细菌生物膜相关性鼻窦炎动物模型的造模方法
【专利摘要】本发明属于生物医学领域，涉及细菌生物膜相关性鼻窦炎模型的造模方法，本方法采用BBF阳性金黄色葡萄球菌临床菌株和动物模型，通过留置可吸收性明胶海绵，建立BBF相关性鼻窦炎疾病模型，通过扫描电镜检测，结果显示，动物模型黏膜表面存在细菌粘附后形成的具有三维立体结构的成熟细菌生物膜，证实BBF相关性鼻窦炎疾病模型建模成功。本方法具有如下特点：致病菌与人BBF相关性鼻窦炎中最常见致病菌相同；造模方法简单，可操作性强，不需要特殊手术器械；对正常结构和功能影响小；留置明胶海绵作为细菌增殖的载体，造模成功率高，结果稳定；获得的BBF相关性鼻窦炎疾病模型与人类相关疾病更为相似。
【专利说明】细菌生物膜相关性鼻窦炎动物模型的造模方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，涉及一种建立细菌生物膜相关性鼻窦炎动物疾病模型的造模方法。
【背景技术】
[0002]研究报道，细菌生物膜(bacterial biofilm,BBF)是细菌的一种保护性生长模式，由于BBF的特殊结构，抗生素对其内部的细菌不能起到有效的杀灭作用，同时使机体产生的抗体非但不能杀灭细菌，反而在BBF表面形成免疫复合物，导致炎性反应的持续存在。慢性鼻窦炎是耳鼻咽喉科常见疾病，其中约10%的患者始终无法获得理想的临床治疗效果，该部分患者通常被称为难治性鼻窦炎。有研究发现，难治性鼻窦炎患者鼻粘膜上细菌生物膜的阳性率达100%，鼻粘膜细胞和纤毛结构被严重破坏。因此，目前普遍认为BBF是影响难治性鼻窦炎治疗效果最主要的因素之一。如何针对鼻粘膜中的BBF进行有效的治疗是目前鼻科学领域亟待解决的难题。临床实践中，尚不能完全以患者为对象来研究疾病的发生机制及治疗效果，其不仅在时间和空间上存在局限性，而且在伦理学和方法上也受到限制，因此，借助于疾病模型，尤其是动物疾病模型，可以更方便、有效地认识人类疾病的发生发展规律、研究防治措施。通常，本领域认为较好的疾病模型应具有以下特点:与人类疾病具有相似性，重复性好，经济，易行。目前已有的两个BBF相关性鼻窦炎模型，均存在操作复杂，对动物鼻窦损伤较大等问题，故存在较大的改进空间。
[0003]2005年，Palmer等以新西兰大白兔为实验动物，通过上颌窦前壁开窗、封闭上颌窦口后植入铜绿假单胞菌的方法造模，用扫描电镜检测后发现在造模520天后的兔上颌窦黏膜中有细菌生物膜的存在。但目前研究发现，金黄色葡萄球菌才是鼻窦炎患者鼻粘膜中BBF的最常见致病菌并与鼻窦炎的难治性密切相关，因此对鼻粘膜中BBF治疗效果的评价应以金黄色葡萄球菌形成的BBF为目标。因此，利用铜绿假单胞菌获得的动物模型与人类BBF相关性鼻窦炎相比，致病菌存在较大差异，因此对于研究疾病的发生、发展及治疗效果均有较大影响。同时，在造模过程中，需要去除上颌窦前壁的大范围骨质以便于暴露和堵塞上颌窦口，对上颌窦正常的结构和功能影响较大，易于发生上颌窦骨壁和黏膜的坏死性炎症以及局部皮肤溃破、溢脓。2007年，Wormald等利用金黄色葡萄球菌建立了细菌生物膜相关的鼻窦炎动物模型，其中，以羊为实验动物，通过额窦内注射金黄色葡萄球菌并堵塞额窦口的方法造模，结果发现所有动物的额窦内均形成了 BBF。虽然这一模型的致病菌与人类BBF相关性鼻窦炎最常见的致病菌相同，结果较可靠，但仍存在以下缺陷:1，过程复杂，需要对动物进行全身麻醉和气管插管呼吸机辅助呼吸；2，操作难度大，需要在鼻内镜下切除羊的中鼻甲和前组筛窦；然后，通过额窦前壁钻孔注射荧光素，在鼻内镜下确认额窦口的位置并予以完全堵塞；3，以羊为模型动物价格昂贵且操作不便，不适于需要大样本量的科学研究。
[0004] 鉴于现有动物模型存在以上各种问题，本发明拟提供一种与人类BBF相关性鼻窦炎更为相似且经济易行，结果稳定可靠的疾病模型的造模方法。[0005]与本发明相关的现有技术有:
[0006][l]Perloff J R, Palmer J N.Evidence of bacterial biofilms in a rabbitmodel of sinusitis[J].Am J Rhinol, 2005, 19(I):1-6.[0007][2]Jervis-Bardy J, Foreman A, Field J, et al.1mpaired mucosal healingand infection associated with Staphylococcus aureus after endoscopic sinussurgery[J].Am J Rhinol Allergy,2009, 23(5):549-552.[0008][3]Singhal D, Foreman A, Jervis-Bardy J, et al.Staphylococcus aureusbiofilms:Nemesis of endoscopic sinus surgery[J].Laryngoscope, 2011, 121 (7):1578-1583.[0009][4]Ha K R, Psaltis A J, Tan L, et al.A sheep model for the study ofbiofilms in rhinosinusitis[J].Am J Rhinol, 2007, 21 (3):339-345.[0010][5] Christensen G D, Simpson W A, Younger J J, et al.Adherence ofcoaguIase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: aquantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices.[J].Journal of clinical microbiology,1985, 22(6):996-1006.
