专利名称：诱导ot型百合花药获得(双)单倍体植株的方法及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导OT型百合花药获得(双)单倍体植株的方法及其培养基，通过OT百合花药培养得到再生单倍体或双单倍体(二倍体)植株，属于植物组织培养和花卉育种领域。
背景技术：
单倍体是指具有配子染色体数的个体或组织，仅有一个染色体组所构成的个体称为单倍体，单倍体经过自然或人工加倍后即可得到双单倍体。单倍体、双单倍体材料在植物育种和遗传基础理论研究中都具有重要的意义，可用于分子标记选择和遗传图谱绘制，是转基因最佳的受体群体。在育种实践中，利用双单倍体育种技术不仅可以快速获得纯系，缩 短育种周期，而且可以得到更多更广泛的变异，特别是隐性性状更容易得到表现，从而丰富育种基础材料的类型，加速育种进程。目前获得单倍体的一种主要手段是离体花药培养获得单倍体再生植株。一般通过花药培养获得再生植株有二种发生方式，即胚状体发育途径(直接发育途径)和愈伤组织发育途径(间接发育途径)。第一种途径通常是由花药内部的小孢子直接发育而来，即由具有单套染色体的细胞发育而来，所得到的再生植株几乎全部为单倍体或双单倍体。第二种途径通常是由花药壁细胞直接发育得到愈伤组织，即由具有二套染色体的体细胞发育而来，所得到的再生植株大多与亲本具有相同的基因组成，所以这一途径通常是不希望出现的。百合(Lilium spp.)为百合科百合属多年生球根花卉植物，是世界著名的商品花卉之一，在鲜切花市场占有十分重要的地位。近年来，OT型百合(东方百合与喇叭百合的杂交种)逐渐成为国内花卉市场上较为流行的百合类型。目前百合的新品种越来越多，对经济性状优良的品种的研究和利用逐渐成为百合育种工作的重点。百合杂交育种主要存在两个问题，一是育种周期长，从种子播种到开花要经历2-3年时间，生长周期长；二是种间杂交困难。百合杂交育种普遍存在不亲和性的问题，不仅受精困难，而且受精后很难获得种子，因此单倍体育种技术理论上可以成为百合育种的另一种主要手段。所以百合的单倍体育种技术研究具有重要的生产意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种诱导OT型百合花药获得(双)单倍体植株的培养基。本发明提供的诱导培养基用于获得OT型百合单倍体植株或双单倍体(二倍体)植株。一种诱导OT型百合花药获得(双)单倍体植株的培养基，是在B5培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、蔗糖和琼脂，得到的固体培养基，其中，6-BA的终浓度是I. 5 2. 5mg/l，2，4-D的终浓度是I. 5 2. 5mg/l，蔗糖的终浓度是6(Tl00g/l，琼脂的终浓度是l(Tl5g/l。优选的，6-BA的终浓度是2mg/l，2，4-D的终浓度是2mg/l，蔗糖的终浓度是90g/l，琼脂的终浓度是14g/l。本发明培养基的完整配方(组成和终浓度)
硝酸钾25_mg/l
硫酸铵134mg/I
磷酸 + :M 钠130.44mg/l
硫酸镁121.56mg/l
尤水&(化钙113.23mg/l· 碘化 If0.75mg/l
爾酸3mg/l
水硫酸鐘10mg/l
七水硫酸锌2mg/L
—:水 11酸_0.25mg/l
--ft 水硫酸铜0.025mg/l
六水氯化钴0.025mg/l
乙........胺四乙酸........37.3mg/1
七水硫酸亚铁27.8mg/l
肌醇I OOmg/!
Ife酸硫K素10mg/l
盐酸吡哆醇Imgfl
烟酸lmg/1
6-苄氨基腺嘌時 2mg/l 2,4-；:氣苯氣乙酸 2mg/l 蔗糖90g/l
琼脂14g/l本发明的另一目的是提供一种诱导OT型百合花药获得(双)单倍体植株的方法，采
用上述诱导培养基获得OT型百合单倍体植株或双单倍体(二倍体)植株。一种诱导OT型百合花药获得(双)单倍体植株的方法，包括以下步骤I)将OT型百合的花蕾置于低温、黑暗条件下f 3天；2)将OT型百合的花药置于上述本发明的诱导培养基上，经过热激处理，培养，最
终得到单倍体或者双单倍体(二倍体)植株。步骤(I)中，低温为4 6°C，黑暗条件是指密闭、不透光的环境，以I天最好。步骤(2)中，所述的花药先经过预处理，即将花蕾剥去萼片和花瓣，然后将花药用
75%酒精浸泡45飞O秒，之后用2. 5wt%次氯酸钠溶液浸泡12 15分钟，最后用无菌去离子水冲洗。将预处理后的花药放在诱导培养基上，然后对花药进行热激处理，所述的热激处理(胁迫处理)为将花药置于37°C及黑暗条件下放置7天，经过热激处理后，于25°C培养f 2个月。 本发明的(双)单倍体诱导培养基可以有效地诱导OT型百合花药分化和再生，不定芽发生率可高达60%。本发明通过对OT型百合花药进行离体培养，诱导花药内部的小孢子发育为完整的单倍体或者双单倍体植株，为单倍体育种提供多种纯合的育种材料，创造了更多地新型种质，提高了选择和育种效率。
图I为本发明由花药内部小孢子经体胚途径形成的不定芽。图2为本发明将不定芽转移到成苗培养基后长大的成苗。图3-1和图3-2分别为本发明获得的单倍体植株和二倍体植株的流式细胞仪检测结果。图4为本发明再生植株根尖染色体计数(单倍体)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。一、OT型百合单倍体植株的诱导方法I、取材采集处于单核靠边期的OT型百合的花蕾，处于这个时期的花蕾形态特征为花蕾呈绿色，包裹紧密，花药乳白色，略泛青；镜检可见绝大部分小孢子处在单核靠边期。基因型不同，蕾长不同，一般蕾长在2. 5^3. 5厘米之间。2、花药的预处理将采来的花蕾置于密闭容器内，置于4_6°C冰箱中1-2天。然后剥去萼片和花瓣，在超净工作台中，用75%酒精处理45飞O秒，之后用2. 5%次氯酸钠消毒12 15分钟，然后用无菌水冲洗3次，每次2分钟。3、花药的胁迫处理本实验采用的胁迫处理方式为热激处理，即将花药于37°C及黑暗条件下放置7天。4、花药胚状体的获得将预处理后的花药腹面向下平放在诱导培养基上，经过胁迫处理后，于25°C培养
