Wrky转录因子多肽基因应用的载体和方法
【专利摘要】本发明揭示了分离的多聚核苷酸和多肽，用于提高植物耐旱性的重组DNA载体，含有这些重组DNA载体的植物或种子，以及利用这些重组DNA载体的方法。重组DNA载体含有植物中有功能的启动子和与之连接的多聚核苷酸，其中，所述的多聚核苷酸编码转录因子WRKY多肽。
【专利说明】WRKY转录因子多肽基因应用的载体和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物育种和遗传学，特别是，涉及用于提高植物耐旱性能的重组DNA载体。
_2] 发明背景
[0003]非生物胁迫是世界范围内引起作物减产的主要原因，每年会造成主要作物减产50% 以上(Boyer, J.S.(1982) Science218:443-448 ；Bray,E.A.等(2000) In Biochemistryand Molecular Biology of Plants, edited by Buchannan, B.B.等，Amer.Soc.PlantBiol.，pp.1158-1249)。干旱是所有非生物胁迫中影响作物产量最主要的因素，在植物生长发育阶段，干 旱会激活植物各种不同生理和发育变化。近年来，尽管对非生物胁迫响应的分子机制和植物耐旱性的遗传调控网络进行了广泛的研究(Valliyodan, B.和Nguyen,H.T.(2006)Curr.0pin.Plant Biol.9:189-195 ；ffang, ff.等(2003)Planta218:1-14 ;Vinocur, B.和 Altman, A.(2005) Curr.0pin.Biotechnol.16: 123-132 ；Chaves, Μ.M.和Oliveira, Μ.M.(2004) J.Exp.Bot.55:2365-2384 ；Shinozaki, K.等(2003) Curr.0pin.Plant Biol.6:410-417 ;Yamaguchi_Shinozaki, K.和 Shinozaki, K.(2005) Trends PlantSc1.10:88-94),但是植物如何感受、传导干旱胁迫信号和其耐旱性的生物化学和分子机制仍然是生物学研究中面临的一个主要挑战。
[0004]早期非生物胁迫响应分子方面的研究主要借助差异和/或加减法分析(Bray，E.A.(1993)PIantPhysio1.103: 1035-1040 ；Shinozaki, K.和 Yamaguch1-Shinozaki,K.(1997)PlantPhysiol.115:327-334 ；Zhu, J.-K.等(1997) Crit.Rev.Plant Sc1.16:253-277 ；Thomashow, M.F.(1999)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mo 1.Biol.50:571-599);和其它的方法，如分离候选基因，分析胁迫条件下该基因的表达或活性产物，或进行特定胁迫条件下功能互补分析(Xiong, L.和Zhu, J.-K.(2001)PhysiologiaPlantaruml 12:152-166)。另外，用于鉴定和分离调控基因突变体的正向和反向遗传学研究为胁迫条件下基因表达的变化提供了证据(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)PhysiologiaPlantaruml12: 152-166)。
[0005]激活标签可以用于鉴定影响植物性状的基因，这一方法已经用于模式植物拟南芥的研究中(Weigel, D.等(2000)PlantPhysiol.122:1003-1013)。转录增强子序列的插入主要激活和/或提高邻近内源基因的表达，因此该方法可以用于分离具有重要农艺性状表型的基因，包括提高非生物胁迫如耐旱性的基因。
[0006]WRKY转录因子是植物中发现的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的转录调控因子，它能够与(T) (T)TGAC(C/T)序列(W-box)发生特异性作用，调节启动子中含w-box元件的调苄基因和/或功能基因的表达，从而参与植物的各种防卫反应，调节植物的生长发育。作为WRKY转录因子家族中的一员，水稻WRKY转录因子66 (0sWRKY66)也含有保守的WRKYGQR氨基酸序列。
[0007]发明概沭
[0008]本发明包括以下具体实施例:[0009]1.分离的多聚核苷酸包括(a)编码一个多肽的核酸序列，其中，该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列一致性至少为90% ； (b)序列表中SEQ ID NO:3所示的序列;(c)序列表中SEQ ID NO:4所示的序列；(d)与核酸序列(a)、(b)或(c)的全长核苷酸一致性大于等于85%的核酸序列；(e)上述核酸序列(a)、(b)、(C)或(d)的全长互补核酸序列，其中全长互补序列与核酸序列含有相同的核苷酸数目，并100%的互补；多肽包括序列表中的SEQ ID NO:5的氨基酸序列，核酸序列包括序列表中的SEQ ID NO:3和4的核苷酸序列。
[0010]2.重组DNA载体包括实例I中分离的多聚核苷酸，其与至少一个可操作的调控序列连接。
