一种滁菊离体NaN₃诱变育种技术的制作方法

专利名称：一种滁菊离体NaN₃诱变育种技术的制作方法
技术领域：
一种滁菊离体NaN3诱变育种技术，属于生物技术领域中的化学诱变育种技术。
背景技术：
i除菊 Dendranthema morifolium ‘Chuju，，菊科 Asteraceae,菊属 Chrysanthemum多年生草本植物，是全国四大药菊之一，安徽著名地道药材，以花入药，是一味重要的中药，属药、茶兼用佳品。具有清热解毒、舒筋活血、护肝明目，增强人体免疫功能。对高血压、冠心病、动脉硬化疗效显著。近年研究发现滁菊对癌症等有良好的预防作用，对糖尿病有明显的治疗作用。滁菊已经成为当地支柱产业，在滁州地区大面积种植，是重要的中草药及经济作物。然而，由于长期的扦插无性繁殖，品种退化及病虫害严重，采用常规育种方法无法进行品种改良与更新，同时，在自然条件下，芽变的几率很低，优异变异的几率更低，远不能适应菊农对品种产量和品质的要求，为了提高滁菊品种的典型性，有关菊花的组织培养脱毒快速繁殖虽然已有不少报道，但是在滁菊新品种的选育尚未见报道。菊花诱发突变的方法很多，包括物理诱变和化学诱变两大类，主要集中在采用辐射诱变的方法培育菊花新品种，杨保安等(1996)采用60Coy射线辐射与组培相结合育成‘金光四射’等14个菊花新品种；王彭伟等(1996)利用菊花叶柄组培能产生单细胞植株，用60Coy射线辐照对切花菊进行单细胞突变育种，选育出11个新品种。郭安熙等(1997)60Coy辐射与组培相结合，可大幅度提高细胞突变的显现机率。林祖军等(2000)烟台市农科院应用电子束辐射菊花组培苗诱变育种，获得花色、花型、花瓣变异后代。日本学者(2003)用低能重离子注入、激光等在菊花上应用，培育出6个菊花新品种。化学诱变剂包括烷化剂、碱基类似物、吖啶类(嵌入剂)、无机或简单有机类化合物和生物碱等，采用化学诱变的方法应用于菊花育种的较少，陈发棣等(2002)和祝朋芳等(2010)分别采用秋水仙素诱变菊花，产生染色体数目变异的突变体。所获得的突变体大都是染色体数目增加，使开花期推迟，因而不能在滁菊品种改良中应用。

在滁菊育种中，本发明采用茎段、茎尖或叶片为外植体，借助于组织培养技术，在分化增殖的同时，利用NaN3处理诱导滁菊突变体的产生，通过碱基替换和染色体的断裂愈合修复错误，产生优良变异单株，以提高其菊花产量和品质，克服滁菊长期无性繁殖出现的品种退化和品种过于单一等问题，这对扩大滁州地道药材的种植面积，提高滁菊的种植收入，同时，进行滁菊品种的复壮、改良与创新具有重要意义。

发明内容
一种滁菊离体NaN3诱变育种技术发明的目的是通过滁菊茎段、茎尖或叶片为外植体，利用离体培养体系，诱导产生不定芽，在增殖培养基上，通过添加一定浓度的NaN3进行化学诱变处理，使DNA序列发生碱基替换，导致单链断裂和愈合修复错误，使滁菊产生变异，通过生根处理形成完整植株，结合田间筛选和室内鉴定，获得优良滁菊新品种，它不仅克服了长期种植滁菊出现的退化问题，而且可缩短育种年限，快速获得滁菊优良突变体。
一种滁菊离体NaN3诱变育种技术是这样实现的
一种滁菊离体NaN3诱变育种技术，其特征在于所述的诱变育种技术的核心是滁菊的组织培养和NaN3的化学诱变。其过程包括①滁菊的离体培养苗的制备、②NaN3化学诱变、③诱变苗的促壮生根、④炼苗和田间栽培、⑤田间选择和室内鉴定。其具体步骤如下
①离体培养苗的制备
将滁菊幼茎和嫩叶用中性洗衣粉洗涤并冲洗干净，然后进行表面消毒，将消毒后的幼茎用无菌水漂洗4-5次，将带腋芽茎段或嫩茎尖外植体接种于MS+NAA O.1mgL^1培养基，每瓶接种外植体2-3个，20-30天可继代一次，形成大量的无菌苗。或将嫩叶外植体接种于丛芽分化培养基MS+TDZ O. 1-0. 2mgL-1+ NAAO. 1-0. 2mgL_1或MS+KT3-411^171+NAAO. 1-0. 4mgL_1,培养 40_50d 形成丛芽；
