专利名称：一种玉米胚三重接种转基因技术的制作方法
技术领域：
一种玉米胚三重接种转基因技术，属于生物技术领域，更具体的说是一种通过对玉米种胚进行针刺接种并辅以接种液真空浸泡、接种液常压浸泡强化侵染的转基因接种技术。
背景技术：
玉米转基因技术是采用生物技术方法改造玉米品种，培育具有高产、优质、抗虫、抗病等优良特性新品种的最为有效的技术手段。目前玉米的转基因一般都采用农杆菌侵染愈伤的方法，该方法先要进行愈伤诱导，然后农杆菌侵染，再用组织培养的方法获得转基因苗。由于玉米组织培养难度较大，因此该方法的效率较低，应用困难。
发明内容
本发明的目的是采用一种新的技术路线进行玉米转基因的接种处理，以期达到方法易行，操作简单，费用低廉，效果良好的技术效果。本发明是这样实现的1.一种玉米胚三重接种转基因技术，其特征在于，对玉米种子的胚进行针刺接种、抽真空浸泡接种、常压浸泡接种等复合处理措施，使之充分侵染。它包括①玉米种子消毒、②无菌水浸种、③刺胚接种、④接种液抽真空浸泡接种、⑤接种液常压浸泡接种、⑥暗箱培养6个步骤。2.玉米种 子消毒选取饱满的玉米种子顺序用乙醇、84消毒液消毒，之后用灭菌水洗尽消毒液。3.无菌水浸种将种子转入灭菌水中30°C浸泡24小时，使种子充分吸胀并萌动。4.刺胚接种将萌动的种子取出置于已灭菌的培养皿中，用钢针蘸取0D_为O. 6的已转入双元载体的农杆菌接种液扎刺胚芽和胚根。5.接种液抽真空浸泡接种将刺完的种子放在含有烟草叶提取物和400 μ mol/L乙酰丁香酮的已转入双元载体的农杆菌接种液中浸泡，22°C抽真空(-0.1MPa) 30min。6.接种液常压浸泡接种气压恢复正常后，将种子放在接种液中继续浸泡3hr。7.暗箱培养将处理好的种子置于发芽盒中，22°C恒温培养箱暗培养3天即可进行转基因植株的鉴定。本发明的有益效果一种玉米胚三重接种转基因技术避开了传统的农杆菌侵染愈伤后再组织培养的技术路线，与现有方法相比有以下几个优点第一，所需时间减少2-3个月。农杆菌侵染法从愈伤诱导到获得转基因植株一般需要3-4个月，本方法从接种开始到鉴定完成只需一个星期；第二，本方法对技术要求不高。玉米组织培养难度大，愈伤易褐化，因此对实验者的技术和实验的条件要求高，而本方法不涉及组织培养过程，因此大大降低了技术难度和实验条件；第三，本方法所需费用较少，现有的转基因技术需要借助植物组织培养技术，而组织培养的各种试剂较贵，而且需要建立组培室并配备大量的仪器设备才能开展工作，而本发明免除了这部分的花费，节约了大量资金。
具体实施例方式
下面结合具体实例对本发明进行进一步的描述。实施例1 :将1305GFP载体转入到玉米自交系植株中1.玉米种子消毒选取400粒饱满的玉米自交系N108首先用70%乙醇消毒3min，然后用84消毒液消毒40min，消毒结束后用灭菌水漂洗3_4次，完全洗净消毒液。2.无菌水浸种将N108种子转入灭菌水中30°C浸泡24小时，充分吸胀并萌动。3.刺胚接种将萌动的N108种子取出置于已灭菌的培养皿中，用钢针蘸取OD6c 为