【发明内容】
[0011]本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种疾病模型的造模方法，具体涉及细菌生物膜相关性鼻窦炎模型的造模方法，尤其是与人类细菌生物膜(bacterialbiofilm,BBF)相 关性鼻窦炎更加类似且经济实用、结果稳定的BBF相关性鼻窦炎疾病模型的造模方法。
[0012]本发明方法采用BBF阳性金黄色葡萄球菌临床菌株和动物模型，通过留置可吸收性明胶海绵，建立BBF相关性鼻窦炎疾病模型，通过扫描电镜检测，结果显示，动物模型黏膜表面存在细菌粘附后形成的具有三维立体结构的成熟细菌生物膜，证实BBF相关性鼻窦炎疾病模型建模成功。
[0013]本发明中，通过结晶紫染色法筛选获得具有较强BBF形成能力的BBF阳性金黄色葡萄球菌临床菌株；
[0014]本发明中，所述的可吸收性明胶海绵购自金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，使用前压缩成直径1mm，长度约1.5cm的圆柱状。
[0015]本发明中，实验动物模型选自试验用新西兰大白兔，体重2_3Kg，雄雌不限，饲养条件:温度22°C ±4°C，饲喂全价颗粒饲料，饮常水。
[0016]具体而言，本发明得细菌生物膜相关性鼻窦炎模型的造模方法，其特征在于，其包括步骤:
[0017](I)筛选BBF阳性金黄色葡萄球菌:确定实验菌株其OD值=0.46 ；
[0018](2)造模:
[0019]常规处理实验动物模型后，留置明胶海绵，进行BBF阳性金黄色葡萄球菌临床菌株干预；
[0020](3 )检测离体和BBF:
[0021]制备扫描电镜标本，进行电镜扫描(放大倍数2000倍以上)。[0022]结果显示:造模4周时表现有动物鼻窦炎；CT显示造模侧上颌窦内可见软组织影充填；大体标本表现:造模侧上颌窦骨壁完整，上颌窦口及上颌窦内可见脓性分泌物积存；BBF检测结果:正常鼻窦黏膜:纤毛结构排列整齐，其中有少量粘液样物质，未见BBF结构；造丰吴后I周:鼻棄粘I吴表面被覆大量粘液样物质，未见BBF形成；造|吴后2周:粘液經样物质消失，可见BBF开始形成并分割包裹纤毛结构；造模后4周:黏膜表面大量纤毛倒伏、缺失，大量BBF粘附于黏膜表面；造模后8周:黏膜损伤情况与造模后4周基本相同，黏膜表面仍有大量BBF。
[0023]本发明的方法避免了现有技术的弊端，其方法简单易行，结果稳定可靠，采用临床耐药金葡菌菌株作为致病菌并避免鼻腔鼻窦的过度损伤，更为接近人类BBF相关性鼻窦炎，能为研究BBF相关性鼻窦炎的发病机制和治疗方法提供新的、更优化的动物模型。
[0024]本发明的细菌生物膜相关性鼻窦炎动物模型的造模方法优点是:
[0025]I)采用临床菌株作为致病菌，致病力更强，能提高造模成功率，同时更能反应BBF在人体内的发生 发展状况，用于治疗效果的评估也更为客观；
[0026]2)可操作性强:只需简单的实验操作即可完成造模，不需要特殊手术器械，麻醉方法简单，一个人即可完成；
[0027]3)造模过程中应用明胶海绵具有以下优点:质地疏松，易于压缩，吸水性强，置入窦腔后能够吸附较多的致病菌和培养，膨胀后能完全或部分堵塞鼻窦口，有效避免植入细菌的排出；同时，所吸附的培养液能为细菌增殖并形成BBF创造条件；而且，明胶海绵可液化吸收，随着治疗后炎症的消退，窦口可重新开放，也与人类鼻窦炎更为类似；
[0028]4)对鼻腔鼻窦正常结构和功能影响小:与以往模型相比，不需要为了完全堵塞鼻窦口而去除上颌窦前壁大部分骨质和黏膜或切除鼻腔结构，避免了坏死性炎症的发生，更接近自然鼻窦炎形成过程；
[0029]5)经济实用，后续研究便利:以新西兰大白兔为模型动物，背景资料完善，饲养条件简单，相对而言更为经济实用。同时，由于上颌窦体积较大，组织量多，能够为后续研究提供取材检测的便利；
[0030]6)本发明还发现该模型中细菌生物膜形成的动态过程，为研究BBF在鼻窦炎发病机制中的作用以及在不同阶段给予不同干预提供依据。