②NaN3化学诱变
选择生长15d-20d的无菌苗切成带腋芽茎段或剥离茎尖接种于含有NaN3诱变剂的MS+TDZ O. 1-0. 2mgL_1+NAA0. 1-0. 2mgL_1 或 MS+KT 3-4mgL_1+NAA0. 1-0. 4mgL_1 丛芽分化培养基上，处理35d-45d，使部分茎尖、腋芽或茎段基部形成丛芽；
③诱变苗的促壮生根
将诱变处理形成的丛芽转移到MS+NAA O.1mgr1的壮苗培养基上，培养15_20d形成壮苗，将壮苗切成带腋芽茎段接种在1/2MS+NAA O.1mgr1的培养基上生根培养7_10d ；
④炼苗和田间栽培
将生根苗移栽到细沙育苗盘中，炼苗30-40d，而后定植到大田，进行常规管理；
⑤田间选择和室内鉴定
在开花期根据育种目标要求，在田间选择花朵性状优良的植株，并在室内进行鉴定。上述方法还具有以下特征1.步骤①中所述的表面消毒的方法为75%乙醇处理30-90sec，然后用O. l%HgCl2溶液灭菌 6-lOmin。2.步骤①中所述的表面消毒的最佳方法为75%乙醇处理60sec，然后用O. l%HgCl2 溶液灭菌 8min。3.步骤②在增殖培养基中添加4-lOmg!/1 NaN3处理35_45d。4.步骤②中在增殖培养基中添加NaN3的最佳处理浓度为6-8mgL_l，处理40_45d。5.步骤①、②和③所述的培养基内琼脂粉的添加量为O. 45%。6.步骤①、②和③所述离体培养的条件是培养温度23±2°C，每天光照12h，光照强度 1500-2000Lx。本发明所述滁菊突变体诱变体系的方法优点在于
诱变材料的选择，滁菊为多年生草本植物，直接在田间进行诱变，条件难以控制，即使形成嵌合体也很难得到表现，本发明利用在分化增殖过程中胚性细胞、胚性愈伤组织或不定芽为诱变材料，有利于突变体再生植株的形成，提高诱变效率，拓展选择范围，降低筛选
工作量。诱变剂的选择，NaN3是一种点突变的化学诱变剂，其与DNA的作用方式是碱基替换，使DNA单链断裂和染色体的断裂愈合修复错误，从而导致点突变的产生。NaN3易透过膜进入细胞内，具有诱变效率高、Ml生理损伤小、毒性低、残效时间适中(20-30天)等优点，是一种安全、高效的化学诱变。诱变方法的选择，本发明利用组织培养技术，在分化增殖培养基中添加一定浓度的NaN3诱发胚性细胞或愈伤组织、腋芽、不定芽突变，有利于NaN3进入细胞、组织和器官，利用该诱变剂残效期短的特性，连续诱变，不需要进行继代直接形成丛芽后，再依次转接到壮苗和生根培养基形成完整植株。操作程序简便、诱发突变频率高、效果好。


图1为发明叶片外植体诱导丛芽图。图2为本发明茎段基部诱导丛芽图。图3为本发明正常分化增殖培养(左1:CK)与添加不同浓度NaN3丛芽分化比较图。图4为本发明丛芽壮苗图。图5为本发明滁菊生根图。图6为本发明原始品种(CK)与突变体花色、花型比较图。图7为本发明原始品种(CK)与 突变体不同发育时期花蕾POD同工酶的比较图。
具体实施例方式实施例1
①将滁菊幼茎用中性洗衣粉洗涤并冲洗干净，然后用75%乙醇表面消毒30-90seC，接着用O. l%HgCl2溶液灭菌6-10min，将消毒后的幼茎用无菌水漂洗4_5次，将带腋芽茎段外植体接种于MS+NAA O.1mgr1培养基，每瓶接种外植体2_3个，20_30d可继代一次，形成大量的无菌苗。②选择生长15d-20d的无菌苗切成带腋芽茎段种于MS+TDZ O. 1-0. 2mgr1+NAA. 01-O. 2mgL ^NaN3 4_8mgL 1 或 MS+KT 3_4mgL ^NAA. 01-0. 4mgL :+ NaN3 4_8mgL 1 丛芽分化培养基上，处理35d-45d部分茎尖、叶腋或茎段基部形成丛芽。③将诱变处理形成的丛芽转移到MS+NAA O.1mgL^1的壮苗培养基上，培养15_20d