1-2个月。如图I所示为本发明由花药内部小孢子经体胚途径形成的不定芽(再生芽)。上述的诱导培养基是在B5培养基中添加6_BA、2，4_D、蔗糖和琼脂得到的固体培养基其中6-BA的终浓度是2mg/l，2，4_D的终浓度是2mg/l，蔗糖的终浓度是90g/l，琼脂的终浓度是14g/l ；pH为6. 0，B5基本培养基的溶剂是水。表I本发明采用的B5培养基的完整配方(不含蔗糖和琼脂)化学式终浓度mg/1
大量元素
硝酸钾KNO^2500
硫酸铵(NH4)2SO4134
磷酸二氢纳KH2PO4130.44
硫酸镁MgSO4121. 56
无水氯化辛丐CaCl2113.23微量元素
碘化钾KI075
硼酸W3
一水硫酸猛MnSO4 · H2O10
七水硫酸锌ZnSO4 · 7H202
二水钼酸纳Na2MoO4 · 2H20025
五水硫酸铜CuSO4 · 5H20O. 025
六水氯化钴CoCl2 · 6H20O. 025
乙二胺四乙酸二纳Na2-EDTA37 3
七水硫酸亚铁FeSO4 · 7Η202 Γ8有机成分
肌醇100
盐酸硫胺素V10
盐酸吡哆醇
烟酸
在上述的B5培养基中添加6_BA、2，4_D、蔗糖和琼脂得到的本发明的培养基，见表2。表2本发明培养基的配方
权利要求
1.一种诱导OT百合花药获得单倍体或双单倍体植株的培养基，其特征在于在B5培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和琼脂，得到固体培养基，其中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度是I. 5^2. 5mg/l,2, 4-二氯苯氧乙酸的浓度是I. 5^2. 5mg/l，蔗糖的浓度是6(Tl00g/l，琼脂的浓度是l(Tl5g/l。
2.根据权利要求I所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的培养基，其特征在于6_苄氨基腺嘌呤的浓度是2mg/l，2，4- 二氯苯氧乙酸的浓度是2mg/l，蔗糖的浓度是90g/l，琼脂的浓度是14g/l。
3.根据权利要求I所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的培养基，其特征在于所述B5培养基的组成和浓度如下硝酸押2500mg/I硫酸铵134mg/l·磷酸 钠130.44mg/l.硫酸镁12L56mg/l无水氯化ff113.23mg/l碘化钾0.75mg/l 删酸3mg/l--·水硫酸償I Omg/I 七水硫酸锌2mg/l _一:水钔酸钠0,25mg/l Il水硫酸铜0.025nig/l六水&[化钻0.025mg/l乙:胺岡乙 ft: 二钠 37.3mg/l七水硫酸亚铁27.8mg/丨肌醇〗00mg/l ft酸硫胺素IOmgZl ft酸吡哆醇lmg/1 烟酸lmg/1。
4.一种诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，包括以下步骤 1)将OT型百合的花蕾置于低温、黑暗条件下f3天； 2)然后将OT型百合的花药置于权利要求1-3中任一项所述的培养基上，经过热激处理，培养，最终得到单倍体或者双单倍体植株。
5.根据权利要求4所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，其特征在于所述低温的温度为4 6°C。
6.根据权利要求4所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，其特征在于所述的花药先经过预处理，将花药用75%酒精浸泡45飞O秒，之后用2. 5wt%次氯酸钠溶液浸泡12 15分钟，最后用无菌水冲洗。
7.根据权利要求4所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，其特征在于所述的热激处理为将花药置于37°C及黑暗条件下放置7天。
8.根据权利要求4所述的诱导OT型百合花药获得单倍体或双单倍体植株的方法，其特征在于所述的培养为经过热激处理后，于25°C培养f 2个月。
全文摘要
本发明涉及一种诱导OT型百合花药获得(双)单倍体植株的方法及其培养基，属于植物组织培养和花卉育种领域。首先将OT型百合的花蕾置于低温、黑暗条件下1~3天；然后将OT型百合的花药置于培养基上，经过热激处理，培养，最终得到单倍体或者双单倍体植株；所用的培养基为在B5培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、蔗糖和琼脂，得到的固体培养基，其中，6-苄氨基腺嘌呤的浓度是1.5~2.5mg/l，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度是1.5~2.5mg/l，蔗糖的浓度是60~100g/l，琼脂的浓度是10~15g/l。本发明为单倍体育种提供多种纯合的育种材料，提高了育种选择和育种效率。
文档编号A01H1/08GK102939900SQ20121047941
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者赵泓, 王贤, 周涤, 熊敏, 卫尊征 申请人:北京市农林科学院