[0011]3.基因组中含有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体的植物，其中，所述多聚核苷酸编码WRKY66转录因子(WRKY66)多肽，通过本发明中所述的GAP参数测定，可知上述WRKY66多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性至少为85% ;所述植物与对照植物相比具有较高的耐旱性。
[0012]4.基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体的植物，其中，所述多聚核苷酸编码一个多肽，通过本发明中所述的GAP参数测定，可知其氨基酸序列与序列表中SEQ IDNO:5的氨基酸序列的一致性至少为85%;与对照植物相比，所述植物显示至少一个农艺性状的变化；可选的，在水分限制条件下，与对照植物相比，所述植物显示所述至少一个农艺性状的变化；所述农艺性状可以是籽粒产量或者生物量；所述的变化可以是增加。
[0013]5.上述实例3和4中所述的植物，可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜猜、棉花、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0014]6.上述实例3、4或5的植物种子，所述植物种子的基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，其中，所述的多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性至少为85%;所述种子长出的植物与对照植物相比，具有较高的耐旱性，或至少一个农艺性状的变化，或两者；所述至少一个农艺性状可以是籽粒产量、生物量或其组合；所述的变化可以是增加。
[0015]7.提高植物耐旱性的方法包括(a)使用与至少一个调控序列连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体转化植物再生细胞，其中，所述多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5氨基酸序列的一致性至少为85% ； (b)由步骤(a)的植物再生细胞再生基因组中含有构建的重组DNA载体的转基因植物；(c)获得由步骤(b)获得的再生植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因组中含有构建的重组DNA载体，且与野生型植物相比，所述子代植物具有较高的耐旱性。
[0016]8.提高植物耐旱性的方法还包括(a)将实例3、4或5的植物与另一植物杂交，生产子代种子；(b)收获并种植子代种子，生产下一个子代的植物；(c)将子代植物与该另一植物杂交，获得至少一个回交的子代种子；可选的，(d)多次重复步骤(b)和(C)，获得比该另一植物具有较高耐旱性的植物。
[0017] 9.评价植物耐旱性的方法包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，所述多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性至少为85% ;(b)获得转基因植株的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有构建的重组DNA载体；(c)与对照植物相比，评价子代植物的耐旱性。
[0018]10.确定植物中至少一个农艺性状变化的方法:(a)获得转基因植物，其基因组中含有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，其中，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性至少为85%; (b)获得转基因植物的子代植物，其中，子代植物基因组中含有构建的重组DNA载体:(c)与对照植物对比，确定子代植物是否具有所述的至少一个农艺性状的变化；可选的，步骤(c)包括在水分限制条件下确定转基因植物是否具有至少一个农艺性状的变化；所述的至少一个农艺性状可以是籽粒产量、生物量或者其组合；所述的变化可以是增加。
[0019]11.上述7-11所述的任一方法，其中，植物可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜猜、棉花、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
[0020]12.含有能够增强内源多聚核苷酸表达的重组转录激活子元件的水稻植株，其中，多聚核苷酸编码的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列一致性为90%。
[0021]13.提高田间种植水稻耐旱性的方法包括(a)在水稻中表达编码水稻WRKY转录因子的重组核酸；(b)在作物的生长季节，田间种植水稻，且水稻置于干旱条件下；和(C)提高水稻的耐旱性。
[0022]14.提高田间种植水稻的产量的方法包括(a)在水稻中表达编码WRKY转录因子的重组核酸；(b)在作物生长季节，田间种植水稻，且水稻植株遭受干旱胁迫；和(C)提高水稻的籽粒产量。