培养壮苗。④将上述壮苗切成带腋芽茎段接种在1/2MS+NAA O. lmgL—1的培养基上生根，培养7-10d,移栽到细沙育苗盘中，炼苗30-40d，而后定植到大田，进行常规管理。⑤开花期的田间选择，可根据育种目标要求，选择无花心，全舌状花瓣的变异单株，入选率为3-5%，并进行产量和药用有效成分含量分析。实施例2
①将滁菊幼茎用中性洗衣粉洗涤并冲洗干净，然后用75%乙醇表面消毒30-90seC，接着用O. l%HgCl2溶液灭菌6-10min，将消毒后的幼茎用无菌水漂洗4_5次，剥离茎尖外植体接种于MS+NAA O.1mgL-1培养基，每瓶接种外植体2_3个，30_40d可继代一次，形成大量的
无菌苗。②选择生长15d-20d的无菌苗切成带腋芽茎段接种于MS+TDZ O. 1-0. 2mg^1+NAA. 01-0. 2mgL ^NaN3 4_8mgL 1 或 MS+KT 3_4mgL ^NAA. 01-0. 4mgL :+ NaN3 4_8mgL 1 丛芽分化培养基上，处理35d-45d部分茎尖、叶腋或茎段基部形成丛芽。③将诱变处理形成的丛芽转移到MS+NAA O.1mgL^1的壮苗培养基上，培养15_20d培养壮苗。④将上述壮苗切成带腋芽茎段接种在1/2MS+NAA O. lmgL—1的培养基上生根，培养7-10d,移栽到细沙育苗盘中，炼苗30-40d，而后定植到大田，进行常规管理。⑤开花期的田间选择，可根据育种目标要求，选择无花心，全舌状花瓣的变异单株，入选率为3-5%，并进行产量和药用有效成分含量分析。实施例3
a、将滁菊嫩叶用中性洗衣粉洗涤并冲洗干净，然后用75%乙醇表面消毒30-90seC，接着用O.1ffigCl2溶液灭菌6-10min，将消毒后的嫩叶用无菌水漂洗4_5次，将嫩叶切成O. 5X0. 3cm2 左右的小块，接种到 MS+TDZ O. 1-0. 2mgL_1+NAA. 01-0. 2mgr1+NaN3 4-8mgL_1 或MS+KT β-^Γ'+ΝΑΑ. 01-0. 4mgL-1+ NaN3 4-811^171丛芽分化培养基上，每瓶接种外植体2-3个，培养40-50d，叶片外植体20-30%形成丛芽。b、将丛芽无菌苗切成带腋芽茎段接种于MS+TDZ O. 1-0. 2mgr1+NAA. 01-0. 2mgL^+NaN3 4_8mgL 1 或 MS+KT 3-4mgL ^NAA. 01-0. 4mgL :+ NaN3 4_8mgL 1 丛芽分化培养基上，处理35d-45d部分茎尖、叶腋或茎段基部形成丛芽。C、将诱变处理形成的丛芽转移到MS+NAA O.1mgL^1的壮苗培养基上，培养15_20d
·培养壮苗。d、将上述壮苗切成带腋芽茎段接种在1/2MS+NAA O. lmgL—1的培养基上生根，培养7-10d,移栽到细沙育苗盘中，炼苗30-40d，而后定植到大田，进行常规管理。e、开花期的田间选择，可根据育种目标要求，选择无花心，全舌状花瓣的变异单株，入选率为3-5%，并进行产量和药用有效成分含量分析。
权利要求
1.一种滁菊离体NaN3诱变育种技术，其特征在于，在离体培养的条件下利用NaN3对滁菊进行诱变育种。