O.6的已转入1305GFP双元载体的农杆菌接种液刺胚芽和胚根。5.接种液抽真空浸泡接种将刺完的种子放在含有烟草叶提取物和400 μ mol/L乙酰丁香酮的农杆菌接种液中浸泡，22°C抽真空(-0.1MPa) 30min。6.接种液常压浸泡接种气压恢复正常后，将种子放在接种液中继续浸泡3hr。7.暗箱培养将处理好的N108种子置于发芽盒中，22°C恒温培养箱暗培养3天即可进行转基因植株的鉴定。通过以上步骤在114株N108幼苗中获取了 3株转基因植株。历时8天，比现有的转基因技术减少80天左右。实施例2 :将1305GFP载体转入到杂交玉米的植株中1.玉米种子消毒选取400粒饱满的玉米杂交种凤玉13首先用70%乙醇消毒3min，然后用84消毒液消毒40min，消毒结束后用灭菌水漂洗3_4次，完全洗净消毒液。2.无菌水浸种将凤玉13种子转入灭菌水中30°C浸泡24小时，充分吸胀并萌动。3.刺胚接种将萌动的凤玉13种子取出置于已灭菌的培养皿中，用钢针蘸取0D_为O. 6的已转入1305GFP双元载体的农杆菌接种液刺胚芽和胚根。4.接种液抽真空浸泡接种将刺完的种子放在含有烟草叶提取物和400 μ mol/L乙酰丁香酮的农杆菌接种液中浸泡，22°C抽真空(-0.1MPa) 30min。5.接种液常压浸泡接种气压恢复正常后，将种子放在接种液中继续浸泡3hr。6.暗箱培养将处理好的凤玉13种子置于发芽盒中，22°C恒温培养箱暗培养3天即可进行转基因植株的鉴定。通过以上步骤共获得73株玉米幼苗，经检测，其中I株为转基因植株。历时8天，比现有的转基因技术减少80天左右。
权利要求
1.一种玉米胚三重接种转基因技术，其特征在于，对玉米种子的胚进行针刺接种、抽真空浸泡接种、常压浸泡接种等复合处理措施，使之充分侵染，它包括①玉米种子消毒，②无菌水浸种，③刺胚接种，④接种液抽真空浸泡接种，⑤接种液常压浸泡接种，⑥暗箱培养6个步骤。
2.根据权利要求1所述的转基因技术，其特征在于，所述的玉米种子消毒的做法是选取饱满的玉米种子顺序用乙醇、84消毒液消毒，之后用灭菌水洗尽消毒液。
3.根据权利要求1所述的转基因技术，其特征在于，所述的无菌水浸种的做法是将种子转入灭菌水中30°C浸泡24小时，使种子充分吸胀并萌动。
4.根据权利要求1所述的转基因技术，其特征在于，所述的刺胚接种的做法是将萌动的种子取出置于已灭菌的培养皿中，用钢针蘸取0D600为O. 6的已转入双元载体的农杆菌接种液扎刺胚芽和胚根。
5.根据权利要求1所述的转基因技术，其特征在于，所述的接种液抽真空浸泡接种的做法是将刺完的种子放在含有烟草叶提取物和400ymol/L乙酰丁香酮的农杆菌接种液中浸泡，22 °C 抽真空(-O. lMPa)30min。
6.根据权利要求1所述的转基因技术，其特征在于，所述的接种液常压浸泡接种的做法是气压恢复正常后，将种子放在接种液中继续浸泡3hr。
7.根据权利要求1所述的转基因技术，其特征在于，所述的暗箱培养的做法是将处理好的种子置于发芽盒中，22°C恒温培养箱暗培养3天即可进行转基因植株的鉴定。
全文摘要
一种玉米胚三重接种转基因技术，属于生物技术领域。将玉米种子消毒、浸泡后进行刺胚接种、接种液抽真空浸泡接种、接种液常压浸泡接种，使之充分侵染，再对种子进行暗箱培养，促进农杆菌侵染并在体内大量增殖扩散，3天后即可进行转基因鉴定。本方法简便，操作容易，费用低廉。
文档编号A01H5/00GK103031333SQ20131001903
公开日2013年4月10日 申请日期2013年1月19日 优先权日2013年1月19日
发明者王丽华, 李杰勤, 刘正, 王茂辉, 万海波, 周青 申请人:安徽科技学院