[0023]15.鉴定增加0sWR KY66多肽表达或活性的0sWRKY66等位基因的方法包括(a)进行T-DNA插入水稻突变体库的筛选；(b)鉴定一个或多个突变体，其显示增强的0sWRKY66多肽或者其同族体的表达或者活性；和(c)从突变体中鉴定0sWRKY66等位基因或者其同族体。
[0024]16.筛选0sWRKY66等位基因的方法包括(a)使用0sWRKY66的寡核苷酸引物序列测定从一个或者多个突变体中分离的一个或多个基因组DNA片段序列；(b)分析0sWRKY66基因的调控区或者编码区DNA序列的不同；和(c)确定0sWRKY66等位基因与植物耐旱性或杆粒广量提闻的关系。
[0025]17.基因组中含有提高0sWRKY66多肽表达的重组载体的水稻，其中，多肽序列包括序列表中SEQ ID NO:5的序列。
[0026]在其他具体实施例中，本发明主要揭示了与至少一个调控序列连接的本发明中分离的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，和含有该重组DNA载体的细胞、植物或种子；所述细胞可以是酵母、昆虫或植物细胞等真核细胞，也可以是细菌细胞等原核细胞。
[0027]附图和序列表的简要i兑明
[0028]下面的详细说明、附图和序列表有助于全面了解本发明。
[0029]图1.转基因水稻叶片中0sWRKY66基因表达水平的real-time PCR分析。因未检测到0sWRKY66基因在对照水稻(DP0005)中表达，故设DP0010.13水稻叶片中0sWRKY66基因表达水平为1.00，其他转基因事件中的0sWRKY66基因表达水平如图数字所示。
[0030]图2.海南省干旱试验期间实验地中水稻不同发育期的土壤含水量。
[0031]图3.过表达水稻0sWRKY66基因提高了拟南芥(AtDPOO 10_6、AtDPOOlO-1O和DP0010-13)的耐旱性。A.拟南芥中OsWRKY66基因的半定量PCR分析；B.复水第三天时拟南芥的存活率；C.复水第三天时拟南芥的生长状况。WT代表野生型Columbia，VC代表DP0009转化株。
[0032]表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列编号
[0033]表2.AHO1460水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析
[0034]表3.TO代CaMV35S Pro:0sffRKY66水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析
[0035]表4.T2代CaMV35S Pro:0sffRKY66水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析
[0036]表5.T2代CaMV35S Pro:0sffRKY66水稻株系在田间干旱胁迫后籽粒产量分析
[0037]表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列编号
[0038]
【权利要求】
1.分离的多聚核苷酸包括(a)序列表中SEQID NO:3所示的序列，(b)序列表中SEQID NO:4所示的序列，(c)编码如序列表中SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列多肽的核酸序列，(d)与核酸序列(a)、(b)或(C)的核苷酸序列一致性大于或等于85%的核酸序列，(e)编码与序列表中SEQ ID NO:5氨基酸序列一致性至少为85%多肽的核酸序列，(f)上述核酸序列(a)、(b)、(C)、(d)或(e)全长互补的核酸序列。
2.根据权利要求1，所述多肽的氨基酸序列包括序列表中SEQID NO:50
3.根据权利要求1,所述核苷酸序列包括序列表中SEQID NO:3。
4.根据权利要求1,所述核苷酸序列包括序列表中SEQID NO:4。
5.权利要求1中分离的核酸序列和至少一个调控序列构建的重组DNA载体。
6.含有重组DNA载体的植物或种子，其中，重组DNA载体包括权利要求1的多聚核苷酸，和与之相连的调控序列。
7.基因组中含有重组DNA载体的植物，其中，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸；根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的一致性至少为85% ;与对照植物相比，所述植物显示增强的耐旱性。
8.基因组中含有重组DNA载体的植物，其中，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸；根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5所示 氨基酸序列的一致性至少为90% ;与对照植物相比，所述植物显示增加的籽粒产量、生物量或两者。
9.根据权利要求7或8，与所述对照植物相比，在水分限制条件下，所述植物显示所述增加的籽粒产量、生物量或两者。
10.根据权利要求7或8，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
