析 以AM508 群体为材料,利用 Illumina MaizeSNP50BeadChip 对 56，110 个位点进行了基因型检测。从授粉15天后的508份材料中随机选择的368份材料则构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序，每个个体的reads数为73. 8±0. 7百万碱基，共产生了 2445. 9Gb的原始序列。研究使用了 106万个高质量的SNP，分别对这两个群体采用线性混合模型校正群体层化效应和亲缘关系后与油脂相关性状进行了高密度标记的全基因组关联分析。为了综合这两个群体的结果，本研究研究使用了统一的阈值筛选显著性的位点(建议水平显著性阈值为1/N= I. 78X10-6以及5%基因组显著性阈值为0. 05/N = 8. 94Χ1(Γ8)。为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点间两两的连锁不平衡，过滤掉r2小于O. 02的标记。在定位到的单一的显著性信号中，有若干个位点位于或者临近于(50Kb)被前人证实报道过的已知基因内，它们在本研究中再次得到了验证。与已知的油脂代谢相关基因较远的关联位点很可能是与油脂代谢相关基因紧密连锁，则距离最近的油脂代谢基因很可能就是本研究的候选基因。利用368份材料关联分析结果发现，位于玉米基因组chr3. S_178136002的SNP位点，突变为G/C，其中G为主要等位基因，C为最小等位基因，最小等位基因频率为O. 06，该SNP位点解释了 7. 08%的表型变异，该位点与玉米油分含量显著关联该位点与玉米功能候选基因(GPAT)紧密连锁。连锁分析群体利用3个群体进行连锁分析，高油玉米自交系By804与普通玉米自交系B73衍生的重组自交系，可参考文献Yang, X. H. et al. Major and minor QTLand epistasis contribute to fatty aci(!compositions and oil concentration inhigh-oil maize. Theor. Appl. Genet. 120，665-678 (2010c) ；K22 与单 340 及 K22 与 C17 组配的F2群体于2009年在北京种植，自交获得F3群体。分别获得包含237个家系的K22/单340F2:3群体和218个家系的K22/C17F2:3群体，进行表型鉴定。这两个F2:3群体种植于海南的三亚和湖北的武汉获得F2:4群体。利用包含1536个SNP标记的GoldenGate芯片(Illumina，San Diego, CA，USA)对家系及其亲本进行基因型鉴定。可参考文献Yan，J.B.et al. High-throughput SNP genotyping with the GoldenGate assay in maize. Molbreeding 25,441-451 (2010)。利用Mapmaker3. 0软件构建连锁图,米用复合区间作图法进行QTL定位。表型变异AM508群体包含508个自交系(其中包括35个高油品系)油含量相关的变异丰富，软脂肪酸含量差异2. 3倍，硬脂肪酸含量差异达8倍。软脂肪酸(16: 0，15. 7% )、硬脂肪酸(18:0,2. 1%)、油酸(18:1，28.0%)、亚麻油酸(18:2,51. 2% )和亚麻酸(18:3,1.4%)这五种脂肪酸占98. 4%的油含量。关联分析结果与连锁分析结果具有高度一致性。连锁分析结果如下
.表型贡
一T 群体.性加性效显性效二 i·
候选基因色置信区间(Mb)a^ dk F-Fr献率
__ (%)
I油-__
GRMZM2G08312 份
3 169.2-176.4-187.9A -0.01 0.22 9.20
95(BJ)含
3 量
176.3-176.4-196.4/176.3-10.20/0. 0.09/0. 5.16/4.
(BJ,
76.4-187.01018 54
_WH)_a候选基因所在的QTL的置信区间在B73参考基因组(V2 5b. 60)上的物理位置。b 群体 1、2、3 代表 By804/B73 的 RIL 群体，k22/ 单 340 群体和 C17/K22 群体。
权利要求
1.一种与玉米GPAT基因连锁的SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点与玉米油份含量相关，与玉米甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因紧密连锁，位于玉米参考基因组(ymimaizesequence. org, 5a. 60 版)chr3. S_178136002 上，该位点突变为 G/C。
2.如权利要求所述的SNP位点的应用，包括以下步骤 a)由473个普通玉米自交系和35个高油玉米自交系组成AM508群体； b)从授粉15天后的AM508份自交系中随机选择368份自交系,构建200bp大小插入片段文库，采用90bp末端配对的RNA测序技术进行转录组测序； c)利用3个群体进行连锁分析高油玉米自交系By804与普通玉米自交系B73衍生的重组自交系，利用包含1536个SNP标记的GoldenGate芯片对家系及其亲本进行基因型鉴定，利用Mapmaker3. O软件构建连锁图，采用复合区间作图法进行QTL定位； d)结合F2、F2:3两个世代群体油份含量的测定结果，利用软件QTLcartographer V2. 5，采用复合区间作图法筛选与油份含量紧密连锁的QTL位点；筛选到在F2和F2:3两个世代均能稳定表达的油份含量主效QTL。
3.如权利要求I或2所述的玉米油份含量相关的SNP位点在玉米育种的应用。
全文摘要
本发明涉及一种与玉米GPAT基因连锁的SNP位点及其应用，属于植物分子育种领域，该SNP位点位于玉米参考基因组(www.maizesequence.org，5a.60版)chr3.S_178136002，该位点与玉米GPAT基因(GRMZM2G083195)紧密连锁，并且与玉米油份含量显著相关。可将该分子标记用于玉米品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系油份含量的大小。本发明分子标记，可以应用于不同遗传背景下的高油玉米育种，可以用于玉米遗传改良；该方法和标记在玉米育种领域具有广阔的应用前景。
文档编号A01H1/04GK102899324SQ20121044468
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者严建兵, 杨小红, 李建生, 李慧 申请人:华中农业大学