【专利附图】
【附图说明】:
[0031]图1显示切口位置及大小，分离上颌窦前壁骨膜。
[0032]图2显示上颌窦前壁钻孔位置及大小。
[0033]图3显示经小孔向上颌窦内留置明胶海绵。
[0034]图4显示经小孔向上颌窦内注入菌悬液后回复骨膜。
[0035]图5显示对位缝合骨膜。
[0036]图6显示造模后4周前鼻孔脓痂附着。
[0037]图7显示造模4周时鼻窦CT扫描结果，造模侧上颌窦内软组织密度影充填。
[0038]图8显示造模4周时沿鼻背中线、眶下缘及鼻底完整切除鼻腔外侧壁，显露整个上颌窦内侧壁，上颌窦口有脓性分泌物。
[0039]图9显示造模4周时自上颌窦口底部向前剪开，上颌窦内脓性分泌物积存。[0040]图10显示正常鼻窦黏膜扫描电镜检测结果，黏膜上皮结构完整，纤毛结构排列整齐，其中有少量粘液样物质。
[0041]图11显示造模I周时鼻窦黏膜扫描电镜检测结果，可见黏膜表面被显著增加的粘液样物质覆盖，表面可见散在细菌粘附，未见BBF形成。
[0042]图12显示造模2周时鼻窦黏膜扫描电镜检测结果，正常纤毛及粘液毯样结构消失，纤毛被颗BBF分割、包裹呈球状或束带状，但尚可分辨出见少量残存纤毛结构。
[0043]图13显示造模4周时鼻窦黏膜扫描电镜检测结果，黏膜上皮裸露，纤毛结构大量脱失、倒伏，大量BBF样结构存在。
[0044]图14显示造模8周时鼻窦黏膜扫描电镜检测结果，纤毛结构大量脱失、倒伏，黏膜上皮裸露，大量BBF样结构存在，与造模后4周时相比无明显变化。
【具体实施方式】
[0045]实施例1
[0046]( I)筛选BBF阳性金黄色葡萄球菌:
[0047]收集临床标本，常规方法分选鉴定出金黄色葡萄球菌，挑取单个菌落接种入含有0.5%葡萄糖的TSB培养液(TSBg)，37°C振荡过夜培养后用TSBg200倍稀释，加入聚苯乙烯材质的96孔板中，每孔200uL，37°C静置培养24h后用PBS洗去浮游菌，甲醇固定15分钟，吸出甲醇后空气干燥30min，加入1%结晶紫溶液200uL，染色15分钟后PBS彻底冲洗未结合的结晶紫染液，晾干后每孔加入95%乙醇200uL，在摇床上室温放置Ih后，酶标仪检测490nm处吸光度(0D值)。OD值≥0.12认为是BBF阳性菌株，OD值越大，形成BBF的能力越强)。在我们所筛选的菌株中，编号为006的菌株OD值最大(0D值=0.46)，被确定为实验菌株;
[0048](2)造模:
[0049]I)麻醉:肌肉注射氯胺酮(50mg/kg) +地西泮(5mg/kg)，鼻背部皮下注射1%利多卡因ImL ；
[0050]2)切口:沿鼻背中线垂直切开皮肤，切口长度约1cm，切口中点距离前鼻孔约
2.8cm，切开皮肤后沿中线向右侧剥离骨膜约0.5 - 0.8cm，暴露上颌窦前壁；
[0051]3)钻孔:在切口中点偏右侧约0.4cm处钻孔，直径约1mm，进入上颌窦；
[0052]4)留置明胶海绵:将明胶海绵修剪为3mmX 3mmX IOmm长条状,压缩为直径约Imm,长度为IOmm的圆柱状，经小孔塞入上颌窦内；
[0053]5)注射菌悬液:将过夜振荡培养的菌悬液用TSBg200倍稀释后，用ImL注射器取0.SmL经小孔缓慢注入上颌窦内，勿使菌悬液外溢；
[0054]6)缝合:用4个O的尼龙缝线分层对位缝合骨膜和皮肤；[0055]7)饲养:待动物苏醒后放回笼内，饲养温度22°C ±4°C，饲喂全价颗粒饲料，饮常水，食水不限；
[0056](3)取材和检测:
[0057]I)取材时间:分别于造模后1、2、4、8周取材；
[0058]2)取材方法:10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，鼻背部皮下注射1%利多卡因l-ι.5mL，沿鼻背中线纵形切开皮肤及骨膜，上至两侧内眦连线，下至鼻尖，并向右侧剥离皮肤及骨膜，暴露整个上颌窦前外侧壁。沿鼻背中线、眶下缘及鼻底完整切除鼻腔外侧壁，自上颌窦口底部向前剪开，充分暴露上颌窦内粘膜，剥离上颌窦内粘膜；