11.权利要求7或8植物收获的种子，其中，所述种子的基因组中含有重组DNA载体，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连多聚核苷酸；根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的一致性至少为90% ;与对照植物相比，由所述种子长出的植物显示至少一个增加的性状，如耐旱性、籽粒产量和生物量。
12.提高植物耐旱性的方法，其包括(a)将重组DNA载体转入植物再生细胞，其中，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的一致性至少为90%;(b)由步骤(a)的植物再生细胞再生转基因植物，其中转基因植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)获得步骤(b)转基因植物的子代植物，其中所述子代植物的基因组中含有重组DNA载体，与对照植物相比，所述子代植物显示增强的耐旱性。
13.改善植物耐旱性的方法，其包括(I)将权利要求7或8任意植物与另一个植物进行杂交，产生的子代种子；(b)收获和种植子代种子以获得至少一个子代植株；(c)将子代植物与另一个植物品种杂交，产生至少一个回交子代种子；可选的，(d)多次重复步骤(b)和(C)，产生比所选植物品种具有更高耐旱性植物。
14.评价植物耐旱性的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中含有重组DNA载体，所述的重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的一致性至少为90% ；(b)获得转基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)以不含有所述重组DNA载体的植物为对照，评价子代植物的耐旱性。
15.确定植物籽粒产量、生物量或两者变化的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中含有重组DNA载体，所述重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，根据GAP比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的一致性至少为90% ； (b)获得转基因植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)测定子代植物的籽粒产量和/或生物量，并将所述测定与对照植物的籽粒产量和/或生物量进行比较。
16.根据权利要求15的方法，转基因子代植物和对照植物的籽粒产量和/或生物量是在水分限制条件下测定的。
17.根据权利要求15或16的方法，与对照植物相比，转基因子代植物的所述籽粒产量和/或生物量增加了。
18.根据权利要求12-16的任一方法，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜猜、棉花、大麦、粟、甘鹿和柳枝稷。
19.含有能够增强内源多聚核苷酸表达的重组转录增强子的水稻，其中，多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO:5的氨基酸序列的一致性为90%。
20.提高田间种植水稻耐旱性的方法，其包括(a)在水稻中表达编码水稻WRKY转录因子的重组核酸；(b)在作物的生长季节，田间种植水稻，其中，并使水稻置于干旱条件下；和(C)提高水稻的耐旱性。
21.提高田间种植水稻的产量的方法，其包括(a)在水稻中表达编码WRKY转录因子的重组核酸；(b)在作物生长季节，田间种植水稻，其中水稻植株遭受干旱胁迫；和(C)提高水稻的籽粒产量。
22.鉴定提高OsWRKY66多肽表达或活性的OsWRKY66等位基因的方法，其包括(a)进行T-DNA插入水稻突变体库的筛选；(b)鉴定一个或多个突变体，其显示增强的OsWRKY66多肽或者其同族体的表达或者活性；和(c)从突变体中鉴定OsWRKY66等位基因或者其同族体。
23.筛选OsWRKY66等位基因的方法，包括(a)使用OsWRKY66的寡核苷酸引物序列测定从一个或者多个突变体中分离的一个或多个基因组DNA片段序列；(b)分析OsWRKY66基因的调控区或者编码区DNA序列的不同；和(c)确定OsWRKY66等位基因与植物耐旱性或籽粒广量提闻的关系。
24.基因组中含有提高OsWRKY66多肽表达的重组载体的水稻，其中，多肽序列包括序列表中SEQ ID NO:5的序列。
25.获得耐旱性提高的水稻植株的方法，包括获得转基因水稻植株，其与对照水稻相t匕，具有增加的OsWRKY66基因表达水平；并使转基因水稻植株在干旱条件下生长。
【文档编号】A01H5/00GK104004767SQ201310058304
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月25日 优先权日:2013年2月25日
【发明者】高阳, 刘军华, 吕贵华, 毛冠凡, 王昌贵, 王喜萍, 夏勉, 于昆 申请人:先锋海外公司, 北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司