2.根据权利要求书I所述的诱变育种技术，其特征在于，所述的诱变育种过程包括① 滁菊离体培养苗的制备、②NaN3化学诱变、③诱变苗的促壮生根、④炼苗和田间栽培、⑤田间选择和室内鉴定，其具体步骤如下①离体培养苗的制备将滁菊幼茎和嫩叶用中性洗衣粉洗涤并冲洗干净，然后进行表面消毒，将消毒后的幼茎用无菌水漂洗4-5次,然后a)将带腋芽茎段或嫩茎尖外植体接种于MS+NAAO.1mgL-1培养基，每瓶接种外植体 2-3个，20-30天再继代一次，形成大量的无菌苗；b)或将嫩叶外植体接种于丛芽分化培养基MS+TDZO. 1-0. 2mgL-l+ NAAO. 1-0. 2mgL_l 或 MS+KT 3-4mgL-l+NAA0. 1_0. 4mgL_l，培养 40_50d 形成丛芽(图1)；②NaN3化学诱变选择生长15d-20d的无菌苗切成带腋芽茎段或剥离茎尖接种于含有NaN3诱变剂的 MS+TDZ O. 1-0. 2mgL-l+NAA0. 1-0. 2mgL_l 或 MS+KT 3-4mgL-l+NAA0. 1-0. 4mgL_l 丛芽分化培养基上，处理35d-45d，使部分茎尖、叶腋或茎段基部形成丛芽(图2、图3);③诱变苗的促壮生根将诱变处理形成的丛芽转移到MS+NAA O.1mgL-1的壮苗培养基上，培养15_20d形成壮苗(图4)，将壮苗切成带腋芽茎段接种在1/2MS+NAA O.1mgL-1的培养基上生根培养7_10d (图 5)；④炼苗和田间栽培将生根苗移栽到细沙育苗盘中，炼苗30-40d，而后定植到大田，进行常规管理；⑤田间选择和室内鉴定在开花期根据育种目标要求，在田间选择花朵性状优良的植株(图6)，并在室内进行鉴定(图7)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤①中所述的表面消毒的方法为75%乙醇处理30_90sec,然后用O. l%HgC12溶液灭菌6-lOmin。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的表面消毒的最佳方法为75%乙醇处理60sec,然后用O. l%HgC12溶液灭菌8min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤②中，在增殖培养基中添加4-10mgL-l NaN3 处理 35-45d。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤②中，在增殖培养基中添加NaN3最佳处理浓度6-8mgL-l，处理40-45d。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①、②和③所述的培养基内琼脂粉的添加量为O. 45%。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述离体培养的条件是培养温度 23±2°C，每天光照12h，光照强度1500-2000LX。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域中的化学诱变育种技术。尤其涉及一种滁菊离体NaN3诱变育种技术。首先利用滁菊的嫩茎、茎尖或叶片离体培养形成无菌苗；以无菌苗的茎尖和茎段为外植体，在增殖过程中采用叠氮化钠(NaN3)处理，诱发突变；将试管苗生根处理并移栽；最后于花期在田间选育优良的突变体。此方法能有效地克服无性繁殖植物品种改良的障碍和在自然条件下芽变频率低，突变范围小的约束，在很短的时间内获得优良突变体，诱变效率高，对具有药用和观赏价值的滁菊无性繁殖的遗传改良有重要价值。
文档编号A01H4/00GK103039369SQ20131002930
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月27日 优先权日2013年1月27日
发明者张子学, 许峰, 胡能兵, 周玉丽, 何克勤, 林平 申请人:安徽科技学院