[0059]3) BBF的检测:将取下的粘膜用生理盐水彻底冲洗后，按照下面的方法进行扫描电镜标本的制备:2.5%戊二醛2h，PBS漂洗3次(每次15min)，1%锇酸2h，PBS漂洗3次(每次15min),梯度酒精脱水(50%，70%, 90%, 100%X 3，每次15min)，100%醋酸异戊酯置换3次(每次15min)，临界点干燥，喷金，电镜扫描(放大倍数2000倍以上)；
[0060](4)结果:
[0061]I)动物鼻窦炎表现:造模4周时造模侧前鼻孔可见脓痂附着(如图6所示)，
[0062]2) CT表现:造模4周时造模侧上颌窦内可见软组织影充填(如图7所示)，
[0063]3)大体标本表现:造模4周时造模侧上颌窦骨壁完整，上颌窦口及上颌窦内可见脓性分泌物积存(如图8，9所示)。
[0064]4) BBF检测结果:
[0065]正常鼻窦黏膜:纤毛结构排列整齐，其中有少量粘液样物质，未见BBF结构(如图10所示)；
[0066]造模后I周:鼻窦粘膜表面被覆大量粘液样物质，未见BBF形成(如图11所示)；
[0067]造模后2周:粘液毯样 物质消失，可见BBF开始形成并分割包裹纤毛结构(如图12所示)；
[0068]造模后4周:黏膜表面大量纤毛倒伏、缺失，大量BBF粘附于黏膜表面(如图13所示)；
[0069]造模后8周:黏膜损伤情况与造模后4周基本相同，黏膜表面仍有大量BBF。(如图14 所)。
[0070]实验结果表明，本发明留置可吸收性明胶海绵并进行BBF阳性金黄色葡萄球菌干预，建立得BBF相关性鼻窦炎动物疾病模型的方法避免了目前一些造模方法的弊端，其方法简单易行，结果稳定可靠，采用临床耐药金葡菌菌株作为致病菌并避免鼻腔鼻窦的过度损伤，更为接近人类BBF相关性鼻窦炎，为研究BBF相关性鼻窦炎的发病机制和治疗方法提供了一种新的、更优化的动物模型。
【权利要求】
1.一种细菌生物膜相关性鼻窦炎模型的造模方法，其特征在于，其包括步骤: (1)筛选BBF阳性金黄色葡萄球菌:确定实验菌株其OD值=0.46 ； (2)造丰旲: 常规处理实验动物模型后，留置明胶海绵，进行BBF阳性金黄色葡萄球菌临床菌株干预； (3)检测离体和BBF: 制备扫描电镜标本，进行电镜扫描(放大倍数2000倍以上)。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的BBF阳性金黄色葡萄球菌通过结晶紫染色法筛选获得，其通过下述方法: 收集临床标本，常规方法分选鉴定金黄色葡萄球菌，挑取单个菌落接种入含有0.5%葡萄糖的TSB培养液，37°C振荡过夜培养后用TSBg稀释，加入聚苯乙烯材质的96孔板中，每孔200uL，37°C静置培养24h后用PBS洗去浮游菌，甲醇固定15分钟，吸出甲醇后空气干燥30min,加入1%结晶紫溶液200uL，染色15分钟后PBS冲洗未结合的结晶紫染液，晾干后每孔加入95%乙醇200uL，室温放置Ih后，酶标仪检测490nm处吸光度(0D值)。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的BBF阳性金黄色葡萄球菌为较强BBF形成能力的金黄色葡萄球菌。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可吸收性明胶海绵使用前压缩成直径Imm,长度约1.5cm的圆柱状。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)进行BBF阳性金黄色葡萄球菌临床菌株干预的菌悬液是用TSBg200倍稀释后的过夜振荡培养菌悬液。
【文档编号】A01K67/027GK104012471SQ201310064405
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2013年2月28日
【发明者】贾明辉, 赵霞, 陈仲春 申请人:复旦大学附属华山医院